Name: Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 학습하세요 P1 파지 전도를 이용한 대장균 유전자 결실 돌연변이 생성 방법. 항생제 내성 카세트를 활용하여 특정 유전자 기능을 연구하는 신뢰할 수 있는 유전공학 기법을 탐구합니다.

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케이오 컬렉션 긴장 국가 유관 프로젝트 (검, 일본)에서 가져온: 대장균. 그의 지속적인 지원에 감사 더크 맺고 (생물 과학 부, 오슬로 대학교) 하 고. 이 작품은 노르웨이 젊은 연구원 부여 249793 (잭 C. 레오)의 연구 위원회에 의해 투자 되었다.

1. 긴장 및 플라스 미드
<ol><li>
세균성 긴장
	<ol>
<li>E. 콜라이 긴장 BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7,20, BL21(DE3) 및 BL21ΔABCF21을 사용 합니다. 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
살 균 소
	<ol>
<li>P1비르 페이지를 사용 하 여 일반 변환에 대 한. 클로 프롬의 몇 방울과 액체 주식으로 페이지를 저장 (하십시오 단계 2.2 참조). 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플라스 미드
	<ol>
<li>다음 플라스 미드를 사용 하 여이 프로토콜에: pCP2022,23, pIBA2 YadA pEibD1024. 제어 플라스 미드로 pASK-IBA2 및 pET22b ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성장 조건
	<ol>
<li>전파는 lysogeny 국물 (파운드) 중간25 활기찬 동요 (180-200 rpm) 37 ° C 또는 BL21ΔABCF 및 pCP20를 포함 하는 긴장의 경우 30 ° C에 있는 박테리아.</li>
		<li>43 ° c.에 치료 하는 플라스 미드를 수행</li>
		<li>단단한 매체에 대 한 1 %agar (w/v)와 파운드를 보충.</li>
		<li>최고 천 대 한 0.7 %agar 10mm CaCl2 와 압력솥 매체 LB 보충. Electroporation26후 회복 위한 SOC 매체를 사용 합니다.</li>
		<li>항생제에 대 한 다음 농도 사용: 100 μ g/mL로 앰프와 칸에 대 한 25 μ g/mL</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 Lysate 살 균 소
<ol><li>
기증자 스트레인의 감염
	<ol>
<li>10 m m CaCl2 와 함께 선택적으로 칸을 보충 하는 파운드 매체의 5 mL에 기증자 스트레인 JW4197 성장 (25 µ g/mL) 600에서 광학 밀도를 ~ 1.0 nm (OD600). 분 광 광도 계를 사용 하 여 세600 값을 측정 합니다.</li>
		<li>LB 매체에는 기존 p 1 살 균 소 주식의 희석 시리즈를 만들기: 희석은 10-3 10-7을 권장.</li>
		<li>세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.</li>
		<li>37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate 준비
	<ol>
<li>다음 날 살 균 소 패의 세미 confluent 성장과 플레이트를 선택 합니다. 약 절반의 표면적 접시 반 confluent 접시에 분명 하다 (그림 3).</li>
		<li>접종 루프 또는 비슷한 도구를 사용 하 여 같은 접시에서 최고 천 층을 긁어과 원심 분리기 튜브에 최고 agar를 놓습니다. 증기 두건에서 파운드의 1-2 mL 및 클로 프롬 및 소용돌이 적극적으로 ~ 1 분 추가 클로 프롬에 대 한 튜브의 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>4000 g x 또는 더 작은 공의 천 및 세균성 세포에서 15 분 동안 튜브 원심</li>
		<li>신선한 microcentrifuge 튜브, 피하 펠 릿에서 어떤 파편 든 지 운반에 상쾌한을 이동 합니다. 클로 프롬의 2 방울을 추가 하 고 4-10 ° c.에 lysate 저장 증기 두건에서 클로 프롬을 추가 합니다. 마십시오 하지 고정 페이지 lysate로이 전염 성 입자 수의 뜻깊은 감소 귀 착될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate titer를 결정
	<ol>
<li>BW25113 LB 문화 OD600 ~ 1.0에 도달할 때까지 37 ° C에서 10 mM CaCl2 보충에서 성장.</li>
		<li>살 균 소 파운드 (예를 들어, 10-6– 10-9)에 lysate의 희석 시리즈 준비. 참고:은 희석을 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 위에서 피펫으로 샘플에 주의 해야 합니다.</li>
		<li>세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.</li>
		<li>37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
		<li>다음 날 플 라크 (세균성 매트에 명확한 지역) 각 접시의 수를 계산 하 고 다음 수식을 사용 하 lysate의 titer를 계산: <img alt="바이러스 역가식: 역가(pfu/mL) = 도금 계수 × Σ플라크/Σ희석." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 예: 접시 희석 10-7, 10-8및 10-9에 있다 231, 27, 2 패, 각각. 각 희석의 100 μ, 감염에 대 한 사용 되었습니다 그리고는 titer 플 라크 형성으로 표현 했기 때문에 단위 (pfu) / mL, 도금 요소는 10. 이 숫자를 수식에 입력 됩니다. <img alt="플라크 형성 단위(pfu), 공식, 바이러스학 데이터 분석 차트를 사용한 바이러스 역가 계산." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> 따라서,는 titer 약 2 × 1010 전염 성 살 균 소 입자/mL 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 변환
<ol><li>
받는 사람 세포 준비
	<ol>
<li>받는 사람 변형 BL21ΔABCF 파운드 600에서 광학 밀도를 보충 성장 ~ 1.0 nm (OD600). OD600 값을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.</li>
		<li>0.5의 감염 (MOI) 값의 다양성을 달성 하는 데 필요한 페이지 lysate의 볼륨을 계산 합니다. 나를 계산 하려면 문화권의 OD600 에 따라 박테리아의 수를 견적 한다. OD600 값이 1.0 ~ 109 cfu/mL에 해당 하는 가정 합니다. lysate의 알려진된 titer에 따라 필요한 볼륨을 계산 합니다. 예 (titer 단계 2.3.6 후 예제에서 계산에 따라): <img alt="파지 역가 계산 공식 V=(파지 수)/(용해물 역가) μL로 변환." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
		<li>10 m m 받는 사람 긴장 문화 CaCl2 를 추가 하 고 혼합. 변환에 대 한 문화의 1 mL를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
변환 수행
	<ol>
<li>받는 사람 문화 (를 포함 하 여 10 m m CaCl2 ) 단계 3.1.2에서에서 계산한 1 mL를 파지 lysate의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 참고: 플라스틱 믹스에 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 상단에서 샘플을 주의 해야 합니다.</li>
		<li>정적으로 37 ° c.에 20 분을 위한 혼합을 품 어</li>
		<li>100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5 추가 하 여 감염을 중지 합니다.</li>
		<li>박테리아 (5000 x g 2 분) centrifuge 고 상쾌한, 다음 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 그들을 resuspend.</li>
		<li>세포 단계 무료 페이지 및 칼슘의 제거를 보장 하기 위해 3.2.4 에서처럼 두 번 더 씻는 다.</li>
		<li>100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 박테리아 resuspend (&gt; 100 rpm)를 흔들어 1 h 30 ° C에서 박테리아를 품 어.</li>
		<li>원심 (5000 x g 2 분)에 의해 박테리아를 수집 하 고 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5와 파운드의 ~ 100 μ에 그들을 resuspend.</li>
		<li>25 µ g/mL와 10 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5에서 칸으로 보충 하는 파운드 플레이트에 박테리아를 확산 하 고 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 박테리아를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
transductants를 선택 하면
	<ol>
<li>식민지는 선택 접시에 성장 했다, 일단 단일 식민지를 위한 파운드 + 칸에 그들을 restreak 단일 식민지 나타납니다까지 30 ° C에서 성장 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 절 개 칸 카세트
<ol><li>
재조합 플라스 미드 전이
	<ol>
<li>관 저항 BL21ΔABCF 긴장 electrocompetent를 확인 합니다.<ol>
<li>신선한 파운드 (5 mL) 칸 보충에 단일 식민지에서 스트레인 성장 (25 µ g/mL) OD600 ~0.5-0.7까지 30 ° C에서.</li>
			<li>여기에서에, 다음 단계 또는 얼음에 4 ° C에서 실시 합니다. Centrifuge 박테리아 (5000 x g 10 분) 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
			<li>이전 원심 분리 단계를 반복 하 여 두 번 차가운 증류수와 셀 펠 릿을 세척 하 고, 마지막으로, 얼음 10% 글리세롤의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1mm electroporation 큐 벳 얼음에 식혀.</li>
		<li>세포 현 탁 액을 플라스 미드 DNA (pCP20)의 1 세를 추가 하 고 부드럽게, 현 탁 액을 혼합 냉각된 electroporation 베트에 그것을 전송.</li>
		<li>1.8는 electroporator 설정 kV 및 electroporate 셀.</li>
		<li>SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 1 h 30 ° c.에 대 한 그들을 성장 하 여 변형 된 세포를 구출</li>
		<li>파운드에 셀의 100 µ L 플레이트 + 앰프 플레이트와 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재결합의 유도
	<ol>
<li>선택 단일 식민지 파운드 + 앰프에서 접시 하 고 접종 신선한 파운드 모든 항생제를 생략.</li>
		<li>FLP recombinase의 표현을 유도 하룻밤 비 허용 온도 (43 ° C)에서 세포 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recombinants 선택
	<ol>
<li>직렬 희석 하 고 만들고, 비 선택적 접시에 105-106 희석의 50 µ L 플레이트 하룻밤 30 ° c.에서 그것을 성장합니다</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 유전자 삭제 확인
<ol><li>
플라스 미드 손실 및 성공적인 재결합의 확인
	<ol>
<li>격판덮개에서 행진 한 식민지 파운드 + 칸, 파운드 + 앰프, 그리고 파운드에 4.3.1 단계에서이 순서로 항생제 없이 접시 준비. 줄무늬에 투입, 식민지 표 사용 하 여 ( 보충 파일 1참조). 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 번호판을 성장.</li>
		<li>비 선택적 접시에 성장 하지만 추가 확인에 대 한 선택적 미디어에 성장 하지 못했습니다 10-20 클론을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
식민지 PCR에 의해 추가 확인
	<ol>
<li>식민지 PCR 뇌관 순서 코딩 타 마 측면으로 수행 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>마스터 PCR 혼합을 준비 합니다. 필요 믹스 ( 표 1의 예를 참조) 테스트 하는 식민지의 수에 따라 다릅니다. 얼음에 시 약을 혼합, 마지막에 중 합 효소를 추가 합니다.</li>
		<li>철저 하 게, PCR 마스터 믹스를 섞어 다음 20 µ L를 PCR 스트립의 튜브로 분배. 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 상영 될 각 식민지의 작은 금액을 선택 하 고 튜브를 추가. 비교를 위해 원래 받는 사람 긴장을 포함 하도록 하십시오. 선택적으로, 기증자 스트레인 포함.</li>
		<li>PCR 반응 실행 (사용 하는 프로그램에 대 한 표 2 참조).</li>
		<li>1 %agarose 젤 준비.<ol>
<li>50ml 젤 agarose의 0.5 g을 측정 하 고 태 버퍼 (40 m m Tris, 20 mM 아세트산 그리고 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 mL를 추가 합니다. 모든 agarose 해산 했다 때까지 렌지에 혼합물을 열.</li>
			<li>agarose 해산 했다, 일단 약 50 ° C에 대 한 해결책을 냉각 하 고 염료를 착 색 하는 DNA의 5 μ를 추가 합니다. 솔루션을 잘 혼합 하 고 주조 챔버에 젤 트레이에 부 어. 분자 크기 마커 뿐만 아니라 모든 샘플에 대 한 충분 한 웰 스는 잘 빗의 하나 이상의 행을 삽입 합니다. 30 분 설정 하 젤을 허용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR 실행 완료 되 면 각 샘플을 DNA 로드 염료 x 6의 4 µ L를 추가 합니다. 젤 전기 이동 법 챔버에 배치 하 고 우물 덮여 때까지 태 버퍼를 추가 합니다.</li>
		<li>젤에 잘 각 PCR 반응에서 10-15 µ L를 적용 합니다. 또한 분자 크기 마커의 5 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 75 V에서 30 분 동안 젤을 실행 합니다.</li>
		<li>실행 완료 되 면 젤 블루 빛 영상 장치를 사용 하 여 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 기타 기술
<ol><li>
단백질 표정 참고: 테스트 단백질 (YadA와 EibD)의 표현 되었습니다23,24다른 곳에서 상세히 설명. 이것은 주요 단계에 대 한 간단한 요약입니다.<ol>
<li>BL21ΔABCF Δ타 with 필요한 플라스 미드 (pIBA2-쫑 알, pEibD10 및 해당 제어 플라스 미드)를 변환 하 고 transformants 파운드 + 앰프에 대 한 선택.</li>
		<li>단백질 표정에 대 한 변형 된 박테리아의 숙박 문화의 1 mL와 함께 파운드 매체 + 앰프의 100 mL를 접종 하 고 30 ° C에서이 시간에 중간 로그 단계까지 성장, (100 ng/mL)에서 어느 anhydrotetracycline와 단백질 생산을 유도 하거나 이소프로필 thiogalactoside (0.5 m m).</li>
		<li>30 ° C에서 유도의 2 h 문화의 탁도 측정 하 고 OD600 에서 50 mL에 해당 하는 셀의 수를 수집 후 4000 x g에서 15 분 동안 문화 centrifuging 여 1.0 =. 펠 릿을 세척 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 그리고 중-20 ° C 또는 프로세스 단계 6.2 에서처럼 추가 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
외부 막 추출 참고: 외부 막 추출 레오 외 에 의해 세부 사항에 설명 된 대로 수행 됩니다. 27. 주요 단계 아래 요약 되어 있습니다.<ol>
<li>10 mm HEPES, pH 7.4, resuspend 1 mL에 셀 펠 릿 10 mM MgCl2 , MnCl2, lysozyme (0.1 mg/mL), 및 DNase의 핀치 나 보충.</li>
		<li>(예를 들어, 구슬 때리는 사용 하 여) 셀 lyse</li>
		<li>세포 파편을 제거 하 고 신선한 튜브에는 상쾌한 이동 곧 셀 (15,600 x g2 분)을 원심.</li>
		<li>16000 x g에서 30 분 동안 셀 후 원심, 10 mM HEPES, pH 7.4에에서 1% N lauroyl sarcosine의 400 μ에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>실 온에서 30 분 동안 교 반 후 셀을 품 어, 위와 같이 30 분 동안 원심.</li>
		<li>세척은 반투명 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 200 μ와 작은 10 mm HEPES 30 μ에 resuspend 그리고 SDS 페이지 샘플 버퍼 x 4의 10 μ를 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
활동 분석 실험 참고: 설명28YadA와 EibD에 대 한 SDS 페이지 및 활동 분석 실험을 수행 합니다. 주요 단계는 아래에 요약 된다.</li>
	<li>
SDS 페이지
	<ol>
<li>단백질을 변성 시키기 방지 하려면 polyacrylamide 젤에 그들을 로드 하기 전에 5 분 동안 50 ° C에서 샘플을 열.</li>
		<li>SDS 페이지에서 분리 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송 합니다.</li>
		<li>송금 후 PBS에 2% 무 지방 우유 파우더 막을 차단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뭐라 나 콜라겐 멀리 서쪽 오 점
	<ol>
<li>차단, 후 10 μ g/mL의 농도에 블로킹 버퍼에 소 콜라겐 유형 나 희석을 추가 하 고 1 시간에 대 한 막 품 어.</li>
		<li>막 2 워시 x PBS + 0.05 %Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>블로킹 버퍼에 막에 1 차적인 항 체 (단일 클로 널 항 콜라겐 COL-1), 희석된 1:2,000를 추가 합니다.</li>
		<li>잠복기 1 h 막, 후 6.3.2.2 단계에서 언급 한 대로 2 배를 세척 하 고 이차 항 체 [염소 반대로 마우스 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 켤레], 희석된 1:10,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.</li>
		<li>1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS. 2 x 향상 된 chemiluminescent 기판 제조업체의 지침에 따라 막에 추가 하 고 CCD 카메라를 사용 하 여 밴드를 감지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD IgG 바인딩 분석 결과
	<ol>
<li>차단, 이차 항 체 (염소 안티 토끼 HRP), 희석 1:2,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.</li>
		<li>1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS 가진 2 x. 6.3.2.5 단계에서 언급 한 대로 chemiluminescent 감지를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

P1 변환 대장균에 유전자 삭제를 생성 하기 위한 빠르고, 강력 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 여기 BL21 파생 된 받는 사람에 게 케이오 기증자 스트레인에서 타 마 삭제 돌연변이 시험에 의해 증명 됩니다. 변환 프로세스의 주요 단계는 lysate는 시험의 생산, 자체 변환, 칸 저항 카세트의 절단 및 PCR에 의해 녹아웃의 확인. 총에서 과정 약 1 주일 소요 하며 확인에 대 한 최종 PCR를 제외 하 고 사용할 수 없는 분자 생물학 방법. 따라서, P1 변환 빨간 재결합 팽창한 노력 및 시간 λ와 경쟁할 수 있는 하 고 전통적인 마커 exchange mutagenesis 보다 훨씬 빠릅니다.
제시 프로토콜 매우 강력한 이며 많은 단계 수정에 대 한 수 있습니다. 그러나 있다,, 몇 가지 중요 한 매개 변수. P1 감염, 그것은 매체에 칼슘 이온을 추가 해야 합니다. 칼슘은 박테리아를 살 균 소의 흡착에 대 한 필요 하 고 매체에 충분...

유전자의 기능 연구에 대 한 일반적인 첫 번째 접근 노크 아웃 mutagenesis 수행 결과 표현 형을 관찰 하는 것입니다. 이것은 또한 반전 유전학을 불린다. 지난 70 년 동안 또는 이렇게, 그것의 경작 및의 순종 유전자 조작1의 용이성으로 인해 박테리아 대장균 분자 생물학의 주력 하고있다. 여러 가지 방법은 대장균, 등 표식 exchange mutagenesis2,3 , 더 최근에, λ 레드 또는 Rac 외 시스템4,5 를 사용 하 여 recombineering에에서 유전자 삭제를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. , 6.
널리 사용 되는 시스템에서 개별 유전자의 코딩 시퀀스에서 염색체5,7excised 나중 수는 항생제 저항 카세트로 대체 됩니다. 코딩 시퀀스 대체 된다, 예를 들어 대 (칸) 저항 카세트, 양쪽에 flippase (FLP) 인식 대상 (FRT) 사이트에 의해 형벌 이다. FRT 사이트 recombinase 칸 카세트의 삭제로 이어지는 FRT 사이트 간의 사이트 재결합 중재 FLP에 의해 인식 됩니다. 이 방법에서는, 주어진된 유전자의 코딩 시퀀스의 전체 삭제 얻을 수 있습니다, 약 100의 기본적인 쌍 (bp) (그림 1)의 순서만 최소한의 흉터를 남겨두고.
전 10 년 넘게 소위 게이오 컬렉션 개발 되었다. 이것은 세균성 라이브러리 기반 표준 실험실 대장균 K12 변형, 거의 모든 비-필수 유전자 λ 빨간 재결합7,8에 의해 개별적으로 삭제 되었습니다. 이 컬렉션에서 클론 excisable 칸 저항 카세트 교체의 코딩 시퀀스 한 개 있다. 케이오 컬렉션9많은 응용 프로그램 대 한 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 하나는 같은 응용 프로그램 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이의 생산 이다. 일반적으로 살 균 소, P110,11,12,,1314등을 시험 하 여 주어진된 삭제 복제에서 칸 카세트를 동원 수 있습니다. 살 균 소 주식 같은 긴장에서 준비 사용할 수 있습니다 받는 사람의, E. 콜라이 긴장을 감염 하 어디 낮은 하지만 신뢰할 수 있는 주파수는 칸에서 카세트 포함 된 지역 포함 될 수 있습니다 받는 사람 게놈으로 동종 재결합에 의해 (그림 2)입니다. Transductants 칸 포함 된 매체에 성장에 대 한 선택할 수 있습니다. 이 따라 항생제 저항 카세트의 제거를 원하는 경우 트랜스 transductant 변형에 FLP recombinase 공급 수 있다. FLP 포함 된 플라스 미드, 암 피 실린 (Amp) 저항 마커를 운반, 경화 후 칸와 앰프-민감한 클론에 대 한 검사는 하 고 야생-타입 코딩 순서와 칸 카세트의 정확한 절단 식민지 PCR에 의해 확인 됩니다.
여기, 상세한 프로토콜 제공 됩니다, 각 녹아웃 대장균 스트레인 위에서 설명한 전략에 따라 생산 단계를 설명 하. 예를 들어, 타 마 유전자의 삭제는 보여 줍니다. 타 마 일부 전송 및 어셈블리 모듈 (TAM), 특정 autotransporter 단백질 및 pili15,,1617의 속에 포함 되는 외부 막 β 배럴 단백질을 인코딩합니다. 이 노크 아웃 긴장은 다음 2 개의 trimeric autotransporter adhesins (다시), 페스트 adhesin YadA와 대장균 면역 글로불린 (Ig)는 속에 다 마 삭제의 효과 검사 하는 데 사용 됩니다-TAA EibD 바인딩 18,19.

<table><tbody><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Keio 컬렉션의 야생형 균주</td></tr><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>발현 균주</td></tr><tr><td>E. coli BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>BL21(DE3)에서 파생</td></tr><tr><td>E. coli JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><<td>em>tamA deletion mutant</td></tr><tr><td>P1 vir</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>일반적으로 transducing bacteriophage</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td> FLP pASK-IBA2 IBA GmbH<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>를 이용한 조건부 복제 플라스미드2-1301-000</td><td></td></tr><tr><td>EibD 생산을 위한 발현 벡터 pEibD10</td><td>해당 없음</td><td>N/A</td><td>; 요청 시 플라스미드 사용 가능</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>발현 벡터</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>YadA 생산을 위한 해당 없음; 요청 시 플라스미드 사용 가능</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>항콜라겐 I 형 항체 COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>소 콜라겐 I 형</td><td>시그마</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>머크</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>머크</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>인산수소이나트륨</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>DNA 염료</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA 분자 크기 마커</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 믹스</td><td>뉴 잉글랜드 Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP 기질</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG-HRP</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필 티오 갈락 토시드</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>카나 마이신</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>염화 망간</td><td>시그마</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>N- 라우로일 사르코신</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>tamA 포워드 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'</td></tr><tr><td>tamA 리버스 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>서열 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq</td></tr> <tr><td>DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose 젤 전기 영동 챔버</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>비드 비터</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation unit</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이팅 쉐이커</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>삼성</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG 전기영동 챔버</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>습식 이송 장치</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

excisable 항 생 저항 카세트와 p1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

박테리아에서 알 수 없는 유전자의 기능 연구에 대 한 첫 번째 접근은이 유전자의 녹아웃을 만드는 것입니다. 여기, 우리는 강력 하 고 빠른 살 균 소 P1 일반화 된 변환 사용 하 여 다른 한 대장균 긴장에서 유전자 삭제 돌연변이 전송 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 돌연변이 선택 가능 (예: 항생제 카세트 삽입을 사용 하 여 유전자 중단에 따라) 해야 합니다. 이러한 항생제 카세트 기증자 긴장에서 동원 될 수 있습니다 관심 받는 사람 부담으로 신속 하 게 도입 하 고 쉽게 유전자 삭제 돌연변이 생성. 항생제 카세트 사이트별 recombinase 게놈에서 순서 ~ 100-기지-쌍-긴 흉터만 깨끗 한 녹아웃을 생산 하 여 카세트의 절단을 허용 하는 flippase 인식 사이트를 포함 하도록 디자인할 수 있습니다. 우리는 어셈블리 요소 autotransporter 속에 관련 된 인코딩 타 유전자를 노크 하 여 프로토콜을 설명 하 고는 속에이 노크 아웃의 효과 및 2 개의 trimeric autotransporter adhesins의 기능 테스트. P1 변환에 의해 유전자 삭제는 한계가, 비록 편리 하 고 속도 구현 하기가 유전자 삭제의 다른 방법에 매력적인 대안.

세대는 타 마 노크 아웃 BL21ΔABCF의의:
위에서 설명한 전략은 이전 BL21(DE3), 외부 막 단백질 생산을 위한 최적화 이며 BL21ΔABCF21라는 단백질 생산에 사용 되는 표준 실험실 긴장의 파생 긴장을 생산 하기 위해 사용 되었습니다. 이 긴장 풍부한 외부 막 단백질을 코딩 하는 4 개의 유전자를 부족 하 고, 따라서, 야생-타입 스트레인 보다 더 heterologously 표현된 외부 막 단백질을 생산할 수 있다. 베 레모는 TAA 속에 참여 하는 여부를 테스트 하려면 타 마 진이이 백그라운드에서 삭제 되었습니다.
P1 lysate 게이오 컬렉션 스트레인 JW4179, ...

여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

이 방법은 특정 유전자의 기능을 찾는 것과 같은 미생물학 분야에서 유용합니다. 이 방법의 주요 장점은 E.Coli의 녹아웃 돌연변이를 생성하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법이라는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Thomas Trunk입니다.절제성 항생제 카세트를 기반으로 유전자 결실을 포함하는 공여자 균주를 감염시키려면, 먼저 5ml의 lysogeny broth(LB)에서 박테리아를 10mg의 염화칼슘으로 성장시키고, 선택적으로 kanamycin 1ml당 25μg을 600나노미터의 광학 밀도로 약 1.0의 광학 밀도로 성장시킵니다. LB 배지에서 기존 P1 파지 스톡을 희석 시리즈로 만들고, 개별 15ml 원심분리기 튜브에서 200마이크로리터의 박테리아 현탁액과 각 파지 희석액 100마이크로리터를 혼합합니다. 섭씨 37도에서 20분 동안 튜브를 정적으로 배양합니다.배양이 끝나면 약 3 밀리리터의 용융 상단 한천에 10 밀리 몰의 염화칼슘을 튜브에 첨가합니다. 볼텍싱으로 내용물을 섞고 혼합물을 예열된 LB 플레이트에 부어 균일한 층을 만듭니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.다음 날 아침, 파지 플라크가 반쯤 합류하여 성장한 플레이트를 선택하고 접종 루프를 사용하여 상단 한천층을 원심분리 튜브로 긁어냅니다. 흄 후드 아래에서 LB 1-2밀리리터와 클로로포름 한 방울을 튜브에 넣고 1분 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이칩니다. 원심분리로 한천과 박테리아 세포를 펠렛화하고 상등액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 펠릿의 파편을 방지합니다.그런 다음 클로로포름 2방울을 넣고 용해물을 섭씨 4-10도에서 보관하십시오. P1 형질도입의 경우, LB 단위의 수용체 균주를 600나노미터에서 광학 밀도 1로 성장시키고 혼합을 통해 수용체 균주 배양액에 염화칼슘을 10밀리몰로 첨가합니다. 다음으로, 클로로포름이 1ml의 수용체 배양액으로 옮겨져 0.5의 감염 다중도를 달성하는 것을 방지하기 위해 샘플 상단에서 적절한 부피의 파지 용해물을 첨가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 혼합물을 정적으로 배양합니다.배양이 끝나면 리터당 100밀리몰에 구연산나트륨을 첨가하고 형질도입된 박테리아를 원심분리하여 감염을 막습니다. 형질도입 후 구연산나트륨을 첨가하는 것은 야생형 박테리아 파지에 의한 추가 감염을 예방하기 때문에 필수적인 단계입니다. 100밀리몰의 시트르산 나트륨이 보충된 1ml의 신선한 LB에 펠릿을 재현탁시키고 세포를 두 번 더 세척하여 유리 파지와 칼슘을 제거합니다.마지막 세척 후, 100 밀리몰의 구연산 나트륨을 보충 한 1 밀리리터의 신선한 LB에 박테리아를 다시 현탁시킵니다.섭씨 30도에서 100 RPM으로 1 시간 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 박테리아를 수집하고 100밀리몰의 시트르산나트륨이 보충된 약 100마이크로리터의 LB에 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 밀리리터당 25마이크로그램의 카나마이신과 10밀리몰의 시트르산나트륨이 보충된 LB 플레이트에 박테리아를 펴고 집락이 나타날 때까지 섭씨 30도에서 박테리아를 성장시킵니다. transductants를 선택하려면, 단일 콜로니가 나타날 때까지 섭씨 30도에서 단일 콜로니 성장을 위해 새로운 LB 플러스 카나마이신 플레이트에 콜로니를 다시 장착합니다. kanamycin cassette를 절제하려면 kanamycin 내성 수용자 균주를 전기 유능하게 만드십시오.세포 현탁액에 재조합효소 인코딩 pCP20 혈장 DNA의 1피코그램을 추가합니다. 현탁액을 부드럽게 혼합하고 냉각된 1mm 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다. 세포의 전기천공을 위해 electroporator를 1.8kvolt로 설정하고 섭씨 30도에서 1시간 동안 1ml의 SOC 매체로 변형된 세포를 구출합니다.그런 다음 섭씨 30도에서 야간 배양을 위해 LB와 암피실린 플레이트에 100마이크로리터의 세포를 플레이트합니다. 다음날 아침, 항생제 없이 신선한 LB에서 접종할 단일 콜로니를 선택하고 섭씨 43도의 비허용 온도에서 밤새 세포를 성장시켜 플립파제 재조합효소의 발현을 유도합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 야간 배양을 위해 비선택적 플레이트에 50마이크로리터 연속 희석액을 플레이트하고 항생제 내성 카세트를 잃어버린 클론을 스크리닝합니다.방금 설명한 바와 같이 P1 형질도입 및 카나마이신 카세트 절제 후, 암피실린과 카나마이신 모두에 민감한 여러 클론을 얻을 수 있으며, 클론 내 tamA 유전자의 성공적인 결실은 콜로니 PCR로 확인할 수 있습니다. 단백질 생산을 유도한 후 발현 배양의 외막 분획을 SDS-PAGE로 분리 및 분석할 수 있습니다. 모체와 tamA 녹아웃 수용 균주의 발현 수준 사이에는 큰 차이가 관찰되지 않지만, YadA는 녹아웃 균주에서 다소 낮은 수준에서 생성되는 것으로 보입니다.EibD의 경우 그 반대인 것 같습니다. tamA의 결핍이 단백질의 올바른 접힘 또는 수송에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하기 위해 단백질이 리간에 결합하는 능력을 콜라겐 멀리 서쪽 블롯으로 테스트할 수 있습니다. 이 대표적인 실험에서 YadA 결합 콜라겐은 모 균주와 녹아웃 균주 모두에서 유사한 수준으로 검출되어 단백질이 올바르게 접혀 있고 기능적임을 입증했습니다.유사하게, 두 균주에서 EibD의 IgG 결합 활성은 단백질의 발현과 상관관계가 있었으며, 이는 tamA의 결실이 삼중자가수송체 접착체 부착 생물 발생에 큰 영향을 미치지 않음을 입증했습니다. 이 절차를 시도할 때 우수한 무균 기술을 사용하는 것과 pCP20 함유 박테리아를 30도 이하에서 성장시키는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드에서 작업하고 내화학성 장갑과 실험복을 착용하여 개인 보호를 보장하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이...

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

효율적인 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이 방법은 사용하는...

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

출처: Valentine, ME, et al. 녹농균 에서 프레임 내 유전자 결실 돌연변이체의 생성 및 간단한 감염 마우스 모델에서 독성 감쇠 테스트. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 플라스미드 기반 유전자 결실 전략을 사용하여 녹농 균에서 이중 교차 재조합체의 생성을 보여줍니다. 이 과정에는 단일 교차를 통해 게놈에 통합된 비복제 플라스미드를 보유한 박테리아를 선택한 다음 자당 선택 하에서 두 번째 재조합 사건을 유도하여 플라스미드를 절제하는 과정이 포함됩니다. 성공적인 이중 교차 재조합은 항생제 내성의 상실과 자당 함유 배지에서 성장할 수 있는 능력으로 확인됩니다.

표적 유전자 결실을 위한 녹농 균의 이중 교차 재조합체 생성

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형  균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

학습하세요 P1 파지 전도를 이용한 대장균 유전자 결실 돌연변이 생성 방법. 항생제 내성 카세트를 활용하여 특정 유전자 기능을 연구하는 신뢰할 수 있는 유전공학 기법을 탐구합니다.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

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