Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

이 방법은 지방 조직의 다양한 구성 요소가 전체 조직에서 어떻게 상호 작용하는지와 같은 지방 조직 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 지방 조직에 저장된 과도한 지질을 완전히 제거하면서 3차원 구조를 유지한다는 것입니다. 이 방법은 지방 조직의 3차원 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 일반적으로 기억선 및 림프절과 같은 지질 함량이 높은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

탈lipidation 및 세척 단계에는 결정하기 어려울 수 있는 충분한 배양 시간이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 갓 관류된 동물 모델에서 관심 있는 지방 패드를 해부하기 위해 뭉툭한 끝 집게를 사용하여 시작합니다. 조직을 꼬집거나 짜거나 절개된 조직을 털로 오염시키지 않도록 전체 유행 패드를 조심스럽게 제거하십시오.

15ml 원추형 튜브에 약 10ml의 고정 용액에 지방 패드를 놓고 밤새 섭씨 4도에서 고정합니다. 다음 날 PBS로 샘플을 세척한 후 해부 현미경으로 샘플에서 이물질을 부드럽게 제거합니다. 샘플에 부착된 머리카락, 보푸라기 또는 기타 파편은 이미징 중에 그림자를 유발할 수 있습니다.

깨끗한 샘플을 얼음처럼 차가운 20% 메탄올 B1N 완충액이 들어 있는 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 샘플이 들어있는 튜브를 오비탈 쉐이커에 수평으로 놓고 100RPM으로 설정한 다음 샘플의 크기에 따라 30분에서 1시간 동안 흔듭니다. 샘플이 튜브 내부에서 자유롭게 이동할 수 있는지 확인합니다.

B1N 완충액에서 40%, 60% 및 80% 메탄올의 등급별 시리즈를 통해 샘플을 계속 탈수한 다음 100% 메탄올을 계속 탈수합니다. 캐리오버 솔루션을 최소화합니다. 탈수 후 100% 메탄올 용액을 100% 디클로로메탄 또는 DCM으로 교체하여 샘플을 탈지화합니다.

표 2에 나열된 배양 시간에 따라 세척을 두 번 반복합니다. 샘플은 두 번째 및 세 번째 DCM 세척이 끝날 때 튜브 바닥으로 가라앉아야 합니다. 그렇지 않은 경우 완전한 탈lipidation을 보장하기 위해 배양 시간을 연장하십시오.

탈lipidation 후 표 2에 표시된 시간 동안 100% 메탄올로 두 번 세척합니다. 표 2에 표시된 시간 동안 역메탄올 B1N 완충액 시리즈에서 샘플을 재수화합니다. 재수화 후 PTXWH 버퍼로 샘플을 실온에서 2시간 동안 세척합니다.

이제 샘플은 면역 염색 준비가 되었거나 최대 1년 동안 섭씨 4도의 PTXWH 버퍼에 보관할 수 있습니다. 먼저 PTXWH 완충액의 1차 항체를 권장 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석된 항체 용액을 20,000G에서 10분 동안 원심분리하여 항체 침전물 또는 응집체가 유입되는 것을 방지합니다.

메탄올 및 DCM 처리와 호환되는 적절한 1차 항체를 선택하는 것이 중요합니다. 새로운 항체는 작은 조직 조각 또는 메탄올 처리된 조직 절편으로 검증해야 합니다. 탈지질된 검체를 검체의 크기에 따라 3-5일 동안 1차 항체 용액으로 배양합니다.

1차 배양 후 PTXWH 완충액을 여러 번 변경하여 샘플을 세척합니다. 다음날, PTXWH 완충액의 2차 항체를 권장 농도로 희석합니다. 이전과 같이 희석된 항체 용액을 원심분리한다.

검체의 크기에 따라 3-5일 동안 2차 항체 용액으로 검체를 배양합니다. 다시 말하지만, 이전과 같이 일련의 배양 단계에서 PTXWH 버퍼로 샘플을 세척합니다. 다음날 1XPBS로 샘플을 5분, 10분, 30분 동안 세척합니다.

아가로스에 지방 조직을 삽입하여 광시트 현미경 검사를 위한 샘플 장착을 용이하게 합니다. 먼저 1XPBS에 1% 아가로스가 함유된 임베딩 용액을 준비합니다. 샘플이 과도한 열에 노출되지 않도록 매립 용액을 약 섭씨 40도로 냉각합니다.

액체가 이월되는 것을 피하면서 세척된 조직 샘플을 금형에 넣고 원하는 위치에 배열합니다. 그런 다음 기포를 피하면서 샘플 위에 매립 용액을 부드럽게 붓습니다. 모든 기포는 아가로스가 응고되기 전에 주변부로 이동해야 합니다.

아가로스가 완전히 응고되면 샘플이 들어 있는 블록을 잘라냅니다. 샘플을 물 속의 25% 메탄올로 옮기고 빛으로부터 보호하며 표 2와 같은 시간 동안 흔들면서 배양합니다. 메탄올 구배를 통해 샘플을 계속 탈수합니다.

100% DCM에서 1시간 동안 진탕과 함께 샘플을 배양합니다. DCM 세척된 샘플은 공기 중에서 쉽게 건조되어 샘플의 선명도에 영향을 미치고 이미지가 흐려집니다. 건조를 방지하기 위해 샘플을 새로운 용액으로 신속하게 옮기는 것이 중요합니다.

샘플은 각 DCM 세척이 끝날 때 튜브 바닥으로 가라앉아야 합니다. 굴절률 일치를 달성하기 위해 약한 흔들기로 Dibenzyl ether 또는 DBE에서 밤새 샘플을 배양합니다. 샘플은 결국 투명하고 보이지 않는 빛이 될 것입니다.

다음날, 2시간 동안 가벼운 흔들림과 함께 새로운 DBE로 샘플을 배양한 후 샘플을 어두운 실온에서 보관하거나 바로 이미징을 진행합니다. DBE와 호환되는 광시트 현미경으로 샘플을 이미징하려면 이미징 중 움직임을 방지할 수 있는 홀더에 아가로스 내장 샘플을 장착합니다. 도립 컨포칼 또는 이광자 현미경으로 샘플을 이미지화하려면 아가로스가 내장된 샘플을 바닥이 유리인 챔버 슬라이드에 넣습니다.

광시트 현미경을 사용하여 저배율로 후방 피하 지방 패드를 스캔하면 지방세포의 소엽 조직을 볼 수 있습니다. Adipocytes의 크기와 같은 보다 자세한 정보는 더 높은 배율로 관심 영역을 확대하여 밝힐 수 있습니다. 교감신경계의 마커인 Tyrosine Hydroxylase로 염색된 후방 피하 지방 패드를 광시트 형광 현미경으로 이미지화했습니다.

TH 염색은 여기 화살표로 표시된 것처럼 큰 신경 다발로 보이는 구조를 드러냈습니다. 조직 실질(Parenchyma)의 조밀한 말단 arborization뿐만 아니라 혈관 신경 분포(bloodvessel neurovation)도 TH 염색에 의해 밝혀집니다. 혈소판 내피 세포 접착 분자 또는 CD31이라고도 하는 PCAM1을 혈관을 표지하는 마커로 사용하면 모든 Adipocyte가 전체 조직의 모세혈관과 접촉하여 지방의 효율적인 영양분 및 산소 교환에 대한 높은 수요를 지원하는 것이 관찰됩니다.

개발 후 이 기술은 지방 생물학 분야의 연구자들이 초기 조직 형태 형성 및 지방 세포 전구 세포의 운명 매핑과 같은 추가 질문을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 또한 인간 지방 조직의 조직학을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 파라포름알데히드, 메탄올, 디클로로메탄 및 디벤질 에테르로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 및 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.