Name: 만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 만성 림프모구 백혈병에서 NFAT2 표적 유전자를 식별하는 크로마틴 면역침전법을. 이 기법은 전사인자와 DNA 상호작용을 연구하여 종양학적 기전과 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 DFG에 의해 지원 되었다 뮤 3340/1-1과 도이치 Krebshilfe 111134 (둘 다 M.R.M.에 게 수 여 하는) 부여 부여. 우리 감사 Elke Malenke 우수한 기술 지원).

모든 실험 인간의 소재와 실시 튀빙겐 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 했다 고 서 면된 동의 샘플이이 연구에 기여 하는 모든 환자에서 얻은.
1. 격리와 자극의 Jurkat 세포
참고: 프로토콜을 최적화 하려면 사용 Jurkat 세포 라인을 표현 하는 NFAT2의 높은 수준으로 알려져 있다. 모든 단계는 층 류 두건 아래 수행 됩니다.
<ol><li>물 욕조에 37 ° C로 온난 하 여 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 50 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>RPMI 1640의 20 mL에서 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 플라스 크에 1-2 d6 셀/mL 10 %FCS 1% 페니실린/스 약 2 x 10의 밀도 보충을 위한 Jurkat 세포 문화 (셀 Trypan와 계산 됩니다 블루 얼룩 및 현미경 Neubauer 챔버) 200 x g에 5 분 동안 centrifuging 여 수확 하는 고.</li>
	<li>피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 10 mL에 셀 resuspend. 그 후, 기존의 trypan 푸른 얼룩 및 현미경 Neubauer 챔버 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>200 x g 에 5 분 동안 1.3 단계에서 세포를 원심 하 고 열망 하 여는 상쾌한을 제거 합니다. 그런 다음 resuspend RPMI 1640 pipetting으로 10 %FCS 1% 페니실린/스와 전송 새로운 기존의 5 mL 튜브에 1 mL 보충에 2 x 107 셀/mL의 조밀도에 셀.</li>
	<li>32.4 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 및 1 µ M ionomycin 추가 하 여 세포를 자극. 다음 16 h 37 ° C와 5%의 CO2 열 튜브의 뚜껑에 대 한 셀을 품 어 (오염 방지 씰링 필름 공기 침투성 사용할 수 있습니다).</li>
</ol>2. 절연 및 인간 환자에서 기본 CLL 세포의 자극
참고: 환자 샘플 인수 하 고 앞에서 설명한7자극 했다. 모든 단계는 층 류 두건 아래 수행 됩니다.
<ol><li>환자 로부터 혈액을 그릴 하 고 밀도 그라데이션 분리를 수행 하기에 필요한 장비를 준비: 21 G 바늘, 지 혈 대, NH4-헤 파 린-혈액 컬렉션 주사기 (예: S-monovettes), PBS, 그리고 밀도 그라데이션 중간 x 1 (밀도 1.077 g/mL) .</li>
	<li>따라 venipuncture, 주사기로 CLL 환자 (ca. 40 mL 혈액 환자 당)에서 혈액을 그립니다. 다음 50 mL 원뿔 튜브에 혈액을 전송 합니다. 10 mL PBS와 주사기를 세척 하 고 혈액-PBS-현 탁 액 (혈액의 볼륨에 튜브 수 조정) 50 mL 튜브에 수영장.</li>
	<li>신선한 50 mL 원뿔 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 15 mL를 준비 합니다. 그 후, 레이어 35 mL는 혈액-PBS-현 탁 액의 밀도 그라데이션 중간에 신중 하 게. 이 위해 평면 각도에서 튜브를 보유 하 고 천천히 혈액-PBS-현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브의 아래쪽 벽에 대 한 플라스틱. 더 많은 혈액-PBS-서 스 펜 션의 50 mL 원뿔 튜브에 축적은, 직각까지 튜브의 각도 증가 합니다. 혈액-PBS-서 스 펜 션의 볼륨에 따라이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>(브레이크) 없이 20 분 560 x g 에서 원심 분리를 수행 다음 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 포함 하는 단 세포 단계를 추출 합니다. 이렇게 하려면 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 밀도 그라데이션 분리의 흰색 interphase를 수집 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 전송 합니다.</li>
	<li>PBS와 360 x g에서 5 분 동안 원심 분리기로 50 mL에 세포 현 탁 액을 채우십시오. 포부는 상쾌한을 제거 합니다. 275 x g에 5 분 동안 원심 분리와 함께이 단계를 반복 합니다. 그런 다음 5-10 mL 50 mL 원뿔 튜브에 PBS에에서 한 환자의 세포 수영장.</li>
	<li>1.3에서 설명한 대로 셀을 계산 합니다. 참고: 그것은 CLL 세포 격리 된 PBMCs, 셀이이 절차에 대 한 직접 사용 될 수 또는 B 세포 격리 실시 하는 경우에, 예를 들어, 마그네틱 셀 정렬 (맥)을 통해의 비율에 따라 달라 집니다. B 세포 격리 좋지만 CLL 세포의 비율이 총 림프 톨 (cytometry 통해 결정)의 95% 이상 사용 하는 경우 생략할 수 있습니다. 혈액의 CLL 환자 고정 하 고 제조업체의 지침에 따라 lysed. 제조업체의 지침에 따라 수행 됩니다 CD19 FITC와 CD5-PE 항 체와 얼룩 그리고 셀 cytometry 통해 분석 된다. 모범 환자는 그림 1, 있는 CLL 세포의 비율 이다 89.03%에에서 표시 됩니다. 따라서, B 세포의 고립이이 환자에서 수행 되어야 하는. 생리 적인 B 세포의 비율은 무시할 수 (3.72% 예에서)는.</li>
	<li>10 %FCS, 1% 페니실린/스, 100mm 비 본질적인 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate와 50 m m β-mercaptoethanol 200 x g 에서 5 분 미리 따뜻하게 (37 ° C) 보충 RPMI 1640의 10 mL로 세포를 세척 하 고는 상쾌한 포부에 의해 제거.</li>
	<li>2 x 107 셀/ml RPMI 1640 FCS가 10%, 1% 페니실린/스, 100mm 비 본질적인 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate와 50 m m β-mercaptoethanol (37 ° C) 및 채우기 셀 서 스 펜 션의 1 mL 5 mL 튜브에 보충에 셀을 조정 합니다. 참고: ß-mercaptoethanol 산화 스트레스를 중화 시킬 때 채택 된다.</li>
	<li>32.4 PMA nM 1 µ M ionomycin를 추가 하 여 세포를 자극. 다음 16 h 37 ° C와 5%의 CO2 열 튜브의 뚜껑에 대 한 셀을 품 어 (오염 방지 씰링 필름 공기 침투성 사용할 수 있습니다). 참고: 스트레스의 수준을 감소 시키는 세포 자극의 16 h 이전 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 1 시간에 대 한 휴식 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 고정, 세포 세포의 용 해, 및 Chromatin 전단
참고: 환자 샘플 Jurkat 세포는 고정 및 수정7이전에 설명 된 대로 제조업체의 지시에 따라 상용 칩 키트 lysed. 고정 층 흐름 후드에서 수행 됩니다.
<ol><li>셀의 고정을 위한 37% 포름알데히드, 1.25 M 글리신의 1 mL 1.5 mL 튜브, 1 x PBS의 4 mL 5ml 튜브와 얼음 상자 1 mL 1.5 mL 튜브를 준비 합니다.</li>
	<li>단계 1.5 또는 2.9에서에서 각각 보육 시간에 대 한 세포의 자극, 후 5 분 동안 200 x g 에 5 mL 튜브를 회전 하 고 resuspend 5 mL 튜브에 PBS의 500 µ L에 셀.</li>
	<li>340 µ M 포름알데히드 (37% 포름알데히드의 13.5 µ L)에 있는 셀에 추가 합니다. 신중 하 게 여기저기 pipetting으로 간단한 혼합 후 2.5 분 (Jurkat 세포) 또는 실 온에서 5 분 (환자 샘플) 정지를 품 어. 참고: 장기간된 고정 시간 보장 최적의 전단 1 차 셀 필요 합니다.</li>
	<li>고정을 중지 하 고 즉시 그 후 얼음에 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 셀을 넣어 또 다른 5 분에 대 한 품 어 125 m m 글리신 (1.25 M 글리신의 57 µ L) 추가 포부는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에서 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 열망 하 여는 상쾌한 모든 시간을 제거. 참고: 고정, 후 프로토콜 수 일시 정지 됩니다. 고정된 셀-80 ° c.에 저장 한다 테스트 하려면, 다음 프로토콜에서 사용 하기 위한 항 체 epitope 하지 고정 통해 복 면 하는 경우, 추가 샘플 통해 SDS 페이지 젤 전기 이동 법 그리고 서쪽 오 점 분석에 사용할 수 있습니다. 다음이 단계는 제조업체의 지침에 따라 단백질의 100 µ g으로 수행 됩니다. 모든 αNFAT2 항 체는 1:1000, 1:10000의 희석에서 GAPDH 항 체의 희석에 사용 됩니다. 적절 하 고 부적 절 한 항 체를 가진 Jurkat 세포에서 고정된 샘플의 모범적인 이미지는 그림 2에 표시 됩니다.</li>
	<li>아래로 pipetting으로 상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼 1의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 그런 다음 샘플 통에 얼음에 놓고 떨고 있는 동안 10 분 동안 그들을 품 어. 참고: 세포의 용 해, 이전 셀 수 있을 붕괴 10 액체 질소에 s. 이 Jurkat 세포에 대 한 유용 하지만 기본 환자 샘플에 피해 야 한다. 해체, 장소 5 5 mL 튜브는 특정 컨테이너에 액체 질소의 5-10 mL에 s. 안전 안경 및 적절 한 안전 장갑을 착용 하십시오.</li>
	<li>그 후, 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 튜브 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다.</li>
	<li>상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼 2의 5 mL에 셀 아래로 pipetting으로 균질 하 고 동요 하는 동안 얼음에 10 분 동안 품 어. 그런 다음 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 튜브 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 제거 하는 방법.</li>
	<li>500 µ L (Jurkat 세포)에 셀 펠 릿 resuspend 또는 전단의 140 µ L (환자 샘플) 버퍼 1 protease 억제제 x 1 (5 µ L 또는 1.4 µ L, 각각)와 얼음에 10 분을 위한 혼합물을 품 어.</li>
	<li>Chromatin 전단에 대 한 전송할 셀-서 스 펜 션의 140 µ L 단계의 3.9 sonicator 튜브 (공기 방울 및 샘플 볼륨 때문에 필요한 경우이 단계 반복 생산 방지). 200-500 bp DNA 파편을 얻으려면 9.375 W의 평균 사건 힘 전단 10 분 (셀 라인) 또는 7.5 분 (환자 샘플) 7 ° C의 온도에 초점 맞춘된 울트라 sonicator에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>마지막으로, 작은 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 15700 x g 에서 원심 고 상쾌한 새로운 1.5 mL 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>적절 한 조각 크기에 대 한 테스트, 1.5% TBE agarose 젤에서 젤 전기 이동 법을 통해 전단된 chromatin의 20 µ L를 분석. 좋은 나쁜 품질의 Jurkat 세포에서 깎인된 chromatin의 모범적인 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 이 시점에서, 프로토콜 수 있습니다 잠재적으로 일시 정지 됩니다. 깎인된 chromatin-80 ° c.에 저장 한다</li>
</ol>4. 염색 질 Immunoprecipitation
참고: chromatin immunoprecipitation 상용 칩 키트 수정7제조업체의 지침에 따라 수행 되었다.
<ol><li>Immunoprecipitations (70 µ L (Jurkat 세포) 또는 전단된 chromatin 플러스 1 항 체의 15 µ L (환자 샘플))의 수를 계산 하 고 1.5 mL 튜브에 있는 강 수 당 단백질 코팅 A 구슬의 20 µ L를 준비. 아래로 pipetting으로 강수량 당 칩 버퍼 1 x 1의 40 µ L에 비즈를 세척, 구슬 1 분 자기 선반에 휴식 하 고는 상쾌한 pipetting으로 제거. 4 번 총에이 단계를 수행 합니다. 결국, 1 x 칩 버퍼 1 원래 볼륨에 구슬 resuspend.</li>
	<li>Immunoprecipitation 자체에 대 한 αNFAT2 항 체 (7A6)의 10 µ g을 사용 하 여 바인딩된 대상 시퀀스 NFAT2를 캡처. IgG-컨트롤로 토끼 IgG 항 체 (DA1E)의 2.5 µ g를 사용 합니다. 표 1에 표시 된 대로 신선한 1.5 mL 튜브에 반응을 준비 합니다. 참고: 그것은 누구의 epitope는이 프로토콜에 대 한 고정 동안 마스크 하지 높은 선호도와 단일 클론 항 체를 사용 하는 것이 중요입니다. Polyclonal 항 체는 그것은 훨씬 더 어렵게 받은 결과 적절 하 게 해석 하는 변이의 추가 수준을 소개 합니다.</li>
	<li>6 rpm에 회전 바퀴에 4 ° C에서 하룻밤 4.2 단계에서 혼합물을 품 어.</li>
	<li>다음에 하루 5에 대 한 튜브를 회전 작은 원심 분리기에서 7000 x g s 1 분 자기 선반에 그들을 품 어 및 포부는 상쾌한 제거. 워시 워시 버퍼 1, 2, 3, 4의 각각을 한 번 구슬 연속적으로.</li>
	<li>이렇게 하려면 워시 버퍼의 350 µ L에 비즈를 resuspend 하 고 6 rpm에 회전 바퀴에 4 ° C에서 5 분 동안 그들을 품 어.</li>
	<li>그 후, 5에 대 한 튜브를 회전 s 7000 x g 작은 원심 분리기에서. 다음, 그들 자석 선반에서 1 분, 제거는 상쾌한 놓고 워시 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>마지막 세척 단계 후 pipetting으로 상쾌한을 제거 하 고 차입 버퍼 1의 100 µ L에 구슬 차지 6 rpm에 회전 바퀴에 30 분 동안 그들을 품 어.</li>
	<li>튜브를 곧 스핀 (5 작은 원심 분리기에서 7000 x g s) 1 분 자기 선반에 두십시오.</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브에 pipetting으로 상쾌한 전송 그리고 차입 버퍼 2의 4 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>입력된 컨트롤을 만들려면 1 µ L 깎인된 chromatin의 차입 버퍼 2의 차입 버퍼 1과 4 µ L의 99 µ L 믹스 (이 설정에는 환자 당 3 개의 튜브: 하나 입력 제어, IgG-컨트롤 및 하나 αNFAT2 샘플).</li>
	<li>4 h 65 ° C에서와 1.5 mL 튜브 통에 1300 rpm에 대 한 샘플을 품 어. 추가 100% 소 프로 파 놀, 소용돌이 및 스핀 100 µ L 5에 대 한 샘플 작은 원심 분리기에서 7000 x g 에서 s.</li>
	<li>철저 하 게 vortexing에 의해 사용 가능한 자석 구슬 resuspend, 모든 샘플을 구슬의 10 µ L을 추가 하 고 6 rpm에 회전 바퀴에 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>부 화 후 5에 대 한 튜브를 회전 s 작은 7000 x g 에서 원심 및 자석 선반에 1 분 동안 넣어. 포부는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼 1의 100 µ L에 구슬 resuspend. 혼합 하 고 6 rpm에 회전 바퀴에 실 온에서 5 분 동안 품 어 튜브 반전.</li>
	<li>5에 대 한 튜브를 회전 s 7000 x g 작은 원심 분리기에서 그들 자석 선반에서 1 분 놓고는 상쾌한 pipetting으로 제거. 워시 버퍼 2 단계 4.13-4.14 반복 합니다.</li>
	<li>그 후, 포부에 의해 워시 버퍼를 제거 하 고 차입 버퍼의 55 µ L에 구슬 resuspend 하 고, 침전 된 DNA elute 하 6 rpm에 회전 바퀴에 실 온에서 15 분 동안 품 어. 마지막으로, 5에 대 한 튜브를 회전 s 7000 x g 작은 원심 분리기에서 자석 선반에 1 분 동안 그들을 배치 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 참고: 여기는 프로토콜 수 있습니다 잠재적으로 일시 정지 됩니다. -20 ° c.에 eluted DNA는 저장 합니다 다음</li>
</ol>5. CLL 세포에 NFAT 대상 유전자의 탐지.
<ol><li>표 2에 표시 된 대로 모든 샘플에 대 한 중복 qRT-PCR 반응을 수행 합니다. 참고: 대상 유전자의 검출에 대 한 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)는 실시를 실시간 PCR 장비 상용 qRT-PCR 혼합을 사용 하 여.</li>
	<li>흰색 96-잘 반응 플레이트를 사용 하 여 반응 및 RT-PCR 악기에 대 한. 자전거 상태는 다음과 같습니다: 95 ° C 30에 대 한 s, [95 ° C 5에 대 한 s, 30 60 ° C s] 40 주기 x. 참고: 입력 (undiluted 또는 희석 1시 10분, 1: 100과 nuclease 무료 물에서 1:1000)의 직렬 희석 상대 농축을 계산 하는 데 사용 됩니다. Jurkat 세포, 일리노이-2 긍정적인 컨트롤32로 사용 되었다. CD40L, B 세포에 NFAT2의 잘 알려진 대상 CLL33,34NFAT2의 소설 대상 유전자에 대 한 예제로 CLL 세포에 LCK 긍정적인 제어로 사용 되었다. CD40L, 일리노이-2 와 LCK 발기인 지역의 뇌관 특정 시 약 및 장비에 설명 되어 있습니다.</li>
</ol>6. 정규화 및 데이터 분석
주:일리노이-2, CD40L ( LCK)의 발기인 지구에 대 한 상대적 농축 정규화에 대 한 IgG 제어를 사용 하 여 계산 됩니다.
<ol><li>먼저, 입력된 직렬 희석, 일리노이-2, CD40L 와 qRT-PCR 데이터에서 평가 소프트웨어를 통해 LCK 발기인 지역에 대 한 Ct (임계값 주기) 값을 결정 합니다.</li>
	<li>통해 입력의 직렬 희석 농도 대 한 표준 곡선을 정의 합니다. 이 표준 곡선으로 일리노이-2, CD40L 집중력과 모든 샘플의 각 복제본에 대 한 LCK 발기인 영역을 계산 합니다.</li>
	<li>다음, 중복의 평균을 계산 합니다. 그런 다음 참조로 IgG immunoprecipitation 샘플을 설정 합니다. 이 샘플에 대 한 상대적인 농축 1.0으로 정의 하 고이 참조를 (NFAT2 immunoprecipitation)에서 다른 샘플을 비교.</li>
	<li>마지막으로, IgG 참조의 농도 의해 샘플의 농도 나누어 상대 농축을 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

성공적인 칩 분석 실험을 수행의 중요 한 단계는 적절 한 항 체의 선택과 과정25전단 chromatin의 최적화. ΑNFAT2 항 체의 선택이이 프로토콜의 개발 중 특히 어려운 것으로 판명. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 αNFAT2 항 체와이 작품 부 럽 잘 및 다른 응용 프로그램의 대부분은, 복제 7A6 칩7성공적으로 사용 될 수 있는 유일한 항 체 했다. 도 살 일 걸 요 다른 제조 업체에서 동일한 7A6 항 체 칩에 그들의 성과 관하여 중요 한 차이 전시. 주요 도전은 XChIP 프로토콜25에서 사용 하는 고정 과정에 의해 대상 단백질 epitopes의 잠재적인 장애 이다.
절차를 기울이기 chromatin XChIP에서 적절 한 결과 얻기 위한 중요 한 이기도 합니다. 200-500 bp의 조각 크기 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 평...

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 나타냅니다 서방 국가 있는 성인에서 가장 흔한 백혈병,1세포 성숙 B 표현 CD19, CD23, 그리고 CD5의 고유한 축적을 전시. 대부분의 환자 들은 몇 년에 대 한 구체적인 치료를 필요로 하지 않는다는 나태 한 질병 과정을 전시 한다. 반면, 일부 환자는 면역 화학요법 또는 다른 표적으로 한 치료2,3즉각적인 치료 내정간섭을 요구 하는 빠른 진행을 보여줍니다. 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요소는 다양 한 발달을 조절 하는 전사 인자와 수많은 셀 종류4,,56활성화 프로세스의 집합입니다. 우리가 최근에7나태 한 질병 가진 환자에서 overexpression 헌법의 및 활성화 CLL 세포에 NFAT2 보여 주었다. 여기, 그것은 라는 아7B 세포 수용 체 자극에 응답 하지 않는 상태를 조절. NFAT2에 림프 톨 특정 단백질 티로신 키 니 아 제 (LCK) 발기인 및 인간 CLL 세포, 특정 chromatin immunoprecipitation 분석 결과에서 LCK 식 조절 (칩) 개발 및 고용.
칩은 유전자 표현8에 녹음 방송 요인의 역할을 조사 하기 위해 여러 가지 기술 중 하나. 유전자 발현은 밀접 하 게이 과정9,10,,1112에 대신할 참여 하는 전사 인자와 매우 복잡 한 방식으로 여러 규제에 의해 조율 된. 공간과 시간적 맥락에서 유전자 발현을 조절 하는 전사 인자에 수많은 종 (예를 들어, 개발 및 차별화)13,,1415, 발견 되었습니다. 16,,1718. 오류와 관련 된 녹음 방송 요인 복잡 한 제어 메커니즘에 암19,20를 포함 하 여 pathologic 프로세스의 다양 한 발생할 수 있습니다. 따라서, 녹음 방송 요인 및 그들의 각각 대상의 식별 소설 치료 길21,22를 제공할 수 있습니다. 이 흥미로운 분야를 조사 하기 위해 여러 가지 방법을 칩, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 다양 한 DNA 풀 다운 분석 실험 및 기자-분석 실험8,,1112, 처럼 사용할 수 있습니다. 23 , 24.
특정 전사 인자는 게놈의 특정 지역 상호 작용 입증을 vivo에서 칩 이상적인 기술25입니다. 이 위해 DNA와 살아있는 세포에 관련 된 단백질은 십자가 UV 방사선 조사 또는 포 름 알 데히드 (상호 연결 된 칩, XChIP)를 사용 하 여. 이 단계는 더 나은 DNA 및 단백질 복구 소위 기본 칩 (NChIP)26에서 생략 됩니다. DNA 단백질 복합물은 이후 약 200-500의 기본적인 쌍 (bp)와 관심의 녹음 방송 요인에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 셀에서에서 immunoprecipitated의 파편으로 쥡니다에 의해 전단. 그리고 나 서 연결 된 DNA 파편 정화 PCR, 분자 클로닝 및 시퀀싱에 의해 특징. 대체 기술을 사용 하 여 microarrays (칩-온-칩) 또는 다음-세대 시퀀싱 (칩 Seq) immunoprecipitated DNA를 분석.
칩 길모어에 의해 처음 도입 및 1984 그들은 UV를 사용 하는 경우에 Lis covalently 상호 연결 DNA 빛과 생활에 단백질을 바운드 박테리아27. 세포 세포의 용 해 및 세균성 RNA 중 합 효소의 immunoprecipitation, 알려진된 유전자의 특정 프로브는 vivo에서 유통 및 RNA 중 합 효소의 밀도 매핑하는 데 사용 되었다. 방법은 진 핵 RNA 중 합 효소 II 열 충격 단백질 유전자 초파리28의 분포를 분석 하 같은 수 사관에 의해 연속적으로 사용 되었다. XChIP 분석 결과 Varshavsky와 동료 처음 열 충격 단백질 유전자29,30와 H4 히스톤의 협회를 공부 cross-linking 포름알데히드를 사용 하 여 더 세련 되었다. 때문에 자연스럽 게 그대로 epitopes 더 나은 DNA와 단백질 복구의 이점을 운반 NChIP 접근 및, 따라서, 더 큰 항 체 특이성, 처음 Hebbes와 동료 198831에 의해 설명 되었다.
칩의 DNA 단백질 상호 작용 분석을 다른 기술에 비해 장점은 사실, 녹음 방송 요인의 실제 상호 작용 수 조사 비보에 아무 프로브 또는 버퍼 또는 젤에 의해 만들어진 인공 조건 8,,1112고용. 차세대 시퀀싱 칩을 결합 하 여 여러 개의 목표를 동시에 확인할 수 있습니다.
이 방법의 주요 한계는 그대로 생물25에 대규모 분석을 그것의 제한 적용. 도전만 수준 낮은 또는 좁은 시간 창 동안 각각 단백질 표현 됩니다 경우 칩 기술을 사용 하 여 차동 진 식 패턴의 분석 될 수 있습니다. 또 다른 잠재적으로 제한 요인은 적절 한 항 체 칩11적합의 가용성 이다.
여기에 제시 된 칩 프로토콜 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)으로 대상 유전자의 녹음 방송 요인의 비보에 식별을 위해 사용할 수 있습니다. 특히, 목표 CLL에 NFAT2의 소설 대상 유전자를 확인 했다. 칩은 직접 인간의 CLL 환자 세포의 자연 조건 하에서 다른 대상 유전자의 발기인 지구에 NFAT2의 바인딩을 보여에 그것의 잠재력 때문에 선택 되었다.

<table><tbody><tr><td>1 X PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브 쉐이커 Themomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr><tr><td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0009</td><td></td></tr><tr><td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0002</td><td></td></tr><tr><td>37 % 포름알데히드 p.a., ACS</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td></td></tr><tr><td>4X 볼트 LDS 시료 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 항체</td><td>Alexis</td><td>1008505</td><td>Clone 7A6</td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 항체</td><td>세포 신호 전달</td><td>8032S</td><td>Clone D15F1</td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 항체 ChIP 등급</td><td>Abcam</td><td>ab2796</td><td>Clone 7A6</td></tr><tr><td>big Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr>: <tr><td>CD19-FITC 마우스, Anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td>Clone HIB19</td></tr>, <tr><td>CD5-PE 마우스, Anti-human CD5</td>, <td>BD Biosciences</td><td>555353</td><td>Clone UCHT2</td></tr>, <tr><td>밀도 구배 매체, Biocoll (밀도 1,077 g/ml)</td><td>Merck</td><td>L 6115</td><td></td></tr><tr><td>DNA, LoBind Tube, 1.5 mL</td><td>eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>Merck</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td>는 <td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr><tr><td>Halt Protease 및 Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td><td>Thermo Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Transfer Stacks, 니트로셀룰로오스, 일반 크기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>IB23001</tr> 히스톤 Diagenode C01010059 <tr><td></td><td></td><td></td> Ionomycin 칼슘 염 용 iDeal ChIp-seq 키트 Sigma Aldrich I3909 <td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68023</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 0.1 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey 적외선 이미징 시스템</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>B446</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 멀티웰 플레이트 96, 흰색</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>다른 실시간 PCR 기기의 다른 플레이트로 대체 가능</td></tr><tr><td>Lysing Solution OptiLyse B</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1400</td><td></td></tr><tr><td>M220 AFA 등급 물</td><td>Covaris</td><td>520101</td><td></td></tr><tr><td>M220 집속 초음파,</td><td>Covaris</td><td>, 500295</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>12301D</td>, <td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr>, <tr><td>MEM, Non-Essential Amino Acids Solution, 100X,</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Columns, Axiovert, 25</td>, <td>Zeiss</td><td>451200</td>, <td>유사한 기기</td></tr><tr><td>로 대체 가능microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer improved counting chamber</td><td>Karl Hecht GmbH & &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Co KG</td><td>40442012</td><td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr><tr><td>NH4 Heparin Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>02.1064</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&reg; 차단 완충액(TBS) 500 mL</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100X</td><td>Merck</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quanta Bio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Primer CD40L 프로모터 영역 포워드</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'</td></tr><tr><td>프라이머 CD40L 프로모터 영역 리버스</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td><td>5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'</td></tr><tr><td>프라이머 IL-2 프로모터 영역 포워드</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td>5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'</td></tr><tr><td>프라이머 IL-2 프로모터 영역 리버스</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td><td>5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'</td></tr><tr><td>프라이머 LCK 프로모터 지역 포워드</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td>5'-CAGGCAAAACAGGCACAT-3'</td></tr><tr><td>프라이머 LCK 프로모터 영역 리버스</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td><td>5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'</td></tr><tr><td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td><td>Cell Signaling</td><td># 3900S</td><td>Clone DA1E</td></tr><tr><td>Real-time PCR instrument</td><td>Roche</td><td>LightCycler 480</td><td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr><tr><td>롤러 믹서</td><td>Phoenix Instrument</td><td>RS-TR 5</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Safety-Multifly-needle 21G</td><td>Sarstedt</td><td>851638235</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Duomax 1030</td><td>Heidolph Instruments</td><td>543-32205-00</td><td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr><tr><td>소형 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Fresco 17</td><td>유사한 기기로 대체 가능</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td><td>Cell Signaling</td><td>#12498</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

만성 림프모구 백혈병에서 소설 nfat2 대상 유전자를 식별 하는 chromatin immunoprecipitation 분석 결과

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 악성 B 세포 복제품 확장 특징 이다 고 서방 국가에서 가장 흔한 백혈병을 나타냅니다. CLL 환자의 대다수는 질병의 나태 한 과정 뿐만 아니라 그들의 백혈병 세포의 anergic 형 B 세포 수용 체 외부 자극에 응답을 참조를 표시 합니다. 우리는 최근 녹음 방송 요인 NFAT2 CLL에 아의 중요 한 레 귤 레이 터가 나타났습니다. 다른 질병에서 녹음 방송 요인의 역할의 분석의 주요 과제는 그것의 특정 대상 유전자의 id입니다. 이 pathogenetic 메커니즘 및 잠재적인 치료 내정간섭의 해명에 대 한 큰 의미입니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 단백질 DNA 상호 작용을 설명 하는 고전적인 기법 이며 포유류 세포에 있는 녹음 방송 요인의 직접적인 대상 유전자를 식별 하는 데 따라서 수 있습니다. 여기, 칩 인간 CLL 세포에 NFAT2의 직접적인 대상 유전자로 LCK 를 식별 하기 위해 사용 되었다. DNA와 관련 된 단백질 포름알데히드를 사용 하 여 가교 된 이며 이후 쥡니다 대략 200-500의 기본적인 쌍 (bp)의 DNA 파편에 의해 전단. NFAT2와 관련 된 상호 연결 된 DNA 파편은 다음 선택적으로 αNFAT2 항 체를 사용 하 여 셀 파편에서 immunoprecipitated. 정화, 후 관련된 DNA 파편은 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 검색 됩니다. 분명 농축 된 DNA 시퀀스 NFAT2에서 비보에의해 타겟으로하는 게놈의 지구를 대표 한다. DNA와 필요한 항 체의 선택의 적절 한 전단 하는 것이이 방법의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 특히 중요 합니다. 이 프로토콜은 대상 유전자와 NFAT2의 직접적인 상호 작용의 데모에 이상적입니다. 그것의 주요 한계는 그대로 생물의 여러 전사 인자 들의 대상 유전자 분석 대규모 분석에 칩을 사용 하는 데 어려움.

그림 1 에서는 CLL 환자 CD19 FITC와 CD5-PE 항 체와 얼룩 후 수행의 모범 흐름 cytometry 분석. 그림 1a 는 CLL 환자의 혈액에 있는 세포의 대부분을 대표는 림프 톨의 게이팅 보여 줍니다. 그림 1b CD19의 비율을 보여줍니다+/CD5+ CLL 세포, 림프 톨이 예에서 89.03%를 대표 하는. CD19 비율+/CD5- B 세포는 각각 환자에 3.72%.
그림 2 다른 기간 SDS-PAGE 그리고 서쪽 오 점 하 여 평가 대 한 고정 Jurkat...

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

이 방법은 잠재적인 치료 내정간섭을 개발하기 위하여 putative 표적 유전자 및 병원성 기계장치의 확인과 같은 종양학의 필드에 있는 중요한 정보를 제공하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 NFAT2 및 알려진 및 참신한 표적 유전자와의 다른 전사 인자의 상호 작용을 감지할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 최적의 고정 및 전단 조건이 확립되기 어렵기 때문에 어려움을 겪게 됩니다.1.5 밀리리터 튜브를 37%의 포름알데히드1밀리리터로 채우기 시작합니다. 그런 다음 또 다른 1.5 밀리리터 튜브를 PBS 의 4 밀리리터가있는 5 밀리리터 튜브에 1.25 어어 글리신1밀리리터로 채웁니다. 다음으로, 세포의 자극 후 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 회전시키고, PBS의 500 마이크로리터에서 세포를 다시 중단하고 튜브를 얼음으로 채워진 상자에 놓는다.세포에 37%의 포름알데히드의 13.5 마이크로리터를 넣고 위아래로 배관하여 섞는다. 그런 다음 실온에서 서스펜션을 배양합니다. 그 후, 고정을 중지 1.25 어어 글리신의 57 마이크로 리터를 추가합니다.그리고 서스펜션이 실온에서 5 분 동안 배양 할 수 있도록하십시오. 잠복기 직후 세포를 얼음에 놓고 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 원심분리합니다. 그런 다음 슈퍼 네티퍼를 흡인합니다.다음으로, 4섭씨에서 5분간 200회 G에서 얼음-차가운 PBS 1밀리리터로 셀을 두 번 씻고 상수체를 제거합니다. 셀 펠릿을 리시스 버퍼 5개에서 위아래로 피펫팅하여 다시 중단합니다. 그런 다음 샘플을 얼음에 넣고 10 분 동안 흔들어 서 배양하십시오.그 후, 4섭씨에서 5분간 500회 G로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거합니다. 분해 버퍼 2의 5 밀리리터에서 세포를 균질화하고 파이펫을 위아래로 혼합합니다.그런 다음 흔들림으로 10 분 동안 얼음에 세포를 배양합니다. 인큐베이션 기간 후 튜브를 섭씨 4도에서 5분간 500회 G로 원심분리하고 상퍼를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 1X 프로테아제 억제제로 전단 버퍼 1에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.그런 다음 10 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양합니다. 세포 현탁액의 140 마이크로리터를 기포 형성을 피하기 위해 주의를 기울이는 초음파 튜브로 옮기. 튜브를 7°C의 초점 초음파처리에 놓고 10~7분, 1/2분간 전단을 합니다.세

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

이 비디오는 미세구균 뉴클레아제 효소 분해를 사용한 염색질 전단 프로토콜에 대해 설명합니다. 염색질 전단은 인간 만성 골수성 백혈병 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 조사하는 데 도움이 되는 염색질 면역침전 또는 ChIp 워크플로우의 필수 단계입니다. 기능 프로토콜에서 염색질 전단은 초음파 처리를 사용하여 수행됩니다.

염색질 전단(Chromatin Shearing): 효소 분해를 사용하여 염색질 단편을 생성하는 방법

이 동영상은 단백질-DNA 상호작용을 입증하는 고전적인 기술인 염색질 면역침전(ChIP) 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 표적 유전자를 확인하는 데 사용됩니다.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 조건에서 배양된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포의 퓨린 대사를 측정하기 위해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하는 쉽고 재현 가능한 방법을 나타냅니다.

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

여기에 우리가 현재 낮은 셀 chromatin immunoprecipitation (칩)를 수행 하 여 분석 하는 게놈 넓은의 바인딩을 oligodendrocyte 녹음 방송 요인 2 (Olig2) 심하게 정화 뇌 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 하도록 설계 된 프로토콜 도서관 준비, 높은 처리량 시퀀싱 및 bioinformatic 데이터 분석.

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

이 프로토콜은 1 차적인 만성 림프구성 백혈병 세포에서 핵 및 세포질 분획의 최적화 그리고 연속적인 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 견본은 세포 자극 및 약 처리에 핵과 세포질 구획 사이에서 일어나는 단백질 인신 매매에 있는 단백질 현지화 그리고 변경을 결정하기 위하여 이용됩니다.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

이 원고는 최적의 호중구 생존력과 높은 라이브러리 품질을 보장하는 것을 목표로 쥐 골수에서 호중구의 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. BMC 준비, 면역자기 분류 및 라이브러리 구축에 대한 단계별 지침을 제공하여 특히 호중구 연구를 처음 접하는 사람들에게 유용한 가이드 역할을 합니다.

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils(쥐 골수 유래 호중구의 ATAC-Seq 라이브러리 준비)

배우세요 만성 림프모구 백혈병에서 NFAT2 표적 유전자를 식별하는 크로마틴 면역침전법을. 이 기법은 전사인자와 DNA 상호작용을 연구하여 종양학적 기전과 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

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