Name: Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 학습하세요 Adipo-Clear 조직 투명화 기법을 이용한 지방 조직의 3차원 고해상도 이미징 방법을. 과다 지질을 제거하면서 3차원 구조를 보존하여 지방세포와 혈관, 신경의 상호작용을 정밀 분석할 수 있습니다.

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우리 크리스티나 Pyrgaki, 타오 통, 앨리슨 북쪽에 록펠러 대학 Bioimaging 리소스 센터에서 감사 하 고 지원 합니다. 우리는 또한 영화 편집: Xiphias Ge Zhu 감사합니다. 이 작품에서 인간 프론티어 과학 프로그램 조직 (PC)를 지원 했다.

동물 관리 및 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 록펠러 대학에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1. 조직 준비
<ol><li>혈액은 조직에서 완전히 제거 될 때까지 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 ~ 20 mL와 함께 표준 intracardiac 관류를 수행 합니다.</li>
	<li>목과 꼬리는 크게 굳 어 때까지 perfusate ~ 20 mL 통 솔루션 (4 %paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS에) 4 ° C에서의 전환. 주의: PFA 독성이 있다. 피부, 눈 및 점 막과의 접촉을 피하십시오. 솔루션은 증기 두건 안쪽 여야 한다.</li>
	<li>신중 하 게 그것을 손상 하지 않고 전체 지방 패드를 제거 하는 관심의 지방 패드를 해 부. 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 곤란 또는 조직을 압박을 피하기 위해. 모든 모피와 해 부 조직을 오염 하지 마십시오.</li>
	<li>후 4% PFA 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤에 조직 수정 각 지방 패드 15 mL 원뿔 튜브에 고정 솔루션의 ~ 10 mL와 수정 후.</li>
	<li>실 온 (RT)에서 조직 1 x PBS로 3 회 (각 1 시간)을 씻어.</li>
	<li>단기 (최대 2 주)에 대 한 조직 4 ° C에서 1 x PBS에 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 장기 저장 (예를 들어, 1-2 년)에 대 한 전환 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 1 x PBS (방부 제)로. 주의: 나트륨 아 지 드 구두로 섭취 또는 피부를 통해 흡수 하는 때 매우 독성이 있다. 나트륨 아 지 드 솔루션 (5% 이상) 증기 두건에서 처리 되어야 집중.</li>
</ol>2. Delipidation 및 Permeabilization
타이밍: 1-2 일
<ol><li>20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올 그라데이션 B1n 버퍼 (표 1) (v/v), 예를 들어, 20% 메탄올/B1n 버퍼에 대 한 준비, 메탄올의 20 mL와 B1n 버퍼의 80 mL를 혼합. 4 ° c.에 모든 버퍼 저장 글리신 결정 채도 인해 60% 및 80% 메탄올/B1n 버퍼에서 침전 한다. 크리스탈;를 제거 하지 마십시오 액체 솔루션을 사용 하 여 다음 세척에 대 한. 주의: 메탄올은, 자극성, 휘발성 및 가연성. 피부 또는 눈 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 머리를 제거 합니다. 어떤 머리, 보풀, 또는 파편 샘플에 연결 된 이미징 동안 그림자를 발생 합니다. 새로운 튜브로 청소 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>달리 명시 하지 않는 한 또는 얼음에 4 ° C에서 다음 단계를 모두 수행 합니다. (예를 들어, 젊은 마른 쥐에서 후부 피하/perigonadal 지방 패드) 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 (예를 들면, 비만 쥐에서 지방 패드) 높은 지질 콘텐츠로 샘플 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.<ol>
<li>가로로 설정 궤도 셰이 커에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓고 ~ 100 rpm. 샘플 튜브 안에 자유롭게 이동할 수 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100% 메탄올/B1n 버퍼의 등급된 시리즈에서 샘플을 탈수. 이어지기 솔루션을 최소화 합니다.</li>
	<li>Delipidate 100 %dichloromethane (DCM)와 샘플 (3 회), 부 화 시간에 각각 표 2에 표시. 샘플의 두 번째 및 세 번째 DCM 세척 끝 튜브의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우 전체 delipidation를 위해 보육 시간 연장 (예를 들어, 30 분에서 1-2 시간까지). 주의: DCM 연기 후드 안에 처리 되어야 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 튜브 외피에 대 한 폴 리 프로필 렌에서 만들어집니다. Microcentrifuge 튜브 DCM의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 serological 펫 폴리스 티 렌에서 DCM와 호환 되지 않습니다. DCM은 매우 휘발성 이다. 신속 하 게 건조를 방지 하기 위해 신선한 솔루션에는 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 100% 메탄올으로 두 번 세척.</li>
	<li>옵션: 없으면 샘플 잘 perfused, 나머지 적혈구에서 헤모글로빈의 색 될 수 있습니다 강한 autofluorescence. 4 ° c.에 하룻밤 메탄올 (메탄올의 5 볼륨 30% H2O2 의 1 볼륨)에서 5% H2O2 와 표 백제</li>
	<li>반전된 메탄올/B1n 버퍼 시리즈에서 샘플 rehydrate: 80%, 60%, 40%, 20% 메탄올/B1n, 및 100 %B1n 버퍼 (2 회) 지정 된 시간 (표 2).</li>
	<li>실시간에서 PTxwH 버퍼 (표 1) 2 시간에 대 한 샘플을 씻어</li>
	<li>Delipidated 샘플 4 ° C (최대 1 년)에서 PTxwH 버퍼에 저장 하거나 immunostaining 단계로 바로 진행 합니다.</li>
</ol>3. 전체 마운트 Immunostaining
타이밍: 8-10 일
참고: 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호, 언급 하지 않는 한. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다. 먼저 조직 또는 메탄올 처리 조직 단면도의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 1 차적인 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g에서 원심</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션 delipidated 샘플을 품 어.</li>
	<li>일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 샘플을 세척: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.</li>
	<li>권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 이차 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g 에서 원심 참고: 조직 autofluorescence에 의해 발생 하는 높은 백그라운드를 방지 하려면 fluorophores 빨간색과 빨강 영역에 빛을 방출로 활용 된 이차 항 체는 권장 됩니다. 현미경에 레이저 라인 수에 따라 최대 3-4 마커 수 수 몇 군데 동시에 하나의 샘플에.</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 2 차 항 체 솔루션 샘플을 품 어.</li>
	<li>일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 세척 샘플: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.</li>
	<li>옵션: 조직 유형 연약한, 수정 얼룩진된 조직 4% PFA 1 x PBS에 조직 형태를 유지 하기 위해 4 ° C에서 하룻밤. 참고:이 단계는 이미징 배경을 증가할 수 있습니다. 지방 조직에 대 한이 단계를 수행할 필요는 없습니다.</li>
	<li>1 x PBS와 샘플 일련의 인큐베이션 단계에서 세척: 5 분, 10 분, 그리고 30 분.</li>
	<li>부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 린 트를 제거 합니다.</li>
</ol>4. 조직 개간
타이밍: 1-2 일
<ol><li>선택 사항: agarose 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한 샘플 장착을 촉진 하기에 샘플을 포함 합니다. 참고:이 단계는 좋습니다 이미징 동안 모양을 안정화를 지방 조직에 대 한.<ol>
<li>1 x PBS (w/v)에서 1 %agarose 포함 솔루션을 준비 합니다. 포함 솔루션 쿨 ~ 40 ° C ~ 샘플 과도 한 열을 노출 하지 마십시오.</li>
		<li>(예, 페 트리 접시 또는 보트 무게) 금형 청소 샘플을 배치 하 고 원하는 위치에 정렬. 어떤 액체의 carryover를 하지 마십시오. 부드럽게 샘플 포함 솔루션을 붓는 다. 어떤 공기 방울을 피하십시오.</li>
		<li>완전 실시간 컷에 샘플을 포함 하는 블록을 공고히 하는 agarose를 하자. 참고: 하룻밤 외피를 포함 하 여 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 H2소개할 25%, 50%, 75% 및 100% (3 회)와 메탄올에서에서 샘플을 탈수. 참고: 샘플 100% 메탄올 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>(3 회)을 떨고와 1 시간에 대 한 100 %DCM 샘플을 품 어. 샘플 각 DCM 세척의 끝에 관의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우에 메탄올의 완전 제거를 보장 하기 위해 보육 시간 연장. 샘플은 100 %DCM 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>일치 하는 굴절률을 달성 하기 위해 가벼운 떨고와 dibenzyl 에테르 (DBE)에 샘플 밤새 품 어. 참고: 샘플 결국 가시 광선에 투명 하 게 될 것 이다. 주의: DBE 위험입니다. 피부와 접촉을 하지 마십시오. 두 계층 장갑 연기 후드 안에 그것을 처리 합니다. 최대한 빨리 그것은 DBE와 함께 오염 된 장갑을 삭제 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 관 (폴 리 프로필 렌) 외피에 대 한. Microcentrifuge 튜브 DBE의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 폴리스 티 렌에서 혈 청 학적인 펫 DBE와 호환 되지 않습니다. 100% 에탄올으로 어떤 유출 청소.</li>
	<li>어둠 속에서 RT에서 샘플 2 h. 저장소 떨고 가벼운와 신선한 DBE와 함께 샘플을 품 어 나 영상에 직접 진행. 참고: 샘플은 한 달 내 이미지를 권장 됩니다. 특정 fluorophores 다른 사람 들 보다 더 안정 되어 있지만,이 단계에서 샘플의 장기 보관 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>5입니다. 현미경
<ol><li>빛-시트 현미경 DBE와 호환 되는 이미지입니다. 참고: 유기 용 매 기반 이미징에 대 한 승인 되 고 DBE의 굴절률과 일치 하는 유일한 목표는 DBE 몰입 이미징에서 목표를 찍기로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>Agarose 포함 샘플 영상 동안 움직임을 막을 수 있는 홀더에 탑재 합니다. DBE 채워진 챔버로 샘플을 담가.</li>
		<li>Z-스택 전체 샘플 (예를 들어, 1-2 배 확대) 전체 조직 유통/관심의 마커의 구조를 취재를 수집 합니다.</li>
		<li>(예를 들어, 4-12 배 확대) 자세한 구조를 이미지를 관심 영역을 확대 하려면 더 높은 확대와 함께 목표를 전환 합니다. 참고: 콜라겐 지방 조직, 주변 모든 지방 세포13의 기질에 큰 기여입니다. 콜라겐은 약 400에 이르기까지 일반적인 방출 스펙트럼 550 nm14nm. 488 레이저 선 (녹색)으로 샘플을 상상 하 고 내 콜라겐 (예를 들어, 525-550 nm)의 방출 스펙트럼 파장 범위에서 방출된 빛을 수집 이전에 보여 줬던 조직 autofluorescence 신호를 제공할 것입니다. 지방 세포 윤곽 및 전반적인 조직 아키텍처12를 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>거꾸로과 이미징 confocal 또는 두 광자 현미경.<ol>
<li>모든 플라스틱 부품 (또는 인감 수 있습니다 기타 DBE 호환 이미징 챔버)을 건드리지 않고 agarose 포함 샘플 챔버 슬라이드 유리 바닥에 놓습니다. DBE 밖으로 누출 되지 않는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>더 깊은 침투를 달성 하 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택 하십시오. 참고: 이미지는 챔버 슬라이드의 유리 바닥을 통해 거꾸로 또는 2 광자 공초점 현미경으로 행해져야 한다. 샘플 및 찍기 DBE 기반 이미징에 대 한 제안 하지 목표 사이의 직접 접촉을 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Adipo 명확한 지방 조직, 일반 랩 설치에서 쉽게 실행 될 수 있는 삭제 위한 간단 하 고 강력한 방법입니다. IDISCO 등 다른 용 매 기반 개간 방법 비교 / iDISCO +10,,1112, Adipo 클리어는 특히 지방 조직 및 다른 조직 높은 지방 콘텐츠를 지우기. Delipidation 단계 완전히 지방에서 지질을 제거 합니다 및 따라서 전체 조직에 걸쳐 immunolabeling를 용이 하 게 하 고 크게 XY 해상도의 손실 없이 엔드-투-엔드 이미징 수 있도록 가벼운 살포를 최소화 합니다. 형광 빛 시트 뿐만 아니라 현미경 confocal 큰 조직의 빠른 검색을 제공 하는 및 2 광자 현미경 사용할 수 있습니다 또한 높은 해상도 더 많은 정보를 얻기 위해.
메탄올/DCM을 기반으로 delipida...

최근까지, 지방이 많은 직물 지방 세포의 비정 질 컬렉션으로의 잉태 했다. 지난 몇 년간 우리의 이해 지금 adipocytes, 체형 선구자의 종류, 면역 세포, 섬유 아 세포, 맥 관 구조, 및 신경 예측을 포함 하는 복잡 한 기관 수를 인식 하는 지방으로 더 정교한 성장 했습니다. 이 지방 주민 세포 간의 상호 작용 효과 지방 조직 및 organismal 생리학 및 이상1발음 있다. 신흥 연구 기본 특정 상호 작용 하는 중요 한 분자 메커니즘 unraveled 있다, 하지만 더 포괄적인 이해 안정적인 구조 프로 파일링 3 차원 (3D)에 전체 조직의 필요 합니다.
지방이 많은 직물 형태학의 우리의 현재 지식은 기반 상대적으로 높은 확대 화상 진 찰 (10 X) 가진 얇은 단면도 (5 μ m)의 조직학 분석2,3. 그러나,이 방법은 몇 가지 중요 한 제한이 있다. 첫째, 복잡 한 등 교감 신경 맥 관 구조, 많은 기능4,5,,67에 중요 한 역할을 알려져 있습니다 filamentous 구조는 평가 하기 어려운 통해 얇은 섹션입니다. 둘째, 겉보기 무 조직 모양 및 대표적인 구조 단위에 초점의 부족, 그것은 지방 조직 구조 섹션 얼룩에 기반으로 감사 어렵다. 셋째, 지방 조직 취득 3D 해 부 재건, 전체 두뇌 형태학8을 연구 하는 데 사용 하는 기존의 방법에 대 한 적합 한 일관 된 직렬 섹션에 과제를 만드는 매우 높은 지질 내용을 있습니다. 이러한 요소를 감안할 때, 아직도 세포 해상도 달성 하면서 전체 지방 서비스 센터의 3D 시각화를 제공할 수 있는 전체-마운트 접근에 대 한 중대 한 필요가 있다.
전체 장기의 3 차원 체적 영상 도전 가벼운 살포의 가려지는 효과 때문 이다. 생물 학적 조직의 빛 분산의 주요 원천이 지질 수성 인터페이스에서 온다. 지질을 제거 하 여 피해를 제거 하는 노력에 대 한 지속적인 세기 왔다, 하지만 많은 수의 최근 혁신9되었습니다. 하나 같은 새로 개발 조직-개간 방법은 용 매 허가 기관의 immunolabeling 기반 3D 이미징 (iDISCO / iDISCO +)10,11. 그러나 지방 조직 특정 도전 주어진 지질 높은 수준을 제공 하는, 따라서는 iDISCO 추가 수정 / iDISCO + 프로토콜 완전히 붕괴에서 조직을 보호 하면서 지질을 추출 하는 데 필요한. 수정된 프로토콜을 개발 했습니다, 지금은 Adipo 클리어 라는 고해상도 체적 영상12에 적합 최적의 투명도 달성 하기 위해 지방이 많은 직물의 메탄올/dichloromethane 기반 delipidation를 사용 합니다. delipidation 단계 크게 표현 endogenously 냉각 형광 단백질 GFP와 RFP, 때문에 immunolabeling에 의해 이러한 단백질의 시각화를 달성 해야 합니다. 전반적으로,이 간단 하 고 강력한 프로토콜 지방 주민 세포의 조직 수준 조직 연구에 적용할 수 있는 개발 하는 동안 체형 조상 세포, 그리고 지방 morphogenesis의 혈통 추적.

<table><tbody><tr><td>1x 인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 30%</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>벤질 에테르</td><td>시그마 알드리치</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>인비트로겐</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>토끼 다클론 항티로신 하이드록실라제</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>염소 다클론 항-CD31/PECAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td>2 & 마이크로의 최종 농도; g/mL</td></tr><tr><td>쥐 단클론 항-CD68, 클론 FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>최종 농도 2 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>5-10 &micro의 최종 농도; g/mL</td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>5-10 &micro의 최종 농도; g/mL</td></tr><tr><td>당나귀 항쥐 IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>5-10 &micro의 최종 농도; g/mL</td></tr><tr><td>이미징 챔버</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>광 시트 현미경</td><td>LaVision BioTec Ultramicroscope</td><td>II</td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>현미경 시각화 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

지방 조직 에너지 항상성 및 체온 조절에 중심 역할을 한다. 그것은 다른 유형의 adipocytes, 뿐 아니라 체형 선구자, 면역 세포, 섬유 아 세포, 혈관 및 신경 예측 구성 됩니다. 셀 형식 지정의 분자 제어 하 고 이러한 세포의 상호 작용 점점 입각, 비록이 지방 주민 세포의 보다 포괄적인 이해 그들의 배포 아키텍처를 시각화 하 여 달성 될 수 있다 통해 전체 조직. 기존 immunohistochemistry 면역 형광 접근 지방 조직학 분석을 얇은 파라핀 포함 된 섹션에 의존 합니다. 그러나, 얇은 섹션 조직;의 작은 부분만 캡처 그 결과, 결론 조직의 어떤 부분을 분석 하 여 편견 수 있습니다. 따라서 전체 adipose 조직에 분자 및 세포 패턴의 포괄적인 3 차원 시각화를 허용 기법, Adipo-명확 하 고, 삭제 하는 지방 조직 개발 했습니다. Adipo 클리어 iDISCO에서 적응 / iDISCO +, 특정 수정에 게 완전히 제거 하는 기본 조직 형태를 유지 하면서 조직에 저장 된 지질. 함께 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 여기는 전체 지방 조직의 고해상도 체적 이미지를 Adipo Clear 메서드를 사용 하 여를 설명 합니다.

Adipo 명확한 준비 전체 지방 패드 조직 형태 및 세포질 상호 작용 고 비만 상태에 영향을 분석 하는 차원에서 몇 군데 있습니다. 이 메서드는 녹색 채널에 조직 autofluorescence 신호를 수집 하 여 일반 지방 구조 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리가 이전 것으로 나타났습니다는 autofluorescence 지방 오버레이 perilipin 얼룩, 성숙한 adipocytes12개요 일반적으로 사용 되는 마커와 호의에 신호. 예를 들어 후부 피하 지방 패드 (psWAT) 낮은 확대 (1.3 X)와 함께 빛 시트 현미경을 사용 하 여 스캔 (그림 1A 및 B) adipocytes의 lobular 조직 보여 줍니다. Adipocytes, 크기 등의 자세한 정보 (그림 1 c 와 <...

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

이 방법은 지방 조직의 다양한 구성 요소가 전체 조직에서 어떻게 상호 작용하는지와 같은 지방 조직 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 지방 조직에 저장된 과도한 지질을 완전히 제거하면서 3차원 구조를 유지한다는 것입니다. 이 방법은 지방 조직의 3차원 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 일반적으로 기억선 및 림프절과 같은 지질 함량이 높은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.탈lipidation 및 세척 단계에는 결정하기 어려울 수 있는 충분한 배양 시간이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 갓 관류된 동물 모델에서 관심 있는 지방 패드를 해부하기 위해 뭉툭한 끝 집게를 사용하여 시작합니다. 조직을 꼬집거나 짜거나 절개된 조직을 털로 오염시키지 않도록 전체 유행 패드를 조심스럽게 제거하십시오.15ml 원추형 튜브에 약 10ml의 고정 용액에 지방 패드를 놓고 밤새 섭씨 4도에서 고정합니다. 다음 날 PBS로 샘플을 세척한 후 해부 현미경으로 샘플에서 이물질을 부드럽게 제거합니다. 샘플에 부착된 머리카락, 보푸라기 또는 기타 파편은 이미징 중에 그림자를 유발할 수 있습니다.깨끗한 샘플을 얼음처럼 차가운 20% 메탄올 B1N 완충액이 들어 있는 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 샘플이 들어있는 튜브를 오비탈 쉐이커에 수평으로 놓고 100RPM으로 설정한 다음 샘플의 크기에 따라 30분에서 1시간 동안 흔듭니다. 샘플이 튜브 내부에서 자유롭게 이동할 수 있는지 확인합니다.B1N 완충액에서 40%, 60% 및 80% 메탄올의 등급별 시리즈를 통해 샘플을 계속 탈수한 다음 100% 메탄올을 계속 탈수합니다. 캐리오버 솔루션을 최소화합니다. 탈수 후 100% 메탄올 용액을 100% 디클로로메탄 또는 DCM으로 교체하여 샘플을 탈지화합니다.표 2에 나열된 배양 시간에 따라 세척을 두 번 반복합니다. 샘플은 두 번째 및 세 번째 DCM 세척이 끝날 때 튜브 바닥으로 가라앉아야 합니다. 그렇지 않은 경우 완전한 탈lipidation을 보장하기 위해 배양 시간을 연장하십시오.탈lipidation 후 표 2에 표시된 시간 동안 100% 메탄올로 두 번 세척합니다. 표 2에 표시된 시간 동안 역메탄올 B1N 완충액 시리즈에서 샘플을 재수화합니다. 재수화 후 PTXWH 버퍼로 샘플을 실온에서 2시간 동안 세척합니다.이제 샘플은 면역 염색 준비가 되었거나 최대 1년 동안 섭씨 4도의 PTXWH 버퍼에 보관할 수 있습니다. 먼저 PTXWH 완충액의 1차 항체를 권장 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석된 항체 용액을 20,000G에서 10분 동안 원심분리하여 항체 침전물 또는 응집체가 유입되는 것을 방지합니다.메탄올 및 DCM 처리와 호환되는 적절한 1차 항체를 선택하는 것이 중요합니다. 새로운 항체는 작은 조직 조각 또는 메탄올 처리된 조직 절편으로 검증해야 합니다. 탈지질된 검체를 검체의 크기에 따라 3-5일 동안 1차 항체 용액으로 배양합니다.1차 배양 후 PTXWH 완충액을 여러 번 변경하여 샘플을 세척합니다. 다음날, PTXWH 완충액의 2차 항체를 권장 농도로 희석합니다. 이전과 같이 희석된 항체 용액을 원심분리한다.검체의 크기에 따라 3-5일 동안 2차 항체 용액으로 검체를 배양합니다. 다시 말하지만, 이전과 같이 일련의 배양 단계에서 PTXWH 버퍼로 샘플을 세척합니다. 다음날 1XPBS로 샘플을 5분, 10분, 30분 동안 세척합니다.아가로스에 지방 조직을 삽입하여 광시트 현미경 검사를 위한 샘플 장착을 용이하게 합니다. 먼저 1XPBS에 1% 아가로스가 함유된 임베딩 용액을 준비합니다. 샘플이 과도한 열에 노출되지 않도록 매립 용액을 약 섭씨 40도로 냉각합니다.액체가 이월되는 것을 피하면서 세척된 조직 샘플을 금형에 넣고 원하는 위치에 배열합니다. 그런 다음 기포를 피하면서 샘플 위에 매립 용액을 부드럽게 붓습니다. 모든 기포는 아가로스가 응고되기 전에 주변부로 이동해야 합니다.아가로스가 완전히 응고되면 샘플이 들어 있는 블록을 잘라냅니다. 샘플을 물 속의 25% 메탄올로 옮기고 빛으로부터 보호하며 표 2와 같은 시간 동안 흔들면서 배양합니다. 메탄올 구배를 통해 샘플을 계속 탈수합니다.100% DCM에서 1시간 동안 진탕과 함께 샘플을 배양합니다. DCM 세척된 샘플은 공기 중에서 쉽게 건조되어 샘플의 선명도에 영향을 미치고 이미지가 흐려집니다. 건조를 방지하기 위해 샘플을 새로운 용액으로 신속하게 옮기는 것이 중요합니다.샘플은 각 DCM 세척이 끝날 때 튜브 바닥으로 가라앉아야 합니다. 굴절률 일치를 달성하기 위해 약한 흔들기로 Dibenzyl ether 또는 DBE에서 밤새 샘플을 배양합니다. 샘플은 결국 투명하고 보이지 않는 빛이 될 것입니다.다음날, 2시간 동안 가벼운 흔들림과 함께 새로운 DBE로 샘플을 배양한 후 샘플을 어두운 실온에서 보관하거나 바로 이미징을 진행합니다. DBE와 호환되는 광시트 현미경으로 샘플을 이미징하려면 이미징 중 움직임을 방지할 수 있는 홀더에 아가로스 내장 샘플을 장착합니다. 도립 컨포칼 또는 이광자 현미경으로 샘플을 이미지화하려면 아가로스가 내장된 샘플을 바닥이 유리인 챔버 슬라이드에 넣습니다.광시트 현미경을 사용하여 저배율로 후방 피하 지방 패드를 스캔하면 지방세포의 소엽 조직을 볼 수 있습니다. Adipocytes의 크기와 같은 보다 자세한 정보는 더 높은 배율로 관심 영역을 확대하여 밝힐 수 있습니다. 교감신경계의 마커인 Tyrosine Hydroxylase로 염색된 후방 피하 지방 패드를 광시트 형광 현미경으로 이미지화했습니다.TH 염색은 여기 화살표로 표시된 것처럼 큰 신경 다발로 보이는 구조를 드러냈습니다. 조직 실질(Parenchyma)의 조밀한 말단 arborization뿐만 아니라 혈관 신경 분포(bloodvessel neurovation)도 TH 염색에 의해 밝혀집니다. 혈소판 내피 세포 접착 분자 또는 CD31이라고도 하는 PCAM1을 혈관을 표지하는 마커로 사용하면 모든 Adipocyte가 전체 조직의 모세혈관과 접촉하여 지방의 효율적인 영양분 및 산소 교환에 대한 높은 수요를 지원하는 것이 관찰됩니다.개발 후 이 기술은 지방 생물학 분야의 연구자들이 초기 조직 형태 형성 및 지방 세포 전구 세포의 운명 매핑과 같은 추가 질문을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 또한 인간 지방 조직의 조직학을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 파라포름알데히드, 메탄올, 디클로로메탄 및 디벤질 에테르로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 및 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

큰 조직 내에서 형광 표지된 세포의 고해상도 이미지를 얻으려면 이상적으로는 생물학적 샘플을 절편 없이 이미지화해야 합니다. 3DISCO는 유기 용매를 사용한 순차적 배양을 기반으로 하는 간단한 조직 세척 절차입니다. 투명화되면 장기가 투명해져 표본의 종단 간 레이저 스캔이 가능합니다.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

때문에 비만 및 다른 동반 질환의 급격한 음의 연결, 역할 지방에 대한 연구는 질병에 재생 및 전반적인 건강을 보증합니다. 우리는 고립과 현장에서 사용하여 지방의 연구를 허용 지방 창고의 절제 및 생체 외 방법에 프로토콜을 제시한다.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

새로운 혈관 형성 및 동 정적인 신경 분포 개장 하는 지방 조직에서 중추적인 역할을 재생합니다. 그러나, 시각화 및 양적 측정 지방 조직에 기술적인 문제가 남아 있다. 여기 우리는 성공적으로 레이블 및 양적 혈관과 다른 adipose 조직에 신경 섬유의 밀도 비교 하는 프로토콜을 제시.

혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

여기서, 우리는 형광 화상 진찰에 의하여 혈관, 핵, 면역 세포, 뉴런 및 지질 물방울 외투 단백질을 시각화하기 위하여 마커의 조합을 사용하여 마우스와 인간 백색 지방 조직의 3D 구조를 해결하는 간단하고 저렴하고 빠른 청산 방법을 기술합니다.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

여기에서는 쥐 대동맥을 3차원(3D)으로 이미지화하기 위해 최적화된 조직 제거 프로토콜을 제시합니다. 우리는 면역 염색, 광학 제거 및 이미징에 대한 최첨단 절차를 설명하며, 죽상 경화성 플라크가 있는 말초 신경계의 해부학적 근접성과 죽상 경화증의 외막을 정의하기 위해 설명합니다.

죽상동맥경화증에서 대동맥 조직의 3차원 이미징

단백질은 별개의 굴지 구속력이 모듈을 통해 filamentous 굴지 (F - 굴지)에 바인딩합니다. 이 비디오에서 우리는 굴지의 절차를 정기적으로 단백질이나 F - 굴지 바인딩 특정 도메인을 분석하는 데 사용되는 시험 관내 분석이다 공동 침전을 보여줍니다.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

학습하세요 Adipo-Clear 조직 투명화 기법을 이용한 지방 조직의 3차원 고해상도 이미징 방법을. 과다 지질을 제거하면서 3차원 구조를 보존하여 지방세포와 혈관, 신경의 상호작용을 정밀 분석할 수 있습니다.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

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