5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

이 방법은 유사분열 후 망막에서 망막 발달 중 염색질의 변화와 같은 DNA 메틸화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유사한 접근법으로 처리되는 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신 분포를 가진 모든 마우스 망막 조직의 모든 절편에 견고하게 사용할 수 있다는 것입니다. 조직 준비 및 염색 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요한데, 이는 동결된 조직학적 준비를 사용하는 경우 귀중한 조직 및 원래 조직을 잃을 수 있기 때문입니다.

나머지 절차는 우리 실험실의 연구원인 Pablo Diaz가 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 29 게이지 1/2인치 바늘을 사용하여 목이 잘린 안락사된 쥐의 눈 등 쪽에 구멍을 뚫습니다. 눈컵을 얻으려면 즉시 미세한 안과 가위로 공막 주위를 잘라 각막과 수정체를 제거함으로써 눈을 적출하십시오.

눈컵과 E16 눈 전체를 4% 파라포름알데히드 또는 PFA를 1xPBS pH 8.0의 실온에서 20분 동안 고정합니다. 실온에서 10분 동안 1ml의 1xPBS에 두 번 세척합니다. 눈컵과 눈 전체를 동결 보호하려면 10% 자당과 함께 1xPBS pH 8.0에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 1시간 동안 1xPBS에서 20% 자당. 그리고 마지막으로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1xPBS의 30% 자당. 다음 날, 크라이오몰드에 아이컵과 눈을 최적 절단 온도 컴파운드(OCT)에 삽입합니다.

그런 다음 드라이 아이스 에탄올 욕조에서 얼리고 섭씨 80도로 유지합니다. 동결 절편을 시작하기 전에 섭씨 80도에서 안대와 안구가 내장된 주형을 제거하십시오. 저온 유지 장치 홀더에 넣고 1시간 동안 섭씨 20도까지 평형을 이룹니다.

섭씨 20도에서 저온 유지 장치를 사용하여 시신경두를 통해 측두축과 평행하게 12마이크로미터 두께의 망막 단면을 절단합니다. 현미경 슬라이드에 절편을 장착하고 섭씨 80도에서 보관하십시오. 면역 염색을 시작하려면 소수성 차단 펜을 사용하여 슬라이드에 장착된 망막 부분을 둘러쌉니다.

200마이크로리터의 1xPBS로 10분 동안 섹션을 한 번 세척합니다. 실온에서 10분 동안 200마이크로리터의 PBST로 절편을 투과시킵니다. 그런 다음 5mC 신호를 최적화하기 위해 섭씨 37도에서 45분 동안 1xPBS에서 2개의 일반 염산을 신중하게 적정한 200마이크로리터로 변성시킵니다.

변성 후 망막 부위에 0.1 Tris-HCl pH 8.3 100마이크로리터를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 중화시킵니다. 그런 다음 500마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다. 그리고 절편을 실온의 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.

차단 용액에 1에서 500까지 희석한 적절한 항체를 섹션에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날에는 0.1% PBST로 10-15분 동안 섹션을 세 번 세척합니다. DAPI 용액이 함유된 차단 용액에 1에서 1000까지 희석한 적절한 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 첨가합니다.

다음으로, 0.1%PBST 1밀리리터로 슬라이드를 각각 10분씩 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 수성 장착 매체를 추가합니다. 커버 슬립으로 덮으십시오.

그런 다음 컨포칼 현미경 검사를 진행합니다. E16에서 망막 면역염색 후, 5mC 신호는 세포핵의 염색체에서 강하게 나타났으며, 전체 세포핵에서는 훨씬 낮은 수준으로 존재하였습니다. 5hmC 염색은 세포핵에서만 발견되었으며 염색 중심에는 없었습니다.

P0 망막에서는 5mC 및 5hmC 신호가 모두 외부 신경아세포층과 내부 신경아세포층에 존재했습니다. 5mC 신호는 세포핵의 염색체와 핵 주변에서 강했고, 세포핵의 염색체 사이에서는 더 약했습니다. 5hmC 염색은 세포핵으로 제한되었습니다.

P15 망막의 바깥쪽 핵층에서는 세포핵과 핵 주변부의 발색체에서 5mC 신호가 감지되었습니다. 반면 5hmC 신호는 염색중심을 제외한 전체 세포핵에 있었습니다. 내부 핵 및 신경절 세포층에서 5mC 신호는 세포핵의 발색층에서 강하고 전체 세포핵에서 약했습니다.

반면 5hmC 신호는 염색중심을 제외한 전체 세포핵에서 발견되었습니다. 성체 간상 광수용체에서 5mC 신호는 염색중심과 핵 주변부로 제한되는 반면, 5hmC 신호는 핵 주변부로 제한되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 HCl의 최적 노출(30분)로 조직학적 절편을 치료하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

노출이 적거나 많으면 최적의 결과를 재현할 수 없습니다. 이 절차에 따라 고압 액체 크로마토그래피, 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 측정 시 변화 정량화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경 발달 분야의 연구자들이 염색질의 후성유전학적 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

HCl 및 PFA로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 폐기와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.