Name: HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 학습하세요 hu-NSG 인간화 마우스 모델을 이용한 HIV 복제 및 잠복 연구 방법을. CD34+ 조혈줄기세포 간내주입으로 HIV 감염 및 항레트로바이러스 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회 [J.J.R. R01AI29329, R01AI42552 및 R01HL07470 번호 부여] 건강의 국가 학회 [부여 번호 희망 통합 유전체학의 도시를 지원 하기 위해 P30CA033572의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다 분석 약 학 및 분석 Cytometry 코어]. NIH 에이즈 연구 및 참조 시 약 프로그램, 사단의 에이즈, NIAID, NIH를 통해 얻은 다음 시 약: 에이즈 발 바이러스.

모든 동물 보호 및 절차 프로토콜 검토 및 승인 하 여 시의 희망 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 개최 (닥터 존으로 시, IACUC #12034)이이 연구의 책임자에 의해 수행 되었습니다. 인간 태아 간 조직 비영리 단체, 연방 및 주 규정에 따라 고급 생명 자원 (Alameda, CA)에서 얻은 했다. 공급 업체 자체 기관 검토 위원회 (IRB) 및 인간 주제 보호 요구 사항을 준수. 인간의 PBMCs 나이, 인종, 성별, 또는 민족성에 관한 아무 식별과 시의 희망 혈액 기증자 센터에서 (듀 래 이트, 캘리포니아), 익명 건강 한 기증자 로부터 폐기 말 초 혈액 표본 으로부터 격리 됩니다. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. 일반 무 균 연습
<ol><li>지정 된 층 류 캐비닛에 조직 배양 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>조직 문화 매체와 무 균 조건 하에서 보충을 유지 하 고 사용 하는 0.22 μ m 여과 단위 이전을 사용 하 여 필터링.</li>
	<li>무 균 튜브에 준비 된 인간의 HSCs를 보존 하 고 주입까지 얼음에 계속.</li>
	<li>심각한 면역 결핍의 결과로 NSG 마우스를 aseptically으로 처리 합니다. 일회용 수술 복, 헤어 캡, 얼굴 마스크, 신발 커버, 그리고 오염을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다. 실험 전후 벤치 표면, 방사선 홀더, 및 염소 기반으로 산화물 sterilant (예를 들어, Clidox)와 마 취 유도 챔버를 청소.</li>
	<li>복고풍 궤도 건조 한 눈을 방지 하기 위해 출혈 후 석유 기반 눈 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>포함 하는 항생제를 변경 복고풍 궤도 출혈 때문에 감염을 방지 하기 위해 다이어트.</li>
</ol>2. 처리 에이즈 바이러스 감염 된 설치류와 바이러스를 포함 하는 혈액/조직 샘플
주의: HIV는 클래스 3 인간의 병원 체; 처리 규칙 정확 하 게 따라야 합니다.
<ol><li>지정 된 BSL2에서 HIV 바이러스 포함 된 샘플 처리 + 3 실험실 공간. 운송 시 보조 컨테이너에 안전 하 게 바이러스를 포함 하는 시 약을 잠금. 10% 표 백제와 소 프로 파 놀 운송 전에 철저 하 게 닦아 하 여 모든 컨테이너의 외부 표면 소독.</li>
	<li>2-3 레이어 유해 쓰레기 봉투의 지정된 폐기물 용기에 모든 바이러스 포함 된 폐기물을 유지. 폐기물 처리, 이전 아낌없이 요오드/ethoxylated nonylphenol 솔루션 (예: Wescodyne)와 고압 폐기물을 살포 하 여 소독.</li>
	<li>개인 보호 장비 착용: 머리 모자, 얼굴 커버, 안티 스플래시 얼굴 방패, 신발 커버, 일회용 수술 가운, 및 더블 레이어 장갑.</li>
	<li>극단주의 함께 감염 된 설치류를 처리 합니다. 마우스 (단계 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3, 그리고 8.1-8.2) 취하는 동안 주사 및 혈액 컬렉션을 수행 합니다.</li>
</ol>3입니다. 조 혈 줄기 세포의 분리
<ol><li>조직 소화 콜라/dispase 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>100 mg/mL의 농도에서 재고 솔루션을 만들기 위해 콜라/dispase 분말을 녹이 고-20 ° c.에서 150 µ L aliquots에서 콜라/dispase 재고 솔루션을 저장</li>
		<li>콜라 솔루션 작업에 대 한 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 15 mL와 콜라/dispase 재고의 150 µ L를 희석. 참고: 콜라/dispase 조직 소화의 최종 농도 1 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 면도날, 태아 간 조직 (16-24 주 임신) 작은 조각 (약 2-3 m m3 크기에서)으로 실 온에서 30 분 동안 콜라/dispase 솔루션 (1 mg/mL)와 소화 다음 잘라. 모든 조직 조각을 완전히 잠긴 소화 솔루션의 볼륨을 조정 합니다. 주사기 플런저의 백 엔드를 사용 하 여 부드럽게 소화를 촉진 하기 위하여 조직 샘플을.</li>
	<li>단일 세포 현 탁 액을 얻으려고 70 µ m 메 마른 나일론 메쉬 필터를 통해 소화 혼합물을 전달 합니다.</li>
	<li>CD34 + HSCs 제조 업체의 지시 당 맥 시스템을 사용 하 여에 대 한 풍부.</li>
	<li>Hemacytometer28 를 사용 하 여 풍부한 CD34 + HSCs의 가능한 비율을 계산 하 고 신생아 NSG 쥐로 intrahepatic 주입을 진행 합니다.</li>
	<li>고정 미디어 (예를 들어, CryoStor CS2)에 남은 농축된 CD34 + HSCs 고 셀 액체 질소 탱크에 보존 한다. 앞으로 사용에 따라 주입 전에 해 동된 CD34 + HSCs의 가능한 비율 재검표. 사용 하 여 미디어를 동결, 해 동 후 생존 80 ~ 90% 사이입니다.</li>
</ol>4. intrahepatic 인간 CD34 + HSCs 신생아 NSG 쥐에 주입
참고: 신생아 NSG 쥐 출생에서 2-3 일은이 절차에 대 한 가장 적합 한 그들은 완전히 면역 시스템 장애는 충분히 젊은 동안 반 치명적인 복용량에 방사선을 견딜 만큼 강한. 아니 마 취는 HSC 주입을 위해 필요 합니다.
<ol><li>살 균 원형 방사선 장에 신생아 NSG 쥐 (일반적으로 5-10 쥐, 두 성 전부)의 전체 쓰레기를 놓고 Caesium 137 방사선 소스에서 200-250 cGy 감마-레이 방사선의 총계 복용량에 노출 합니다. 상당한 체중 감소 또는 죽음 NSG 마우스 고용량의 방사선에 노출 되는 때 관찰 될 수 있는 범위 내에서, 그 방사선 복용량은 확인 합니다. 12 참고: 방사선은 건강 위험, 방사선에 대 한 개인 보호가지고 야 한다.</li>
	<li>방사선 조사, 다음 5 x 105 와 각 신생아 NSG 마우스 주사 가능한 인간 CD34 + HSCs 주사기/바늘 설치 (그림 1)를 사용 하 여. 직접 간으로 세포를 주사.</li>
</ol>5. engraftment 유효성 검사 역 궤도 출혈 및 교류 Cytometry 분석을 통해
<ol><li>10-12 주 게시물-HSC 주입에 쥐 isoflurane/산소 흡입 기구를 사용 하 여 anesthetize. 4-5%에서 isoflurane 비율을 유지 하기 위해 산소 흐름을 조정 합니다. 마 취 개별 마우스에 따라 3-5 분 걸립니다. 제대로 마 취 쥐 천천히 깊은 호흡 패턴, 그리고 발가락 곤란 자극에 아무 반응을 보여줍니다.</li>
	<li>28역 궤도 샘플링 통해 각 마우스에서 말 초 혈액의 50-100 µ L를 수집 합니다. 응고를 방지 하기 위해 K2EDTA 또는 heparinized 혈액 컬렉션 튜브에 혈액 샘플을 저장 합니다. 참고: 혈액 컬렉션 튜브 마우스 PBMCs 흐름 cytometry 분석에 대 한 전체 혈액 으로부터 격리 될 수 있도록 항 응 혈 약 코팅을 할 필요가 있습니다. EDTA는 PCR 등 qRT-PCR; 효소 반응을 억제 하기 위해 알려져 있다 따라서, 다운스트림 효소 반응이 필요한 경우 heparinized 혈액 수집 장치를 사용 합니다.</li>
	<li>2000 x g에서 혈액 샘플 혈 펠 렛을 4 ° C에서 20 분간 원심.<ol>
<li>전송 플라즈마 supernatants 새로운 microcentrifuge 튜브 스토어-80 ° C에서 원심 분리 후 사이토카인 분석 필요한 경우.</li>
		<li>붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 (테이블의 재료)를 사용 하 여 10 분 동안 실내 온도에 혈액 세포 펠 렛 내에서 적혈구 (RBCs)를 lyse. 참고: 경우 플라즈마 샘플 필요 하지 않습니다, 직접 원심 분리 하지 않고 세포 솔루션 전체 혈액 lyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C에서 5 분간 300 x g에서 RBC 세포의 용 해 후 나머지 혈액 세포를 작은 상쾌한 발음 DPBS, 4 ° C에서 5 분간 300 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 0.01 %BSA 셀 펠 릿을 세척 하 고 상쾌한 발음. 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>100 µ L 1 x 차단의 칵테일 (제조 법에 대 한표 3 ) 4 ° c.에 20 분 동안 블록 셀</li>
	<li>차단, 후 직접 2 µ L/106 세포의 농도에 세포 현 탁 액에 각 항 체 솔루션을 추가 하 고 30 분간 4 ° C에서 품 어. Engraftment 유효성 검사에 대 한 항 체는: 안티 인간 CD45 (백혈구, RRID: AB_2732068), 안티-인간의 CD3 (T-세포, RRID: AB_396896), 안티-인간의 CD4 (헬퍼 T-세포, RRID: AB_397037), 반대로 인간 CD8 (세포 독성 T-세포, RRID: AB_2722501), 반대로 인간의 CD14 (monocytes, RRID: AB_10373536)와 반대로 인간 CD19 (B 세포, RRID: AB_10373382). 제안 된 흐름 패널 참조 하십시오 표 4 및 테이블의 자료 카탈로그 번호, RRIDs 및 로트 번호에 대 한. 참고: 마우스 표면 표식으로 반대로 인간 항 체의 일반적인 바인딩을 제거 솔루션을 차단에 얼룩이 지는 항 체, 여러 표면 표식으로 인간 사이의 상 동을 공유 하 고 마우스.</li>
	<li>건강 한 기증자 로부터 인간의 PBMCs 격리 준비 단일 스테인드 흐름 cytometry 보상 컨트롤 사용 하 여 순화 된 인간의 PBMCs. 또는, 보상29컨트롤로 형광 표시 스피어를 사용.</li>
	<li>교류 cytometer를 사용 하 여 주변 혈액 샘플을 분석 하 고 계량 인간의 CD45 + 세포, 인간의 CD3 + 세포, 인간의 CD14 + 셀, 및 인간의 CD19 + 총 주변 혈액 세포에서 세포의 비율.<ol>
<li>다운스트림 HIV 감염 및 대기 시간 연구, CD4 + T 세포와 CD8 + CD3 + 세포 내 T 세포의 비율을 계산 합니다. 참고: 일반적으로, 1.5와 2.5 사이 CD4:CD8 비율 HIV 감염30전에 관찰 된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. hu-NSG 마우스와 플라즈마 바이러스 부하 qRT-PCR를 사용 하 여 HIV 감염의 분석
<ol><li>건강 한 기증자 로부터 인간의 PBMCs에 에이즈 발 바이러스 주식 전파, 감염 된 후 10 일에서 수확 및 적정 p24를 사용 하 여 ELISA 키트31.</li>
	<li>HIV 감염에 대 한 말 초 혈액에서 20% 이상의 선택 hu-NSG 쥐 인간 CD45 + 세포.</li>
	<li>Hu-NSG 쥐 isoflurane/산소 흡입 장치 (단계 5.1)를 사용 하 여 anesthetize</li>
	<li>동물 마 취를 확인 한 후 200의 복용량에 에이즈 발 바이러스를 주사 복 경로 통해 마우스 당 p24의 ng. 참고: 바늘 매우 신중, 바늘, 재사용 및 지정 된 날카로운 컨테이너로 사용 후 즉시 삭제 하지 할. 바이러스 관리 후 주입의 영역을 치료.</li>
	<li>3 주 후 감염, hu NSG 마우스 anesthetize와 레트로 궤도 통해 주변 혈액 수집 모 세관 튜브 및 컬렉션 튜브 heparinized 사용 하 여 출혈.</li>
	<li>별도 플라즈마 고 20 분 동안 2000 x g에서 원심 분리 하 여 혈액 세포.</li>
	<li>Rbc 블록을 lyse 고 흐름 cytometry 분석 (섹션 5.3-5.8)에 대 한 항 체와 나머지 혈 얼룩. 참고: 흐름 cytometry 분석 CD4:CD8 비율을 비교 하는 감염 전후에 집중 해야 한다. CD4 + 세포 수에서 상당한 감소 예상는 CD4로 항 바이러스 항목에 대 한 공동 수용 체 역할.</li>
	<li>HIV 바이러스 분석을 사용 하 여 플라즈마 샘플 qRT-PCR를 사용 하 여 로드 합니다. 바이러스 성 RNA 미니 키트를 사용 하 여 플라즈마 샘플에서 바이러스 성 RNA를 분리. QRT-PCR 에이즈-1 LTR 특정 한 뇌관으로 수행 하 고 프로브 세트 ( 표 5에서 시퀀스 정보), 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여.</li>
</ol>7. 카트 및 유효성 검사의 바이러스 억제 (선택 사항) 구강 관리
참고:이 단계는 급성 감염 단계 HIV 예 후, 바이러스학, 또는 감염 관련 이상 관련 조사에 대 한 선택 사항입니다. 에이즈에 감염 된 hu-NSG의 카트 치료 카트를 받는 인간의 환자 중 HIV 대기 시간을 정리 하는 데 사용 됩니다. Hu-NSG 성공적으로 HIV에 감염 된 쥐 4 주에 대 한 장바구니를 주어진 다. 카트 처방 (TDF, 300 m g/캡슐), 테 노 포 (공정 위, 200 m g/캡슐), emtricitabine 및 raltegravir (RAL; 400 m g/캡슐)으로 구성 됩니다. Hu-NSG 에이즈에 감염 된 쥐를 치료를 위한 손수레의 복용량 바디 표면 영역 (표 1, 방정식 1, 표 2)32에 따라 조정 됩니다.
<ol><li>각 약물 치료, 물병, 각 장에 마우스와 마우스 당 4 mL의 평균 일일 물 섭취 량의 볼륨을 고려의 1 주 동안 각 감 금 소에 필요한 금액을 계산 합니다. 참고:이 단계에서 핵심 포인트는 각 마우스 내 4 mL 식용 수의 매일 복용량의 취득 하는 것을 보장 하기 위해.</li>
	<li>정밀한 분말으로 조정된 복용량으로 모든 3 개의 약품을 갈기 고 청량된 물 (예: Medidrop Suralose)에 가루 혼합물을 분해. 갓 녹아 카트 칵테일 청량된 물에 제공 매주 물 병 변경. 참고: 마약 분말 수 있습니다 하지 즉시 해산, 병 들고 케이지를 반환 하기 전에 균질 정지를 달성 하기 위해 적극적으로 악수.</li>
	<li>복고풍 궤도 출혈 매 2 주를 통해 주변 혈액 샘플을 수집 하 고 모두 cytometry (섹션 5.3-5.8)와 qRT-PCR (단면도 6.6)를 사용 하 여 플라즈마 바이러스 부하를 사용 하 여 CD4:CD8 비율 분석. 참고: 일반적으로 4 주 후 치료, 플라즈마 바이러스 부하 감소를 검출 한계 아래 고 전형적인 CD4:CD8 비율 복원 됩니다.</li>
</ol>8. 카트 (옵션) 철수 시 바이러스 반동의 유효성 검사
참고:이 단계는 대기 저수지의 직접 증거를 제공 하는 카트 철수 시 바이러스 리바운드 대기 모델 유효성 검사에서 중요 한. 그것은 또한 HIV 리바운드 억제제에 치료 조사에 대 한 제어 실험으로 것이 좋습니다.
<ol><li>플라즈마 주변 혈액 샘플에서 바이러스 부하 검출 한계 같습니다 CD4:CD8 비율 1.5와 2.5 사이 범위에 복원 후 카트 철수 계획.</li>
	<li>복고풍 궤도 출혈 카트 철수 후 매 2 주를 통해 주변 혈액 샘플을 수집 합니다. CD4:CD8 비율 (섹션 5.3-5.8) 뿐만 아니라 플라즈마 바이러스 부하 (단면도 6.6)에서 변화를 밀접 하 게 모니터링 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 충돌의 관심을 공개.

인간의 세포/조직으로 engrafted immunocompromised 쥐 인간과 같은 생리 적 특성을 제시 하 고 인간의 특정 질병에 관한 병 리, 병 태 생리학, 및 면역학 연구에 대 한 엄청난 가치. 가운데 immunocompromised 쥐, 끄 덕의 여러 변종. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) 모델은 가장 타고 난과 적응 면역,3,12,19 신호 연기나 마우스 관련 cytokine의 그것의 부족 때문에 immunodeficient . 따라서, NSG 쥐 인간 화 과정에서 광범위 하 게 이용 되었습니다 그리고 그것을 잘 설립 murine 주변 혈액, 림프에 다시 인간 세포 및 골수성 조직, 그리고 쥐 전시 인간의 면역 응답을 적절 한 전염 성 stimulations HIV<sup...

인간의 질병에 대 한 적절 한 동물 모델을 확립 치료법을 찾는 열쇠입니다, 때문에 적절 한 동물 모델 오래 되었습니다 추구 있고 시간이 지나면서 개선. Immunocompromised murine 모델의 여러 변종 인간 세포 및 조직의 engraftment 및 인간 답게 된 기능1,2의 후속 실행을 허용 하는 개발 되었습니다. 이러한 인간 답게 마우스 모델은 인간의 특정 질병3,,45의 수사를 위해 중요 합니다.
후천성 면역 결핍 증후군 (에이즈) 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염에서 발생 한 예입니다. 인간 답게 마우스 모델의 설립 이전에 윤리적, 기술적 한계 국한 HIV/에이즈 비 인간 영장류3전 임상 동물 연구. 그러나, 높은 비용 및 이러한 동물에 대 한 전문적인된 치료에 대 한 요구 사항을 일반적인 학술 설정에서 HIV/에이즈 연구를 방해. 에이즈는 주로 인간의 CD4 + T 세포를 감염 및 개발 및 B 세포, 대 식 세포, 수지상 세포6; 등 다른 인간의 면역 세포의 면역 반응에 미치는 영향 따라서, 기능 인간의 면역 시스템으로 이식 하는 작은 동물 모델 높은 수요에 있습니다.
돌파구는 1988 년에 때 Prkdcscid 돌연변이와 CB17-scid 쥐 개발 되었고 인간의 면역 시스템1의 성공적인 engraftment를 보여 왔다. 결함이 T-와 B-세포 기능에 Prkdcscid 돌연변이 결과 쥐에 연기나 적응 면역 체계, 단 세포 (PBMCs), 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 혈액의 인간의 주변 engraftment 하도록 하 고 태아의 조 혈 조직7,8. 그럼에도 불구 하 고, engraftment의 저급은 자주 관찰이 모델; 가능한 원인은 자연 킬러 (NK)를 통해 변조 1) 잔여 타고 난 면역 활동-세포와 마우스 T와 B 세포 (시키는)5의 2) 단계의 개발. 비만 아닌 당뇨병 (끄 덕)의 후속 개발-scid 마우스 모델 달성 극적인 다운 레 귤 레이 션의 NK 세포 활동; 따라서, 그것은 높은 수준과 인간의 면역 체계 구성 요소9의 더 많은 지속 가능한 engraftment를 지원할 수 있습니다. 더 억제 또는 마우스 모델 베어링 잘림 또는 interleukin-2 수용 체 γ-체인 (Il2rg)의 총 녹아웃 (끄 덕)에서 타고 난 면제의 발전을 방해-scid 배경 설치 되었다. Il2rg, 일컬어 일반적인 cytokine 수용 체 γ-체인, 다양 한 cytokine 수용 체10,11,,1213의 필수적인 구성 요소입니다. 끄 덕 같은 변종. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG)와 NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug (노 그)에서 마우스 cytokine 신호의 강력한 중단 및 NK 세포 개발의 완전 한 절제를 제시 적응 면역14,,1516의 심한 장애 뿐만 아니라.
3 인간 답게 마우스 모델 베어링 scid 돌연변이 및 Il2rg 녹아웃 자주 HIV/에이즈 연구에서 채택 된다: 샌드위치 (골/간/Thymus) 모델, PBL (주변 혈액 백혈구) 모델 및 SRC (SCID 다시 채우기 셀) 모델 3.는 샌드위치 모델 인간 태아 간, 태아 간 HSCs3,,1718의 정 맥 주사와 함께 마우스 신장 캡슐 아래 thymus의 외과 이식 통해 만들어집니다. 높은 engraftment 효능, 모든 계보에서 인간 조 혈 모 세포의 개발 및 강한 인간의 면역 시스템;의 설립을 제공 하는 샌드위치 마우스 모델 또한, T-세포는 인간의 헌 thymus에서 교육 하 고 면역 응답 HLA 제한4,5,,1719전시. 그러나, 수술 절차에 대 한 요구 사항은 샌드위치 모델의 주요 단점은 남아 있습니다. PBL 마우스 모델 인간의 주변 림프 세포를 정 맥 주사에 의해 설정 됩니다. PBL 모델 편의 제공 하 고 성공적인 T-셀 engraftment를 생성 하지만 응용 프로그램은 부족 한 B-세포 및 골수성 세포 engraftment, 낮은 engraftment 수준 전체, 그리고 심한 이식-비교-호스트 질병 (GVHD)3의 발병으로 인해 제한 ,20. SRC 마우스 모델 신생아 또는 젊은 성인 SCID 쥐로 인간의 HSCs의 주사를 통해 설정 됩니다. 그것은 (말 초 혈액 CD45 비율으로 평가) 25% 이상 평균 engraftment 효율성을 전시 하 고 주입된 HSCs의 다중 계보 개발 및 타고 난 인간의 면역 시스템의 퇴 고를 지원 합니다. 그러나, SRC 모델의 한계가 이다 T 세포 응답 인간의 HLA 제한14,21대신 H2 제한 마우스입니다.
SRC 마우스 모델 연구를 위한 전 임상 HIV/에이즈 작은 동물, 인간의 면역 체계와 성공적인 조 혈 개발의 일관성 engraftment exemplified 손쉬운 고 안정적인 모델을 간주 됩니다. 우리는 이전 보고 NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) 마우스 모델의 설립 하 고 HIV 복제 및 대기 연구22,,2324그것의 응용 프로그램을 설명. 이 hu NSG 마우스 모델 골 유도, HIV에 감염 자화 율의 높은 수준 및 HIV 감염의 병 인 재현 부를 전시 한다. 또한, hu NSG 마우스 모델 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 적절 하 게 응답 하 고 카트 철수, 확인 된 에이즈 대기 저수지25,26의 설립에 따라 플라즈마 바이러스 리바운드를이 ,27. 이 HIV 대기 저수지는 인간의 휴식 하는 CD4 + T 세포 감염 및 카트 취급 hu NSG 쥐에서 분리에 의해 유도 된 복제 유능한 HIV 바이러스 전 비보 의 생산에 의해 더 입증 된다.
여기, 우리 대기 시간 개발에 대 한 HIV 감염 및 카트 치료에 관련 된 절차를 포함 하 여 신생아 NSG 쥐에서 hu NSG 마우스 모델의 설립에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 새로운 HIV 에이즈 바이러스학, 대기 시간 및 치료에 관한 동물 연구에 접근을 제공 하는이 프로토콜을 기대 합니다.

<table><tbody><tr><td>CD34 MicroBead Kit, human</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07932</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>실험용 쥐 대신 육종가를 주문</td></tr>하다 <tr><td>IsoFlo</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-806-3204</td><td>동물 시설을 통한 주문, 제한 품목</td></tr><tr><td>Clidox 소독제</td><td>Fisher Sicentific</td><td>NC9189926</td><td></td></tr><tr><td>Wescodyne</td><td>Fisher Sicentific</td><td>19-818-419</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 80508 주사기/바늘</td><td>Hamilton</td><td>80508</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>채혈관(K2EDTA)</td><td>BD Bioscience</td><td>367843</td><td></td></tr><tr><td>채혈관(Heparin)</td><td>BD Bioscience</td><td>365965</td><td></td></tr><tr><td>모세관 (Heparinized)</td><td>Fisher Sicentific</td><td>22-362574</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 버퍼</td><td>시그마 Aldrich</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td><td>Thermofisher</td><td>4444434</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>IgG from human serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506-100MG</td><td></td></tr><tr><td>IgG from mouse serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5381-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BB515 마우스 Anti-Human CD45 (클론 HI30)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td></tr><tr><td>PE-Cy7 마우스 Anti-Human CD3 (클론 SK7)</td><td>BD Biosciences</td><td>557851</td><td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td></tr><tr><td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (클론 RPA-T4)</td><td>BD Biosciences</td><td>558116</td><td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td></tr><tr><td>BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (클론 RPA-T8)</td><td>BD Biosciences</td><td>563795</td><td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td></tr><tr><td>APC-Alexa Fluor 750 마우스 Anti-Human CD14 (TuK4)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1427</td><td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td></tr><tr><td>PE 마우스 Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1904</td><td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td></tr></tbody></table>

hiv 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/scid/il2rγnull (hu-nsg) 마우스 모델

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

윤리 규정 및 인간의 병 리, 면역학, 및 치료 개발 연구를 위한 기술 과제 수요에 작은 동물 모델에 놓여 있다. 인 간에 게 가까운 유전과 행동 닮았다, 마우스 같은 작은 동물 인간 질병 모델을 통해 인간과 같은 증상 및 응답은 지 수 수에 대 한 좋은 후보 있습니다. 또한, 마우스 유전 배경 다양 한 요구에 맞게 변경할 수 있습니다. 끄 덕/SCID/IL2rγnull (NSG) 마우스는 가장 널리 사용 되 immunocompromised 마우스 긴장; 인간 조 혈 줄기 세포 및 인간 조직 및 기능 인간의 면역 시스템의 후속 개발 engraftment를 수 있습니다. 이 예 지 및 HIV/에이즈 등 인간의 특정 질병의 병 태 생리학을 이해 하 고 치료에 대 한 검색을 원조에 중요 한 이정표 이다. 여기, 우리는 조 혈 줄기 세포 이식 방사선 조절 신생아 NSG 마우스에 의해 humanized NSG 마우스 모델 (hu-NSG)를 생성 하기 위한 상세한 프로토콜을 보고 합니다. Hu-NSG 마우스 모델 이식된 인간 줄기 세포의 hiv-1 바이러스 감염 민감성 멀티 리니지 개발을 보여줍니다. 그것은 또한 주요 생물 학적 특성 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 대 한 응답을.

교류 cytometry 분석은 자주 고립된 HSCs의 순도 확인, 평가 하 engraftment 수준, 프로필 면역 반응에 바이러스 성 감염, 고 카트 효능을 조사 수행 됩니다. 일반적인 항 체 패널 포함 4-6 개인 붙일 레이블된 항 체; 따라서, 다양 한 필터와 여러 레이저 교류 cytometer은 정확한 결과 달성 하기 위한 중요 합니다.
초기 engraftment 유효성 검사에 대 한 인간의 CD45 + 세포 수 범위는 20%에서 80%, 그리고 인간 백혈구의 하위 흐름-줄거리 점 (그림 2)에 개별 인구로 표시 되어야 합니다. CD4:CD8의 비율 유지 1.5와 2.5 사이 건강 한 개인; 중요 한 CD4 + 소모는 일반적으로 바이러스 성 감염, 저조한 CD4:CD8;의 더 낮은 비율에 따라 관찰 그리...

이 프로토콜 신생아 NSG 쥐 방사선 조절로 인간 조 혈 줄기 세포의 intrahepatic 주입을 통해 humanized 쥐 (hu-NSG)를 설정 하는 방법을 제공 합니다. Hu NSG 마우스 HIV 감염 및 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 취약 하 고 HIV 복제 및 대기 시간 조사에 대 한 적합 한 병 태 생리 모델 역할.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

이 문제는 HIV/AIDS 연구의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 이러한 분자 메커니즘과 HIV 감염의 예후와 같은, 그리고 어떻게 어디서 대기 시간 저수지가 설립. 이 기술의 장점은 비침습적이며, HIV 감염에 취약하고 cART에 수용되는 이식된 인간 줄기 세포를 통해 다중 계보 발달을 치료해야 하는 hu-NSG 마우스를 확립했다는 것입니다. 소화, 인간, 태아, 간 조직, 슬러리 샘플을 멸균, 70 마이크로미터, 나일론, 메쉬 스트레이너를 통해 단일 세포 현탁액을 획득하고 제조업체의 지시에 따라 자기 활성화 셀 정렬에 의해 CD34+HSC를 농축하는 것으로 시작합니다.카운트 후, 얼음에 신선한 DPBS에서 밀리리터 농도 당 두 번 - 10 - 더 - 일곱 번째 실행 가능한 세포에서 HSC를 다시 중단합니다. 다음으로 전체 신생아 인간 NOD/SCID/감마 또는 NSG 마우스 쓰레기를 멸균, 파이 모양의 조사 케이지에 넣고 세슘-137 방사선 소스에서 200~250센티미터의 감마선으로 동물을 치료합니다. 그런 다음 30 게이지 바늘이 장착 된 맞춤형 해밀턴 80508 50 마이크로 리터 주사기에 세포를로드하고 각 신생아 동물을 5 배에서 5 분의 10 - 5 번째 가능한 인간 CD34 +HSC 및 DPBS의 25 마이크로 리터로 간으로 직접 주입합니다.감염 후 10~12주, 각 마우스의 레트로 궤도, 말초, 혈액 샘플을 원심분리에 의한 스핀다운하고, 실험적으로 적절하다면 음수 80도 저장을 위해 플라즈마 초강을 미세원심분리관으로 이송한다. HSC 이식 유효성 검사를 위해 적혈구 용해 완충제 200 마이크로리터로 펠릿을 다시 중단하고 실온에서 10분 동안 1.5mm 미세센심분리기 튜브에서 세포 현탁액을 당깁니다. 그런 다음 세척당 DPBS에서 0.5 밀리리터의 신선, 0.01% 소 혈청 알부민 또는 BSA에 대한 원심분리에 의해 나머지 백혈구를 수집한다.두 번째 세척 후, 100 마이크로리터의 블로킹 칵테일을 섭씨 4도에서 20분 동안 차단한 다음, 1회에서 6분의 1의 세포 농도당 2 마이크로리터의 항체 에 대한 관심 있는 적절한 항체 칵테일라벨링으로 세포를 차단합니다. 섭씨 4도에서 30분 후, 신선한 DPBS+ BSA로 세포를 두 번 세척하고, 샘플당 인간 CD45+CD3+CD14+또는 CD19+세포의 비율을 정량화하기 위해 표준 프로토콜에 따라 세포측정을 유동하여 말초 혈액 샘플을 평가한다. 그런 다음 CD4+대 CD8+T 세포의 비율을 계산하고 표준, 정량적, 역전사, PCR 프로토콜에 따라 플라즈마 샘플에서 바이러스 부하를 평가합니다.HIV 감염의 효과를 평가하기 위해, 마취, 인간, NSG 마우스에 HIV 베일 바이러스를 전달하여 말초 혈액에 20% 이상의 인간 CD45+세포 집단을, 2주마다 레트로 궤도 출혈을 통해 혈액 샘플을 수집하고 CD4-c-c-1-CD-c.를 분석하여 CD4-c.로 의 혈중 바이러스 를 분석합니다. , 입증 된 바와 같이. 바이러스 억제 유효성 검사를 위해 감염된 인간 NSG 동물에게 신선하고, 결합적, 항레트로바이러스 요법 또는 cART를 4주 동안 매주 가당물로 공급하고, 2주마다 레트로 궤도 출혈을 통해 혈액 샘플을 수집하고 CD4 대 CD8 비율과 플라즈마 바이러스 부하를 모두 분석하였다. 혈장 바이러스 부하가 검출 한계 이하이고 CD4-cd8 비율이 1.5에서 2.5 사이에서 회복될 때 바이러스 리바운드를 소싱하기 위해 cART 철수 후 2주마다 레트로 궤도 출혈을 통해 말초 혈액 샘플을 수집하고 시연된 바와 같이 샘플을 평가한다.초기 이식 유효성 검사 동안 인간 CD45+셀 수는 20~80%의 범위여야 하며, 인간 백혈구의 하위 집합은 유동 세포 측정 분석에 의한 이산 집단으로 나타나야 합니다. CD4+대 CD8+세포의 비율은 건강한 개인에서 1.5와 2.5 사이 남아 있으며 중요한 CD4+T 세포 고갈은 일반적으로 바이러스 감염시 관찰됩니다. 특히, 건강한 비율은 cART 처리에 응하여 회복됩니다.혈장 바이러스 하중의 검출은 감염 및 cART 처방의 과정 전반에 걸쳐 정량적 RT PCR에 의해 플롯및 바이러스 전달 및 항 바이러스 치료의 효율을 평가하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 HIV/AIDS 바이러스학 연구 및 치료 개발에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암, 당뇨병 및 자가 면역 질환과 같은 인간 질환과 관련된 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. hu-NSG 마우스 모형 발달은 면역학과 종양학에 있는 연구원이 HIV 만성 감염 및 대기 시간 저수지를 표적으로 하는 기계론 및 치료 연구 결과, 인간에 있는 새로운 기능 장애 그리고 병리를 탐구하는 도로를 포장했습니다.

humanized-nodscidil2rnull-hu-nsg-mouse-model-for-hiv-replication

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인간화 마우스를 사용하여 종양 특정 T 세포의 생성 및 특성이 여기에 설명되어 있습니다. 인간 thymic 조직 및 유전자 변형 인간의 조혈 줄기 세포는 면역 저하 된 쥐에 이식되어 있습니다. 안티 종양 면역 반응의 생체 시험에서 허용하는 엔지니어링 인간의 면역 시스템의 reconstitution에이 발생합니다.

줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

이 비디오는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 마우스 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 인간 태아 흉선 조직과 조작된 조혈모세포(HSC)는 면역이 심하게 저하된 쥐의 신장 캡슐에 이식됩니다. HIV에 대항하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 HSC는 흉선 조직과의 공동 국소화를 촉진하는 젤라틴 단백질 혼합물에 혼합되어 있습니다. 시술 후 HSC는 다양한 인간 면역 세포로 분화되어 HIV에 대한 기능적 인간 면역 체계를 가진 인간화 마우스 모델을 개발합니다.

HIV에 대한 공학적 면역을 가진 인간화 마우스 모델 구축

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

이 프로토콜은 인간화 마우스에서 HIV-1 RNA 복제를 성공적으로 억제하는 경구 조합 항레트로바이러스 약물을 전달하는 새로운 방법을 설명합니다.

HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 경구 조합 항레트로바이러스 치료

이 프로토콜은 EcoHIV 감염과 Tmem119-EGFP 마우스의 조합이 HIV 관련 신경인지 장애의 설치류 모델에서 미세아교세포 변형 및 바이러스 저장소를 조사하기 위한 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 방법을 설명합니다.

Microglia-Manipulated Transgenic Mice에서 EcoHIV 감염 세포 식별

HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

학습하세요 hu-NSG 인간화 마우스 모델을 이용한 HIV 복제 및 잠복 연구 방법을. CD34+ 조혈줄기세포 간내주입으로 HIV 감염 및 항레트로바이러스 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγ^null (hu-NSG) 마우스 모델

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