Name: 단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 PCSK9 단백질 분해 활성을 평가하는 고처리량 루시퍼라제 분석법을 HEK293 T 세포에서 사용하는 방법입니다. 이 기술은 저빈도 생화학적 사건을 신속하게 측정하여 콜레스테롤 대사 및 동맥경화성 심장질환 연구에 활용됩니다.

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저자 감사 NHLBI/NIH (K08 HL124068 및 LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF 임상 및 변환 과학 연구소 촉매 프로그램 (UL1 TR000004), UCSF 학술 상원 헬 맨 재단에서 관대 한 자금 지원을 한 길 르 앗 과학 연구 학술 상, (모두 존 S. Chorba) 화는 심장 혈관 상 고 (Adri M. Galvan Kevan M. Shokat)를 하 워드 휴즈 의학 연구소.

1. 사이트 감독 Mutagenesis Protease 벡터의
<ol><li>디자인과 표준 사이트 감독 mutagenesis 프로토콜12의 수정을 사용 하 여 관심사의 돌연변이 설치 하려면 사용자 정의 합성 oligonucleotides 주문. 표준 desalted 뇌관 (추가 정화) 없이 완벽 하 게 사용할 수 있습니다. 참고: 뇌관 디자인에 대 한 일반적인 접근 표 1의 중 합 효소에 녹는 온도 (Tm) 계산기를 사용 하 여 표시 된 대로 부분적으로 겹치는 뇌관을 만드는 작업이 포함 됩니다.</li>
	<li>설정 중 합 효소 연쇄 반응 (PCRs) 사이트 감독 mutagenesis 얼음, 표 2에 표시 된 대로.</li>
	<li>표 3에 표시 된 대로 PCRs를 주기.</li>
	<li>1 %agarose 젤에 각 PCR의 2-5 µ L을 실행 하 고 성공적인 증폭을 확인 하는 제품을 시각화. 참고: 성공적인 PCR (~7.8 kB) 서식 파일의 대략적인 크기 표시에서 단일, 저명한 DNA 밴드를 표시 합니다.</li>
	<li>DpnI의 (25 µ L 반응) 당 0.5 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>화학적으로 유능한 병원 성 대장균으로 반응의 2 µ L를 변환. 참고: 급성장 E. 콜라이 긴장 부 화 시간을 줄일 것입니다 하지만 어떤 복제 긴장 든 지 받아들일 수 있을 것입니다.</li>
	<li>포함 하는 50-100 µ g/mL carbenicillin Luria Bertani (파운드) agar에 변형 판 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
	<li>2-4 식민지는 소규모 문화 (50-100 µ g/mL carbenicillin와 파운드 매체의 2-5 mL)에서 성장 하는 것을 선택 합니다. 혼 탁 한 때까지 220 rpm에서 37 ° C에서 문화를 품 어.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 플라스 미드 DNA (i.e, "miniprep") 정화 키트를 사용 하 여 셀에서 DNA 플라스 미드를 분리. Microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 eluted DNA의 농도 계량.</li>
	<li>플라스 미드는 생어 시퀀싱 서비스 (코어 또는 상업 시설)를 사용 하 여 광범위 하 게 DNA 순서. 서비스의 사양에 따라 DNA 샘플을 준비 합니다. 사전 연속 반응에서 성공적으로 사용 하는 뇌관은 표 4에 설명 되어 있습니다. 참고: 전체 플라스 미드 PCR 증폭으로 인해 전체 PCSK9 코딩 영역의 시퀀싱이 좋습니다 각 돌연변이 대 한.</li>
</ol>2. 높은 처리량 Luciferase 기반 베이스 분석 결과
<ol><li>
셀 도금 (0 일)
	<ol>
<li>실험에 대 한 낮은 통로 HEK293T 셀을 사용 하 고 Dulbecco의에 문화 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 독수리 매체 (DMEM) 수정. 수행 모든 luciferase 활동 시험 준비까지 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 작업 셀. 우물과 transfections를 테스트 하는 각 조건에 대 한 3 중에 수행 하 게 될 예상 실험에 필요한 접시의 수를 견적 한다.</li>
		<li></li><li> </li><li></li><li><ol><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li> <ol><li><li><li><li> </li></ol></li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li><ol><li></ol></li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li> </li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg"> </li><li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg"> </li><li><li><li><li></li></ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
<li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li>
<li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li>
<li>Pettersen, D., Fjellström, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li>
<li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li>
<li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li>
<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91(2008).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li>
<li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9+%28PCSK9%29+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li>
<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

위에서 설명한 실험 절차 단일 매출 protease PCSK9의 본질적으로 저조를 극복 하 고 강력한 방식으로 분해 기능을 평가 하는 방법을 제시. 분석 결과의 주요 개념 효소 증폭된 판독 단일 매출 이벤트 변환에 의존 합니다. 분석 결과의 강점 등는 상대적으로 짧은 시간 프레임 luciferase 기자는 확장성 높은 처리량 접근의 사용의 용이성. 또한, 분석 결과 네이티브, 셀룰러 맥락에서 베이스를 평가합니다. 또한,이 분석 결과와 임상적으로 확인 된 Snp 평가할 수 있다 어떤 인간이 나 환자 조직;에 대 한 필요 없이 PCSK9 베이스에 그들의 효과 대 한 관심사의 유전자 형의 기술만 필요 하다.
분석 결과의 몇 가지 기술적인 제한이 존재 한다. 분석 결과 평가 셀 내에 베이스, 비록 벡터의 overexpression을 또한 필요 합니다. 분석 결과 HEK293T 셀 라인의 과도 transfection를 해야 하므로 transfection 효율 내장 잘-투-잘 다양성을 추가...

LDL 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤)을 제기 하 고 동맥 경 화성 심장 질환1,2운전 PCSK9 성능 저하, LDL 수용 체 (LDL-R)를 대상. 치료 대상 PCSK9 튼튼하게 LDL-콜레스테롤을 낮출 하 고 적극적인 지질을 낮추는 치료 스타 틴3,4에 추가 하는 경우에 환자에 대 한 심장 혈관 결과 개선. 그러나 현재 승인 된 치료 항 체 기반 접근에 제한 된다, 그리고 비용 효율성5,6의 부족에서 고통. 이 문제를 해결 하려면 비용이 많이 드는 치료 대안, 환자 더 큰 혜택을 얻을 것을 식별 하는 수단 또는 둘 다 필요 합니다.
작은 분자 접근은 세포내 PCSK9 대상, 관리의 향상 된 경로 제공 고 비용, 그들에 게이 지역7에 있는 "성배"를 줄일 수 있습니다. 그러나, PCSK9 작은 분자 약물 어려운 입증 했다. 한 효소로 PCSK9의 분해 기능을 대상으로 자체 베이스 PCSK9 성숙8 의 속도 제한 단계가 고 LDL-R9에 그것의 최대 효과 위해 필요한 매력적인 전략 이다. 그러나 현재까지,,이 전략 하지 않은 성공 가능성이 PCSK9의 고유한 생화학 때문: PCSK9 앞만 자체10, 수행 하는 단일-매출 반응, 그리고 자기 분열 후 PCSK9 prodomain와 활성 사이트에 바인딩된는 자동-억제제11, 어떤 더 프로 테아 제 활동의 판독을 방지.
이 문서는 높은 처리량 패션8PCSK9 분해 기능을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 사이트 지시 된 mutagenesis, 통해 조사자는 베이스, PCSK9 성숙의 속도 제한 단계에 효과 대 한 그들을 평가 하기 위해 병원에서 발견 하는 Snp 코딩의 효과 조사 하이 분석 결과 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 궁극적으로 LDL-r PCSK9의 프레 젠 테이 션을 방해 (및 변조 PCSK9의 콜레스테롤 효과) 것으로 예상 되는 PCSK9 베이스의 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 스크린의 설계에 도움이 될 것입니다. . 마지막으로,이 프로토콜은 i) 특정 기질-효소 쌍을 찾을 수 있습니다, 고 기판에 대 한 ii)는 적당 한 세포내 앵커를 설정할 수 있습니다 본질적으로 낮은 활동, 다른 프로 테아 제를 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PCR Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>For PCR</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start</td><td>New England Biolabs</td><td>M0493L</td><td>고충실도 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드 용액 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTPs (for PCR)</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Authors</td><td>n/a</td> 저자 <td></td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A에서 입수 가능</td><td>저자</td><td>해당 없음</td> 작성자 <td>:</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>For DNA gels</td></tr><tr><td>E-Gel Imager System with Blue Light Base ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>4466612</td><td>For imaging DNA gel SYBR</td></tr><tr><td>Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>For DNA gel</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>DNA 젤 실행 버퍼</td></tr><tr><td>빙하</td> 아세트산 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>DNA 젤 실행 버퍼</td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산 용액</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, DNA 젤 실행 버퍼</td></tr><tr><td>1kb DNA 사다리</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D010</td><td>DNA 사다리</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>100 &micro를 가진 LB 한천 판; g/mL 카르베니실린</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>LB-Carb 플레이트</td></tr><tr><td>One Shot Mach1 T 파지 저항성 화학적 역량 E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C862003</td><td>화학적 역량 세포</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>카르베니실린</td><td>골드 생명공학</td><td>C-103-5</td><td>선택적 항생제</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 플라스미드 미니 키트 I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>DNA 정제 Miniprep 키트</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 분광광도머</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>분광광도계</td></tr><tr><td>293T 세포</td><td>American Tissue Culture Collection (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T 세포</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>11995065 DMEM, 포유류 세포 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Sera</td><td>Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Trypsin, 세포 해리용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>자동 세포 계수</td>기</tr><tr><td>백작 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>세포 계수용 슬라이드</td></tr><tr><td>CELLSTAR 조직 배양 플레이트, 흰색, 흰색 바닥, 뚜껑 포함</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655083</td><td>흰색, 흰색 바닥 96웰 플레이트</td></tr><tr><td>TempPlate 논스커트 96웰 PCR 플레이트, 천연</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596</td><td>마스터 플라스미드 플레이트용 96웰 플레이트</td></tr><tr><td>Nunc 2.0mL DeepWell 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>278743</td><td>96 웰 딥 웰 플레이트</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>지질 형질주입 시약, Lf3K</td></tr><tr><td>P3000 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>DNA 사전 복합화 시약, Lf3K</td></tr><tr><td>OptiMEM I Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Reduced serum medium 제공 트랜스펙션</td></tr><tr><td>(+)-나트륨 L-아스코르브산염</td><td>밀리포어 시그마</td><td>A4034</td><td>소듐 아스코르브산</td></tr>염 <tr><td>나트륨 밀리</td><td>포어 시그마</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>알부민, 소 혈청, 분획 V, 저중금속</td><td>밀리포어 시그마</td><td>12659</td><td>BSA</td></tr><tr><td>메탄올 (HPLC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>염산</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>농축 HCl</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Gold Biotechnology</td><td>CZ2.5</td><td>Luciferase 기판</td></tr><tr><td>주사기 필터, 멸균</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>멸균 필터, PVDF, 0.22 &마이크로; m pore</td></tr><tr><td>Pipet-Lite 멀티채널 피펫 L12-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013810</td><td>멀티채널 피</td></tr>펫 <tr><td>Pipet-Lite 멀티채널 피펫 L12-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013808</td><td>멀티채널 피펫</td></tr><tr><td>Pipet-Lite 멀티피펫 L12-10XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013807</td><td>멀티채널 피펫</td></tr><tr><td>시약 reservoir</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>시약</td></tr><tr><td>용 Trough원심분리기 튜브, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td>15 mL 튜브</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL 튜브</td></tr><tr><td>Spark Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>N/a</td><td>Plate Reader</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2016 for Mac</td><td>스프레드시트 소프트웨어</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>v7</td><td>Scientific 데이터 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

단일-매출 protease pcsk9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 luciferase 분석 결과

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9) 형식이 단일 매출 protease 혈 청 저밀도 지 단백질 (LDL) 수치를 조절 하 고, 따라서, 심장 혈관 질병. PCSK9 베이스에 필요 하지만 전체 콜레스테롤 효과, 분해 기능 평가 도전 이다: PCSK9 자체 쪼개만 알려져, 겪 습만 단일 회전율, 및 베이스, 후에 그것의 기질을 유지 자동-억제제로 그것의 활성 사이트입니다. 여기에 제시 된 방법을 이러한 문제를 극복 하는 분석 결과 설명 합니다. 분석 결과 셀 컨텍스트 및 링크 쉽게 읽을 수 있습니다 밖으로 바른된 매체에 은닉 luciferase 활동에 성공적인 분열 intermolecular 베이스에 집중 한다. 통해 순차적 단계 mutagenesis, 과도 transfection 그리고 luciferase 판독, 분석 결과 높은 처리량 방법에서 유전적 또는 분자 섭 동의 조건 하에서 PCSK9 베이스를 프로브 수 있습니다. 이 시스템은 임상 발견된 missense 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp), 또한 PCSK9 베이스의 작은 분자 억제제의 심사에 관해서는 모두 생 화 학적 평가 대 한 적합 합니다.

높은 처리량 베이스 분석 결과 세 가지 주요 과제를 극복에 의존 합니다. 첫째, 단일-매출 PCSK9 효소는 억제 부족 PCSK9 효소의 본질적으로 낮은 출력을 극복 하기 위해 prodomain 사용 됩니다, 분열 순서는 prodomain의 꼬리에서 분 비14수 luciferase에 연결. 둘째, 접으면 protease에 대 한 필요를 만족 시키기 위해 복잡 한 그것의 억제와 함께 prodomain, 2 개의 polypeptides는 coexpressed 트랜스에서 셀룰러 컨텍스트15,16를 통해 bicistronic 벡터에. 셋째,에서 차별화 하는 쪼개진 uncleaved 기판, PCSK9 효소가 잘립니다 C678 바인딩과 그물 (응급실)에서 복잡 한 PCSK9 출구를 방지 하지만 분해 기능...

이 프로토콜 셀룰러 맥락에서 본질적으로 낮은 활동, 단일 매출 효소의 분해 활동을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 특히,이 메서드는 PCSK9, 그 분해 활동은 그것의 궁극적인 노인 기능에 필요한 지질 대사의 핵심 드라이버의 분해 활동을 평가에 적용 됩니다.

단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

이 방법은 PCSK9의 단백질 분해 기능에 어떤 약물 또는 유전적 변화가 영향을 미치는지와 같은 PCSK9 생화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 본질적으로 저주파 생화학적 사건을 빠르고 증폭 가능한 판독으로 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 죽상경화성 심장 질환으로 확장되는데, 이는 PCSK9 단백질 분해 기능이 혈청 콜레스테롤 수치에 대한 궁극적인 효과를 위해 필요하기 때문입니다.이 방법은 PCSK9 자체에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 본질적으로 단백질 분해 활성이 낮은 다른 프로테아제와 같은 다른 생화학 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 각 HEK293 T 세포에서 배지를 흡인합니다. PBS로 세척하고 0.5%의 최소 용량의 트립신-EDTA로 치료합니다.그리고 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양하여 모 플라스크에서 세포를 분리합니다. 10%FBS가 보충된 DMEM 2량을 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화합니다. 그런 다음 플라스크의 액체를 위아래로 여러 번 피펫팅하여 부착된 세포를 제거하고 세포를 멸균 튜브로 옮깁니다.다음으로, 작은 세포 분취를 제거합니다. 동일한 부피의 Trypan Blue로 염색하고 염색된 세포를 슬라이드로 옮기고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포를 회수하기 위해 500배 G로 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.그 후, 배지를 흡인하고 세포와 배양 배지를 원하는 농도로 재구성합니다. 멀티채널 피펫과 멸균 트러프를 사용하여 각 웰에 있는 100마이크로미터의 셀을 흰색 96웰 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 세포를 24시간 동안 배양합니다.그런 다음, positive control Plasmid, negative control Plasmid 및 Plasmid-free Buffer에 대해 각각 4개의 well을 포함하여 transfection을 위해 원하는 농도로 Plasmids 플레이트를 준비합니다. 먼저, Master Mix of Dilyte Transfection Reagent와 Master Mix of DNA Pre-complexation Reagent를 준비합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫과 멸균 트로프를 사용하여 16.8마이크로리터의 Diluted DNA Pre-complexation Reagent를 Deep Well Plate의 각 웰에 분취합니다.그런

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 루시페라아제 태그가 지정된 단백질을 정량화하는 데 사용되는 루시페라아제 분석을 보여줍니다. 이 분석은 관심 단백질과 접합된 작은 단편과 결합하는 큰 단편으로 구성된 엔지니어링된 루시페라아제 효소를 사용합니다. 결합된 소단위체는 기질이 있을 때 발광 신호를 방출하는 활성 효소를 형성합니다. 그런 다음 이 신호는 광도계를 사용하여 정량화됩니다.

Luciferase Assay: 엔지니어링된 Nanoluciferase 시스템 기반 바이오리포터를 사용하여 발광 신호를 측정하는 고처리량 분석

이 비디오는 형광 펩타이드를 사용하여 프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 프로테아제는 펩타이드의 절단 부위를 인식하여 절단하고 형광단에서 소광체를 분리하여 형광 방출을 가능하게 합니다. 형광 신호를 검출하고 분석하여 다양한 펩타이드 변이체의 분할 효율을 확인합니다.

프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석

이 비디오는 테트라사이클린 유도 시스템을 사용하여 유전자 변형 인간 세포에서 γ-secretase 활성을 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 테트라사이클린으로 APP 유전자 발현을 유도하고, 아밀로이드 β 펩타이드를 생성하고, 루시페라아제 생산을 활성화하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 루시퍼라제-기질 반응으로 인한 생물 발광을 측정하여 γ-secretase 활성을 반영합니다.

인간 세포에서 γ-Secretase 활성을 측정하기 위한 Luciferase 분석

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

우리는 성공적으로 두 기판 전용 γ-secretase 분석 생성 된 있다. 여기에 제시 된 두 세포 기반 분석은 계량 반딧불 luciferase 기자 들의 출력을 통해 γ-secretase 효소 활동 설계 되었습니다.

Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.

Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

여기, 우리 N 터미널 hexahistidine/맥 아당 의무적인 단백질 및 형광 단백질 융합 재조합 기판 니켈 nitrilotriacetic의 표면에 부착 된 최근에 개발한 효소 분석 플랫폼의 상세한 절차를 제시 산 자기 agarose 구슬입니다. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 분석 결과 샘플의 후속에 젤 분석 또한 제공 됩니다.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

당사는 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 모니터링하기 위해 split-luciferase reassembly assay를 확립했습니다. 이 분석을 사용하여 화학적 처리 조건에서 HEK293T 세포에서 이러한 세포 간 결합의 수준을 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다.

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

배우세요 PCSK9 단백질 분해 활성을 평가하는 고처리량 루시퍼라제 분석법을 HEK293 T 세포에서 사용하는 방법입니다. 이 기술은 저빈도 생화학적 사건을 신속하게 측정하여 콜레스테롤 대사 및 동맥경화성 심장질환 연구에 활용됩니다.

단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

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