단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

이 방법은 PCSK9의 단백질 분해 기능에 어떤 약물 또는 유전적 변화가 영향을 미치는지와 같은 PCSK9 생화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 본질적으로 저주파 생화학적 사건을 빠르고 증폭 가능한 판독으로 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 죽상경화성 심장 질환으로 확장되는데, 이는 PCSK9 단백질 분해 기능이 혈청 콜레스테롤 수치에 대한 궁극적인 효과를 위해 필요하기 때문입니다.

이 방법은 PCSK9 자체에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 본질적으로 단백질 분해 활성이 낮은 다른 프로테아제와 같은 다른 생화학 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 각 HEK293 T 세포에서 배지를 흡인합니다. PBS로 세척하고 0.5%의 최소 용량의 트립신-EDTA로 치료합니다.

그리고 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양하여 모 플라스크에서 세포를 분리합니다. 10%FBS가 보충된 DMEM 2량을 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화합니다. 그런 다음 플라스크의 액체를 위아래로 여러 번 피펫팅하여 부착된 세포를 제거하고 세포를 멸균 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 작은 세포 분취를 제거합니다. 동일한 부피의 Trypan Blue로 염색하고 염색된 세포를 슬라이드로 옮기고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포를 회수하기 위해 500배 G로 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.

그 후, 배지를 흡인하고 세포와 배양 배지를 원하는 농도로 재구성합니다. 멀티채널 피펫과 멸균 트러프를 사용하여 각 웰에 있는 100마이크로미터의 셀을 흰색 96웰 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 세포를 24시간 동안 배양합니다.

그런 다음, positive control Plasmid, negative control Plasmid 및 Plasmid-free Buffer에 대해 각각 4개의 well을 포함하여 transfection을 위해 원하는 농도로 Plasmids 플레이트를 준비합니다. 먼저, Master Mix of Dilyte Transfection Reagent와 Master Mix of DNA Pre-complexation Reagent를 준비합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫과 멸균 트로프를 사용하여 16.8마이크로리터의 Diluted DNA Pre-complexation Reagent를 Deep Well Plate의 각 웰에 분취합니다.

그런 다음 멀티 채널 피펫을 사용하여 마스터 플레이트에서 Deep Well Plate의 각 웰로 각 플라스미드 3.2 마이크로 리터를 이송합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 Diluted Lipid Transfection Reagent Mixture를 플레이트의 각 웰에 추가하고 완전히 혼합합니다. 플레이트를 덮고 실온에서 10-15분 동안 방치하여 지질 DNA 복합체를 형성합니다.

그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 96 Well 플레이트의 293 T 세포에서 배지를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 매체를 10%FBS가 보충된 95마이크로리터의 DMEM으로 교체합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 Transfection Mixture를 각각의 적절한 웰에 첨가합니다.

다음으로, 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 세포를 24시간 동안 배양합니다. 먼저, PBS의 아스코르브산나트륨 3몰, 증류수 중 염화몰 5몰, PBS의 BSA 밀리리터당 10밀리그램, 산성화된 메탄올의 콜렌테라진 2밀리몰을 포함하여 이중 강도 Coelenterazine 분석 시약을 만드는 데 필요한 원액을 준비합니다. 다음으로, Luciferase 판독을 위해 충분한 Coelenterazine 시약을 준비합니다.

배지의 세포에 대해 각각 별도의 시약이 있습니다. 그런 다음 Coelenterazine에 대해 예상되는 모든 시약을 혼합합니다. 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통해 혼합물을 여과합니다.

그런 다음 여과 후 Coelenterazine을 첨가하십시오. transfection 후 24시간 후에 incubator에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 50마이크로리터의 컨디셔닝 배지를 새로운 흰색 96웰 플레이트로 옮깁니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 Double-Strength Non-lytic Coelenterazine 시약을 Conditioned Medium만 함유된 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5-10분 동안 어두운 곳에서 접시를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 Double-Strength Lytic Coelenterazine 시약을 세포가 포함된 플레이트에 추가하여 이 단계를 반복합니다.

배양 후, Plate Reader에서 Medium-only plate와 Cell-containing plate의 발광을 측정합니다. 마지막으로 플레이트를 버리고 추가 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다. Luciferase Reagent를 Medium-only Plate와 Cell-containing Plate와 함께 동일한 시간 동안 배양하는 것이 중요한데, 이는 이러한 플레이트에 대한 데이터를 직접 비교하기 때문입니다.

이 프로토콜에서, 기질 부위 P6 - P6 Prime에서 PCSK9 프로테아제의 Cleavage Sequence Specificity는 Luciferase Assay에 의해 평가되었습니다. P6 및 P4 위치에서 P1 Prime까지의 Cleavage Sequence의 변화는 Protease에 의해 잘 견디지 못합니다. 그러나 P5 및 P2 Prime부터 P6 Prime까지의 위치는 변경이 더 유연합니다.

또한 결과는 최적의 분할 시퀀스가 와일드 유형 시퀀스와 본질적으로 동일하다는 것을 보여줍니다. 클리닉에서 발견된 잘못 전송된 싹둑싹둑 라이브러리의 상대적인 분열 활성(Cleavage Activity)을 야생형 프로테아제(Protease)와 비교했습니다. 평가된 84개의 가위(snips) 중 절반 이상이 야생형 프로테아제(Protease)에 비해 활성에서 유의한 변화를 보였으며, 이는 프로테아제 활성의 변화가 임상 모집단에서 자주 관찰된다는 것을 시사합니다.

이 절차에 따라 간세포의 유세포 분석 또는 콜레스테롤 흡수 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 LDL 수용체에 대한 PCSK9의 영향에 대한 PCSK9 단백질 분해 능력의 변화를 평가할 수 있습니다.