Name: 게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9을 활용하여 Drosophila에서 조직 특이적 이진 전사 시스템을 생성하는 방법입니다. 이 기술은 branchless 유전자를 대상으로 하며 발달생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

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우리 박사 F. 포트, 감사 닥터 K. 오 코너-자일 스, 닥터 미 Feng CRISPR 전략;에 대 한 토론에 대 한 박사 결핵 콘 버그, 그리고 시 약; 대 한 블루밍턴 재고 센터 UMD 이미징 핵심 시설; NIH에서 자금: R00HL114867 및 R35GM124878 미스터를

1. 설계 및 건설 gRNA 표정 벡터
<ol><li>정확 하 게는 엑손의 긴 정의 된 영역을 대체 하려면 듀얼 gRNA 접근6, 있는 각 gRNA 특별히 선택 된 관심 영역의 두 끝을 타겟팅 할 수 있습니다 사용 합니다. 정확한 유전자 특정 spatiotemporal 표현의 드라이버를 얻으려면 첫 번째 코딩 exon 유전자의 두 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다.</li>
	<li>
초파리 melanogaster, flyCRISPR 최적의 대상 찾기 도구 (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/)를 사용 하 여 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다. 다른 사용 가능한 CRISPR 디자인 도구 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라, 최적화 CRISPR 디자인 도구 (http://crispr.mit.edu), FlyCas9를 포함 하 여 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), 및 E-선명 (www.e-crisp.org/E-CRISP). 참고: gRNA 디자인 및 복제의 다음과 같은 프로토콜 방법 앞에서 설명한6,7에서 채택 되었다.<ol>
<li>온라인 도구에 제공 된 상자에 실제 시퀀스를 복사 합니다. "선택 게놈"에 대 한 드롭 다운 메뉴에서 가장 최근에 출시 된 초파리 melanogaster 게놈 주석 버전, "r_6,"를 선택 필드 "선택 가이드 길이에서 (nt)," "20." 입력 "모든 CRISPR 대상"을 찾아서 "CRISPR 대상 찾기"를 클릭 하 여 선택 합니다.</li>
		<li>"팸"에 대 한 "엄중"와 "NGG만"에 대 한 "최대"를 설정 하 여 모든 후보 gRNA 목표를 평가 합니다. 어떤 잠재적인 오프-대상 또는 대상에서 가능한 최소 수 없이 gRNA 사이트를 선택 하려고 합니다. 웹 도구를 사용 하 여 Doench 그 외 여러분 2014 8 선택 gRNAs 잠재적인 "좋은" 활동 점수를 설명 합니다.</li>
		<li>동시에, 거기는 없습니다 단일 염기 다형성 gRNA 대상에 주입 (예를 들어, nos Cas9 X 염색체, BL # 54591)에 대 한 선택 된 부모 플라이 라인의 게놈에 확인 합니다. Gratz 외. 20157 부모 비행 라인에서 게놈 DNA 추출에 설명 된 프로토콜을 따릅니다. PCR 증폭, 관심과 높은 충실도 DNA 중 합 효소;의 순서 측면 뇌관을 사용 하 여 500-1000 nt 지역 약, 시퀀스를 PCR 증폭 제품 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
탠덤 gRNA 식 벡터를 생성 한 결 찰 독립적인 복제 프로토콜6 pCFD4 RNA 식 벡터 두 protospacer 시퀀스를 따릅니다. 참고 향상 된 멀티-gRNA 식 벡터 (pCFD5)는 지금 사용할 수 어디에 두는 sgRNAs 강한 U6:3 발기인9 (https://www.crisprflydesign.org)에서 표현 됩니다. PCFD4 벡터에는 gRNAs를 복제 하는 DNA 어셈블리 메서드를 사용 합니다.
	<ol>
<li>디자인 하 고 RNA 식 벡터 pCFD4에 두 protospacer 시퀀스를 도입에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 순서 (테이블 1A). 앞에서 설명한6, 앞으로 뇌관 U6-1 발기인 및 pCFD4; gRNA 코어에 해당 하는 영역을가지고 있는 첫 번째 protospacer 시퀀스가 포함 되어 있는 반전 뇌관 영역에 해당 하는 gRNA 코어와 pCDF4의 U6-3 발기인에 의해 형벌 두 번째 protospacer의 반전 보수 시퀀스를 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>DNase과 RNase 무료 이중 증류수 (ddH2O)와 100 μ M에 프라이 머 resuspend 10 μ M 작업 농도 뇌관을 확인 합니다. PCFD4 플라스 미드를 사용 하 여 서식 파일로 하 고 PCR 반응 높은 중 합 효소를 사용 하 여 PCR 반응6에 대 한 설정을 권장 합니다.</li>
		<li>PCFD4로 증폭 된 제품을, 다음 반응을 설정 하 여 BbsI 효소로 플라스 미드 pCFD4 소화: pCFD4 플라스 미드의 2-5 μ g, 소화 버퍼 x 10의 5 μ, BbsI 효소 및 ddH2O 50 μ를 최종 볼륨을가지고 1 μ. 부드럽게 튜브를 활용 하 고 간단한 스핀에 의해 바닥에 튜브의 벽에서 흩어져 모든 방울을 수집 하 여 반응 내용을 혼합. 2 h 37 ° C에서 반응 혼합 품 어.</li>
		<li>2 단계와 3 단계에서 소화 제품에서 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 합니다. 충분 한 시간을 완전히 DNA 밴드를 분리에 대 한 전기 영동을 수행 합니다. 잘라 올바른 예상된 제품 제조업체의 지시에 따라 젤 차입 열을 사용 하 여 정화 하기 전에 UV 트랜스-조명 아래 DNA 밴드 크기 ( 재료의 표참조). PCR 제품은 600 해야 혈압, 및 선형화 pCFD4 플라스 미드 ~6.4 kb 6이어야 한다.</li>
		<li>제조업체의 지시 당, PCR 튜브에 DNA 어셈블리 반응 설정 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>유능한 박테리아 (DH5α 또는 ΔrecA1, ΔendA1와 유사한 긴장) 어셈블리 제품의 2 μ 변환, 암 피 실린에 접시 (100 μ g/mL) 파운드 (LB/앰프) 한 천 배지를 포함 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어. DNA 어셈블리 혼합 유의 특정 박테리아 계통에 독성이 있을 수 있지만 어셈블리 혼합을 diluting 독성을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>밤새 incubated 접시에서 3-4 암 피 실린 내성 식민지를 선택 하 고 접종 3 ml 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린, 포함 된 식민지 하룻밤 37 ° C 통에 접종된 박테리아를 성장. 제조업체의 지시에 따라 플라스 미드 소형 예비 키트를 사용 하 여 하룻밤 배양 박테리아에서 플라스 미드를 추출 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>탠덤 gRNA 삽입을 포함 하는 올바른 클론에 대 한 화면에 보편적인 뇌관 T3 플라스 미드를 시퀀스. 박테리아는 시퀀스 확인 pCFD4-gRNA 20% 글리세롤에서와 나중에 사용-80 ° C 냉동 고에 게 변환의 글리세롤 재고를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 설계 및 건설 HDR 기증자
<ol><li>
에 대 한 게놈 노크 Gal4 또는 LexA 시퀀스의, 두 상 동 팔에 의해 형벌 transactivator 시퀀스가 포함 된 더블-좌초 HDR 기증자 디자인.
	<ol>
<li>사용 > 1.5 kb 왼쪽과 오른쪽 상 동 팔 gRNA를 대상으로 측면에 서는 사이트. 확장된 상 동 팔 복구 프로세스 10동안 HDR의 효율성을 증가.</li>
		<li>PCR 증폭 주입을 위해 선택 된 부모 비행 라인에서 추출한 게놈 DNA (gDNA)에서 상 동 팔 (예, 개-Cas9 (X 염색체)에 BL # 54591). 긴 PCR 확장에 적합 한 감수 핫 스타트 Taq DNA 중 합 효소 효소를 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 시퀀스 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>설계 현장에 gRNA의 retargeting를 방지 하려면 대체 기증자 gRNA 인식 사이트 소개 exogenous 시퀀스에 의해 혼란 된다 그런 방법으로 디자인. 참고: 변경 상 상속 시스 규정 요소를 방지 하려면 항상 gRNA 인식 사이트 코딩 exon 지역 내에서 선택 합니다.</li>
	<li>
교체 카세트를 생성 하기 위한 4 개의 세그먼트를 함께 가입 DNA 어셈블리 전략 계획: 5'과 3' 상 동 팔, 중간 세 transactivator DNA 시퀀스 및 선형화 복제 벡터 백본 (예: pUC19 또는 기타 통용 된다 클로닝 벡터). DNA 어셈블리에 대 한 제조업체의 지침에 따라 (재료의 표 참조), PCR 확대 및 각 세그먼트에 대 한 적당 한 뇌관 디자인. DdH2O. 확인 10 μ M 작업 농도 뇌관 100 μ M에 프라이 머 resuspend 높은 중 합 효소를 사용 하 여 모든 PCR 반응에 대 한. 다음 프로토콜을 따르십시오.
	<ol>
<li>PCR 증폭에서 사용 가능한 벡터 Gal4 또는 LexA 식 카세트 (예를 들어, nls-LexA:p65; 이상적인 Gal4/LexA/QF2 식 플라스 미드를 찾아내고 Addgene 같은 일반적인 자원에서 얻은 수 있습니다) 사용 하는 표 1B에 나열 한 뇌관<ol>
<li>모든 원래 transcriptional 및 post-transcriptional의 규정 transactivator DNA 시퀀스의 표현에 대체 exon 유지 하려면 편집된 게놈 대립 유전자 공상 mRNA 표현 것 이다 그런 방법으로 카세트 디자인의 transactivator 그리고 유전자입니다. 어떤 접합 신호를 유지 하기 위해 타겟된 exon 5'과 3' 끝을 유지 합니다.</li>
			<li>잔여 5' exon와 공상 단백질으로 번역을 방지 하기 위해 transactivator 시퀀스 코딩 사이 T2A 자체 cleaving 펩 티 드 순서를 통합 합니다. (그림 5) 외 인 transactivator 시퀀스 후 번역 정지 codon를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR 증폭 주입을 위해 선택 된 부모 비행 라인에서 추출한 게놈 DNA (gDNA)에서 상 동 팔 (예, 개-Cas9 (X 염색체)에 BL # 54591) 표 1B에 나열 된 뇌관을 사용 하 여. 높은 중 합 효소를 사용 하 여 다음과 같은 시스템을 사용 하 여 모든 PCR 반응: 반응 버퍼, 10mm dNTPs의 0.5 μ, 10 μ M의 1.25 μ x 5의 5 μ 앞으로 뇌관, 10 μ M의 1.25 μ 반전 뇌관, 서식 파일 DNA, 0.25 μ 고 충실도 DNA 중 합 효소의의 0.5 μ DdH2오의 16.25 μ</li>
		<li>PUC19 같은 선형화 클로닝 벡터를 사용 합니다. 기증자 벡터 수 지금 사용할 수 있습니다. 다음 웹사이트 http://flycrispr.molbio.wisc.edu에서 포괄적인 목록 참조 하십시오.</li>
		<li>1 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 합니다. 원치 않는 일반적인 밴드 (있을 경우)에서 원하는 밴드의 명확한 분리를 보장 하기 위해 충분 한 시간에 대 한 전기 영동을 수행 합니다. 젤-정화 예상된 DNA 파편. 분 광 광도 계를 사용 하 여 각 순화 된 DNA 파편의 농도 측정 합니다.</li>
		<li>제조업체의 지시에 따라 DNA 어셈블리 반응을 설정 합니다. 단계 3에서에서 선형화 클로닝 벡터 및 대상 조각 믹스와 다음 반응에서 4 단계: 선형의 1 μ ddH와 20 μ를 최종 반응 볼륨을가지고 클로닝 벡터 (50 ng/μ), 각 대상 파편의 2-3 배 초과, DNA 어셈블리 마스터 믹스, x 2의 10 μ < c21 > 2오 품 50 ° c.에서 1 시간 동안 반응 혼합</li>
		<li>변환 어셈블리 제품의 2 μ 유능한 박테리아, 접시에 LB/앰프 한 천 배지 100 μ g/mL 암 피 실린 포함. 또한, X-여자 + IPTG 블루/화이트 심사에 대 한 접시에 추가 합니다.</li>
		<li>밤새 incubated 접시에서 3-4 백색 식민지를 선택 하 고 접종 3 ml 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린, 포함 된 식민지 통에 하룻밤 37 ° C에서 성장. 제조 업체에 따라 플라스 미드 소형 예비 키트를 사용 하 여 하룻밤 배양 박테리아에서 플라스 미드 추출의 매뉴얼 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>긍정적인 식민지 PCR 또는 제한 소화에 의해 화면.</li>
		<li>시퀀스 마지막 플라스 미드의 HDR 기증자 지역을 확인 합니다. 올바른 변형 세균성 주식 저장 미래 접종-80 ° C에서 20% 글리세롤에 복제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 태아 주입, 플라이 유전학 및 게놈 편집에 대 한 심사
<ol><li>준비 하는 높은 순수성도 무료 gRNA 식 벡터 뿐만 아니라 HDR 기증자 플라스 미드 플라스 미드 maxiprep를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>Nos-Cas9 배아6의 생식으로 대체 기증자 (500 ng/μ)와 gRNA 식 플라스 미드 (100 ng/μ)을 주사 공동. 참고: 우리는 주입, 상업 서비스를 사용 하지만 또한 실험실에서이 절차를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>
유전학 및 검사 (그림 2 및 그림 3) 비행:
	<ol>
<li>주입 된 배아 개발 성인으로, 각 단일 G 크로스0 파리 분산 파리에. 타겟된 대립 유전자를 포함 하는 염색체에 대 한 적합 한 분산을 선택 합니다.</li>
		<li>F 1에서 각 G0 자손 CO2 패드에 교차 하 고는 stereomicroscope에서 10-20 남성을 무작위로 선택 anesthetize 교차 그들 개별적으로 분산 암컷에 그림 3에서 보듯이.</li>
		<li>때 F2 애벌레 해치 각 십자가에서 단일 F1 아버지를 선택 하 고 단일 비행 게놈 DNA 준비 프로토콜을 사용 하 여 gDNA를 추출:<ol>
<li>GDNA 추출 버퍼 준비: 10 mM Tris Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 상 온에서 저장. 20 mg/mL 가수분해 K 재고 솔루션을 준비 하 고 냉장고에 보관.</li>
			<li>1.5 mL 마이크로 원심 관에 각 비행을 넣고 튜브 라벨. -80 ° C 냉장고에 하룻밤 보관.</li>
			<li>가수분해 공화국의 200 µ g/mL 최종 농도 포함 하는 gDNA 추출 버퍼의 신선한 작업 볼륨 준비 참고:이 단계에 대 한 오래 된 버퍼를 사용 하지 마십시오.</li>
			<li>액체 분배 하지 않고 버퍼를 첨 벙 첨 벙의 50 μ를 포함 하는 피 펫 팁 10-15에 대 한 각 비행을 뭉 개 버려. 나머지 버퍼 튜브에 분배 하 고 잘 섞으십시오. 20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
			<li>가수분해 K. 비활성화를 1-2 분 동안 95 ° C 열 블록에 튜브를 넣어</li>
			<li>10000 x g에 5 분 동안 아래로 회전 합니다. 저장 추가 PCR 분석을 위해 4 ° C에서 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nos-Cas9 파리, 부정적인 컨트롤 역할에서 gDNA를 준비 하는 같은 메서드를 사용 합니다. 3 단계 PCR 기반 화면 사용 하 여 올바른 "끝을" HDR (그림 2, 그림 5) 식별을 수행 gDNA 템플릿5각 F1 남자의. DNA 준비의 1 μ를 사용 하 여 다음 PCR 반응 시스템에서: PCR 주인 혼합 염료, 각 뇌관 (10 μ M), DNA 템플렛의 1 μ 그리고 ddH2오의 7 μ의 1 μ x 2의 10 μ</li>
	<li>그림 5A같이 수행 PCR 뇌관 fwd1 및 rev1 화면을 사용 하 여 삽입 또는 교체;의 존재에 대 한 삽입 또는 3' 영역;에서 교체를 확인 하려면 fwd2 및 rev2 뇌관을 사용 하 여 PCR을 수행 "끝에" HDR (테이블 1C) 확인 M13F와 rev3 프라이 머를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다.</li>
	<li>확인된 끝 아웃 HDR와 플라이 라인을 유지 하 고 설정 F2 세대에서 균형 잡힌된 주식. 다시 다른 염색체에 어떤 의도 하지 않은 돌연변이 제거 하려면 분산 파리에 outcross.</li>
	<li>
긴 PCR 증폭에 대 한 설립된 주식에서 높은-품질 gDNA를 준비 (> 800-1000 nt) 높은 충실도 Taq 중 합 효소와 완전히 시퀀스 amplicon 확인 조작된 게놈 영역에서 얻은 amplicons. 또는,를 사용 하 여 원유 gDNA 추출 설명한 이전 짧은 증폭 (< 800 nt), 편집 된 게놈 시퀀스 유효성을 PCR 제품을 중복. 다음 프로토콜을 사용 하 여 좋은 품질 초파리 게놈 DNA를 준비.
	<ol>
<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 25 성인 파리에 대 한 넣고 적어도 1 시간 동안-20 ° C 또는-80 ° C 냉동 고에서 얼어.</li>
		<li>추가 솔루션의 250 μ (pH 9.0 Tris HCl 0.1 m M, 0.1 m M, EDTA SDS 1%).</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브에 균질 화 pestles를 사용 하 여 파리를 균질 하 고 얼음에 튜브를 넣어.</li>
		<li>30 분 동안 70 ° C에서 품 어.</li>
		<li>35 KOAc (5 M)의 μ, 동요, 및 잘, 믹스를 추가 하지만 소용돌이 하지 마십시오.</li>
		<li>30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>12000 x g 15 분 동안에 회전.</li>
		<li>1 mL micropipette 신중 하 게 모든 침전 물은 다시 떠나 새로운 튜브만 분명 상쾌한 전송 또는 interphase.</li>
		<li>소 프로 파 놀의 150 μ는 상쾌한에 추가 합니다. 부드럽게 반전에 의해 혼합.</li>
		<li>5 분 동안 10000 x g 에서 회전 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 튜브에 펠 릿을 두고.</li>
		<li>1 mL 70%와 펠 릿을 세척 EtOH.</li>
		<li>5 분 동안 12000 x g 에서 회전 합니다.</li>
		<li>제거는 상쾌한. 공기 건조는 펠 렛 15 ~ 20 분. 펠 릿 이상 건조 하지 마십시오.</li>
		<li>DdH2o.의 100 μ에 펠 릿을 녹</li>
		<li>고 충실도 긴 amplicon 적합 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 (> 800 bp) 전체 편집된 영역을 증폭. 이상적으로, 2 개의 뇌관 벗어나게 게놈 영역 증폭 삽입된 카세트. 젤 PCR 제품을 정화 하 고 앞서 설명한 대로 시퀀스 여러 겹치는 뇌관으로 제품 확인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
해 부 조직/설계 플라이 라인의 배아에서 올바른 spatiotemporal 식 패턴을 확인:
	<ol>
<li>하이브리드 mRNA 제품 (테이블 1D)의 표현을 확인 하려면 총 RNA에서 RT-PCR을 수행 합니다.</li>
		<li>식의 유효성을 검사 하는 애벌레 조직/배아에 대 한 관심의 mRNA 제품의 제자리에 하이브리드를 수행 합니다.</li>
		<li>시퀀스 확인 끝 아웃 라인 가운데 정확한 조직 관련 spatiotemporal 식 패턴 편집된 라인의 각 교차에 대 한 화면을 LexOGFP 또는 LexO-RFP ( 에 대 한 이진 식 드라이버 획득 LexA 드라이버) (블루밍턴 재고 센터에서 사용 가능) 라인과 LexA 또는 Gal4 형광 현미경 배아, 애벌레, 그리고 성인 조직에 리포터 유전자 발현 제어를 관찰.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

전통적으로, 초파리 증강 트랩은 두 가지 방법으로 생성 되었다. 방법 중 하나는 드라이버의 임의 삽입 포함 (예., Gal4) 이항에 의해 게놈 시퀀스 (예., P 요소 이항)1 . 또는, 게놈3,11의 소성 사이트에 통합 될 것 이라고 하는 플라스 미드 구문에 상 상속 증강/발기인 지역의 transcriptional 통제 드라이버 시퀀스를 배치할 수 있습니다. 이러한 방법은 초파리에 Gal4 또는 LexA 증강 트랩의 대형 수영장 생성, 비록 그들은 몇 가지 제한이 있다. 게놈에 있는 P 요소 중재 하는 무작위 삽입 중요 한 cis의 규제 활동 중단 될 수 있습니다-규제 시퀀스. 게놈에 있는 임의의 이항 인 transactivator 식 여러 인접 유전자의 패턴을 보고할...

타겟된 유전자 발현에 대 한 유전 도구 상자 잘 초파리, 다양 한 세포질 프로세스에서에서 포함 된 유전자의 기능을 조사 하기 위해 최고의 모델 시스템 중 하나에서 개발 되었습니다. 이진 식 시스템, 효 Gal4/UAS (상류 활성화 순서), 초파리 유전자 모델1 (그림 1)에서 조직 관련 증강 트랩 및 유전자 misexpression에 처음 채택 되었다. 이 시스템 기법 유전자 overexpression, misexpression, 선택 된 셀 그룹에 또한 셀 절제, 셀 표시, 세포질이 고 분자의 라이브 추적에서 녹아웃 spatiotemporal 규제 등의 많은 수의 개발을 촉진 배아와 조직, 계보 추적 및 모자이크 분석 개발 하는 동안에 처리 합니다. LexA세균성 같은 이진 전사 시스템의 수 /LexAop 시스템 (그림 1)와 Neurospora Q-시스템, 초파리, 이외에에서 널리 사용 지금 되는 강력한 유전자 도구 타겟된 유전자 식1,2,3에 대 한 원래 Gal4/UAS 체계.
여기, 우리는 게놈 편집 기법을 사용 하 여 신뢰할 수 있는 조직 관련 이진 식 시스템을 생성 하는 방법을 제시. CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술에 있는 최근 전진은 전례 없는 기회를 생물의 광범위 한 범위에서 감독된 게놈 변화를 만들 수 있다. 다른 사용 가능한 게놈 편집 기술에 비해, CRISPR/Cas9 시스템은 저렴 한 효율적이 고 신뢰할 수 있는. 이 기술은 이용 한다 세균성 적응 면역 시스템의 구성 요소: Cas9 endonuclease 만드는 두 배 물가 틈 (DSB), 연쇄 상 구 균 pyogenes 및 공상 가이드 RNA (gRNA)는 Cas9에 대 한 특정 게놈 사이트 안내 타겟된 DSB4. 셀은 DSB 다른 경로 사용 하 여 복구 하는 기계를 포함 합니다. 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 템플릿으로 exogenous HDR 기증자를 사용 하 여 정의 된 감독/바람직한 게놈 노크에서 / 노크-아웃을 소개 하는 homology 감독 수리 (HDR) 동안 유전자 기능을 방해 작은 삽입 또는 삭제를 리드. HDR-기반 대체 전략 전통적인 증강 트랩 메서드의 모든 한계를 극복할 수 있는 매우 신뢰할 수 있는 조직 관련 이진 식 시스템을 생성 하기 위해 효율적으로 활용할 수 있습니다. 우리 초파리의 내 생 transcriptional 및 post-transcriptional 규정의 제어에서 표현 되는 이진 전사 드라이버 라인 생성에 CRISPR/Cas9 기반 HDR 수리의 활용에 대 한 단계별 절차를 설명 유전자. 이 프로토콜에 대 한 특정 드라이버 라인의 세대 설명 branchless (bnl) 유전자 조절 tracheal 기도 상피5분기 morphogenesis FGF 가족 단백질을 인코딩. 이 예제에서 bnl 유전자의 첫 번째 코딩 exon 어떤 생 ci를 변경 하지 않고 세균 LexA transactivator 시퀀스의 순서에 의해 대체 되었다- bnl 유전자의 규제 시퀀스. 우리는 전략 생성 bnl LexA 드라이버 라인 spatiotemporally 독점적으로에서 bnl- LexAoperator (LexAop 또는 LexO)의 다운스트림 배치 취재 원 유전자의 표현을 제어 하는 표시 상피/엽/신경 세포를 표현합니다.

<table><tbody><tr><td>X-Gal/IPTG</td><td>Gentrox (Genesee Scientific)</td><td>18-218</td><td>복제</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD&nbsp; 244520</td><td>복제</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1161</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>시그마 Aldrich</td><td>71736</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher-Scientific</td><td>P1190</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher-Scientific</td><td>04-355-451</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>GeneJET Miniprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Miniprep</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210006</td><td>Maxiprep</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>프라이머</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>pCFD4</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>DNA 템플릿 및 벡터 gRNA</td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK2601</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5-high fidelity Taq</td><td>NEB NEB</td><td>#M0491</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>NEB #E2611</td><td>DNA 어셈블리</td></tr><tr><td>pBPnlsLexA:p65Uw</td><td>LexA 증폭용</td><td>Addgene</td><td></td> DNA 템플릿</tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>2x PCR PreMix, 염료 포함(빨간색)</td><td>Sydlab</td><td>MB067-EQ2R</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>겔 용출 키트</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-300</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>TRI 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>직접 졸 RNA 정제 키트</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td> <td>11-330</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>OneTaq 원스텝 RT-PCR 키트</td><td>NEB</td><td>E5315S</td><td>분자 생물학</td></tr> <tr><td>lexO- CherryCAAX</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>플라이 라인</td></tr><tr><td>UAS-CD8 : GFP</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>플라이 라인</td></tr><tr><td>btl-Gal4</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>MKRS/TB6B</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>Confocal Microscope SP5X</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging expression pattern</td></tr><tr><td>CO2 station</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td>플라이 푸싱</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>플라이 푸싱</td></tr><tr><td>유봉 마이크로튜브 균질화</td><td>Fisher-Scientific</td><td>03-421-217</td><td>게놈 DNA 분리</td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>DNA 정량화</td></tr></tbody></table>

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

이진 전송 시스템은 강력한 유전적 도구를 시각화 하 고 조작 하는 셀의 특정 그룹에서 세포 운명과 유전자 식 또는 조직 모형 유기 체에서 널리 이용 되는. 이러한 시스템 별도 유전자 변형 라인으로 두 개의 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 드라이버 라인 조직의 특정 발기인/강화, 제어 및 대상 유전자의 녹음 방송 활성 제 바인딩 사이트에 하류 배치 기자/이펙터 라인 항구 transcriptional 활성 제를 표현 합니다. 두 구성 요소를 품고 동물 대상 유전자 발현의 조직-특정 transactivation 유도. 대상된 조직에 유전자의 정확한 spatiotemporal 식 세포/유전자 활동의 편견된 해석에 대 한 중요 하다. 따라서, 독점 세포/조직 관련 드라이버 라인을 생성 하기 위한 방법 개발이 필수적입니다. 여기에 우리가 매우 조직 특정 대상된 식 시스템을 채용 하 여 생성 하는 방법을 제시는 "정기적으로 클러스터 된 Interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 된" (CRISPR/Ca)-게놈 편집 기법을 기반으로. 이 방법에서는, Cas9 공상 두 대상 이다 endonuclease RNAs (gRNA) 더블-스트랜드 나누기 (DSB) 만들려고 초파리 게놈에서 유전자의 첫 번째 코딩 exon에 특정 사이트 안내. 그 후, transactivator 시퀀스를 포함 하는 외 인 기증자 플라스 미드를 사용 하 여 셀 자치 수리 기계 수 있습니다 homology 감독 수리를 (HDR) 정확한 삭제 하 고는 transactivator와는 엑손의 교체 DSB의 시퀀스입니다. 절에서 transactivator 셀에 독점적으로 표현 된다 어디 cis-대체 유전자의 규제 요소가 기능. 여기에 제시 된 초파리 fgf에 표현 하는 이진 transcriptional 드라이버 생성에 대 한 자세한 단계별 프로토콜 /branchless-상피/신경 세포 생산 유전자 또는 조직의 특정 식에 대 한 채택 될 수 있다.

이 프로토콜은 bnl 셀5표현에 대 한 대상된 이진 식 기자 시스템 특정 생성 하 성공적으로 사용 되었다. Cis-복잡 한 spatiotemporal bnl 식 제어 하는 규제 요소 (CREs) 특징 되지 않습니다. 따라서, spatiotemporal 식 생 bnl 규제 시퀀스의 통제를 달성 하기 위해, bnl 의 첫 번째 코딩 exon만 세균성 LexA transactivator의 순서 교체 하도록 설계 되었습니다. 알려진 초파리 에 최적의 식을 제공 하는 향상 된 nls LexA::p65 카세트 선정 됐다.
대체 전략은 공상을 생성 하기 위한 nls-LexA:p65-bnl 생...

여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

이 방법의 전반적인 목표는 고도로 조직 특정 표적 발현 시스템을 생성하는 것입니다. 이 방법에서, 우리는 우리의 Drosophila FGF homolog에 대한 특정 바이너리 전사 드라이버의 생성을 시연, 분기없는. 분기없는 의 동적, 현공간적 발현은 기관 기도 상피의 지점 혈형성을 조절합니다.이 방법은 분기없는 생산 세포의 현면 적 발현 및 이동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, Drosophila또는 C.Elegans 및 제브라피시와 같은 다른 모델 유기체에서 다른 유전자및 조직에 쉽게 적용 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대체 된 유전자의 시스 조절 요소가 기능적이고 세포에서 독점적으로 매우 신뢰할 수있는 조직 및 유전자 특이적 발현 시스템을 생성한다는 것입니다. 이진 전사 시스템은 표적 유전자 발현 및 조작을 위한 필수적인 도구입니다.GAL4 또는 LexA와 같은 트랜스 활성제는 유전자의 시스 조절 요소의 통제하에 발현되어, LExA를 위한 GAL4 및/또는 LexO를 위한 UAS와 같은 특정 전사 결합 사이트의 하류에 배치되는 이펙터 트랜스 유전자를 구동합니다. 이 방법론은 분기없는 유전자의 첫 번째 코딩 엑소온을 전사 드라이버로 대체합니다. CRISPR Cas9 계 방법은 분기유전자의 내인성 조절하에 렉사 트랜스 활성제 서열을 배치하고, 결과적으로, 분기가 없는 특정 현면 패턴에서 독점적으로 트랜스 활성제 발현을 용이하게 한다.선택된 관심 영역의 2단을 구체적으로 표적으로 하는 두 개의 가이드 RNA 표적 부위를 선택하여 시작한다. 선택의 CRISPR 디자인 도구를 엽니다. 플라이 CRISPR 최적 대상 파인더는 여기에서 사용됩니다.선택 게놈'관심의 순서를 삽입, 가장 최근에 업로드 드로소필라 멜라노가스터 게놈 을 선택, 현재 R 은 드롭 다운 메뉴에서 여섯 강조. 다음으로 가이드 길이 선택'과 입력 20을 클릭합니다. 모든 CRISPR 대상을 선택하고 CRISPR 대상 찾기를 클릭합니다.PAM에 대해서만 스트링및 NGG에 대한 최대값을 설정하여 모든 후보 가이드 RNA 표적을 평가합니다. 탠덤 가이드 RNA 발현 벡터를 생성하기 위해, 제1 PCR은 DNA 단편을 증폭하여 2개의 프로토 스페이서 서열을 pCFD4 RNA 발현 벡터 백본으로 소개한다. 프로토 스페이서 서열을 가진 전방 및 역 프라이머를 사용하고, 고충실도 폴리머라제 및 pCFD4 템플릿 DNA를 사용하여 PCR에서 pCFD4 벡터 서열과 겹친다.복제를 위해 pCFD4를 준비하려면 Bbs1 효소로 플라스미드를 소화하십시오. pCFD4 플라스미드2~5마이크로그램과 Bbs1 효소 의 마이크로리터 1개와 50마이크로리터의 최종 부피를 포함하는 적절한 소화 완충제에 반응을 설정한다. 튜브를 두드리고 튜브의 벽에서 바닥까지 흩어진 모든 물방울을 짧은 스핀으로 수집하여 반응 내용을 혼합합니다.PCR 제품을 실행한 후 2시간 동안 섭씨 37도에서 반응 믹스를 배양하고 1% 아가로즈 젤로 플라스미드를 소화합니다. 표준 젤 정화 열을 사용하여 6.4 킬로베이스 쌍 선형 플라스미드 및 600 베이스 페어 PCR 제품을 정화합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 어셈블리 반응을 설정합니다.GAL4 또는 LexA 서열의 게놈 노크인의 경우, 두 개의 상동성 팔에 의해 측면에 있는 트랜스 활성제 시퀀스를 포함하는 이중 가닥 HDR 기증자를 디자인합니다. 설계된 궤적에 대한 가이드 RNA의 재표적을 피하기 위해, 가이드 RNA 인식 부위가 도입된 외인성 서열에 의해 중단되는 방식으로 대체 기증자를 설계한다. 또한 시스 조절 요소의 순도를 변경하지 않으려면 코딩 엑슨 영역 내에서 항상 가이드 RNA 인식 부위를 선택하십시오.대체 카세트를 생성하려면 DNA 어셈블리 전략을 계획하여 4개의 세그먼트를 함께 결합합니다. 5개의 프라임 및 3개의 프라임 상동성 암, 중간 외인성 트랜스 활성제 DNA 서열 및 선형화된 클로닝 벡터 백본. PCR은 적절한 벡터로부터 GAL4 또는 렉사 발현 카세트를 증폭시키고 PCR은 주입을 위해 선택된 부모 플라이 라인에서 추출된 게놈 DNA로부터 모모로지 암을 증폭시킵니다.각 PCR에서 고충실도 폴리머라제를 사용하여 표적 조각을 생성합니다. DNA 어셈블리 반응을 설정하려면 PCR 복제에 의해 생성된 선형 복제 벡터 및 표적 조각을 DNA 어셈블리 마스터믹스와 최종 반응 부피를 제조업체의 지침에 따라 20 마이크로리터에 혼합한다. 50°C에서 1시간 동안 반응 믹스를 배양합니다.Nos-Cas9 배아가 이전에 가이드 RNA 발현 플라스미드와 대체 기증자를 모두 주입했을 때, 성인으로 발전하면 G0 을 교차하여 표적 알레에 적합한 라인에서 파리의 균형을 맞추기 위해 개별적으로 날아갑니다. 이산화탄소 패드에 각 G0 십자가에서 F1 자손을 마취합니다. 임의로 스테레오 현미경으로 10 에서 20 남성을 선택합니다.개별적으로 대상 된 알레에 적합한 라인에서 밸런서 여성으로 선택 된 각 남성을 교차합니다. F2 애벌레가 부화하면 각 십자가에서 F1 아버지를 선택합니다. 파이펫 끝으로 10~15초 동안 각 비행을 스퀴싱하여 게놈 DNA를 추출하여 버퍼를 분배하지 않고 50 마이크로리터의 스퀴싱 버퍼를 함유합니다.그런 다음 남은 버퍼를 튜브에 분배하고 잘 섞습니다. 섭씨 37도에서 20~30분 동안 배양하세요. 인큐베이션에 이어, 튜브를 섭씨 95도의 열블록에 1~2분 동안 배치하여 단백질을 비활성화한 후 10, 000배G에서 5분간 회전한 후, 추가 PCR 분석을 위해 섭씨 4도에 준비하십시오.프라이머를 사용하여 3단계 PCR 기반 화면을 수행하고 삽입 또는 교체의 존재를 검사하기 위해 프라이머를 뒤로 합니다. PCR을 2개의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 두 개의 프라이머를 역으로 하여 세 개의 주요 영역에서 삽입 또는 교체를 확인합니다. 프라이머 M13F를 사용하여 PCR을 수행하고 3을 뒤집어 끝'HDR을 확인합니다.확인된 종료'HDR로 플라이 라인을 유지하고 F2 세대의 균형 잡힌 주식을 설정하십시오. 밸러운더는 다른 염색체에 의도하지 않은 돌연변이를 제거하기 위해 다시 날아갑니다. 분기리스, 또는 bnl 발현은, 세 번째 인스타 애벌레 날개 디스크에서 빨간색으로 도시되며, 수용체 호흡이 없는 발현 세포를 녹색으로 나타내며, 성장하는 공기 낭 프리모듐에서 나타난다.분기없는 발현 세포는 TR5 횡방향 결합 분기 및 TR2 등쪽 분기에 여기에 표시됩니다. 숨이 멎을 듯한 표현 기관 세포는 여기에 녹색으로 표시됩니다. 호흡없는 발현 세포는 녹색으로 표시되며, 단계 9에서 14 단계까지 발전하는 배아 기관체를 표시하고 분기없는 발현 세포는 빨간색으로 표시됩니다.이 이미지는 저산소 조건 하에서 자궁 외 조직 위치에서 유도된 분기없는 발현을 대조하는 것을 보여줍니다. 이 방법은 분기없는 유전자 전사의 모든 원래 의 현면적 규정을 유지하기 위해 설계되었습니다. 따라서 유전자의 첫 번째 코딩 엑소만 렉사 트랜스 활성제 코딩 서열로 대체하는 것이 중요했다.개발 후, 이 새로운 유전 도구 세트는 분기유전자의 새로운 조직 발현 패턴을 탐구하는 길을 열었습니다. 그것은 또한 유전자 잘못 발현을 활성화하고 분기없는 표현 세포에서 독점적으로 쓰러져 세포의 선형 이동 및 신호 상호 작용을 모니터링하는 데 도움이되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 CRISPR-Cas9을 사용하여 게놈이 변형된 형질전환 초파리 파리를 식별하는 스크리닝 방법을 설명합니다. CRISPR-Cas9은 과학자들이 유기체의 게놈을 조작하는 방식에 혁명을 일으킨 강력한 게놈 편집 도구입니다. 예제 프로토콜에서는 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법을 확인할 수 있으며, 여기서 transactivation sequence의 삽입은 branchless(bnl) 유전자의 첫 번째 엑손을 대체하여 bnl 유전자 특이적 드라이버 라인인 bnl-LexA를 생성합니다.

유전체 변형 스크리닝: 초파리에서 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법

에서 상동 재조합 구문을 Recombineering<em&gt; 초파리</em

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

이 문서에서는 RNA 표적 Cas13D 효소(RfxCas13D)를 파리에서 사용하기 위한 상세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

CRISPR/CasRx를 사용하여 드로소필라 멜라노가스터 에서 유비쿼터스 및 조직 별 RNA 표적화

이 논문은 동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 표준화 된 프로토콜에 의해 제공되는 상세한 단계는 B. dorsalis에서 기능적 유전자 연구를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.

동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 프로토콜

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

여기에서는 성공적인 유전자 변형의 마커 없는 식별을 위해 PCR 기반 기술을 활용하여 안정적인 knock-in 라인의 개발을 촉진하는 초파리에 대한 단순화된 내인성 유전자 태깅 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila melanogaster의 내인성 유전자 태깅을 위한 원스텝 CRISPR 기반 전략

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

배우세요 CRISPR/Cas9을 활용하여 Drosophila에서 조직 특이적 이진 전사 시스템을 생성하는 방법입니다. 이 기술은 branchless 유전자를 대상으로 하며 발달생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

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