Name: 5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 마우스 망막에서 5mC와 5hmC의 면역조직화학적 검출 방법을 통해 후유사분열기 망막 발달 중 염색질 변화를 연구하는 기법입니다. 이 프로토콜은 신경발생 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 지원 SBIR 교부 금 (1R44EY027654-01A1)에 의해.

아동 병원 오클랜드 연구소 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 및 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 문에서 연구 협회 준수 프로토콜에 따라 마우스와 모든 절차 수행 했다 안과에서 동물의 연구 비전 및.
1. 조직 준비 Immunostaining
<ol><li>C57 BL/6J 생쥐 배아 하루 (E) 16, 산 후 (P)에서 안락사 0, P15와 p90 받게 이산화탄소 (CO2) 잘린 (E16와 P0 쥐)에 의해 다음에 의해.</li>
	<li>즉시 enucleate 마우스 눈 29G 1/2는 눈의 등 쪽에 바늘으로 구멍. 인산 염 버퍼 식 염 수 (1 x PBS) ph 8.0 실 온에서 5 분 (최소) 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL에 품 어.</li>
	<li>눈 컵 P0, P15, p90 받게, 각 막을 밖으로 해 부와 눈이 4%에 있는 동안 좋은 안과 위 렌즈 PFA. 참고: 건너뛰기 E16 눈은 눈으로이 단계는 너무 작은.</li>
	<li>수정 눈 컵 (P0, P15와 p90 받게)와 전체 눈 (E16) 4 %PFA에서 실 온에서 20 분. 다음 실 온에서 10 분의 1 x PBS의 1 mL에 두 번 눈 컵 및 전체 눈을 씻어.</li>
	<li>Cryoprotect 눈 컵 그리고 1xPBS, pH 8.0 포함 10% 자당 1 시간 동안에 전체 눈. 1 시간 동안 20% 자당 1 x PBS에 유지 하 고 4 ° c.에 하룻밤 1 x PBS에서 30% 자당 포화</li>
	<li>다음 날, 최적의 절삭 온도 화합물에 (10 월), (500 µ L) cryomolds에서 눈 컵 및 전체 눈을 포함, 스냅-동결 드라이 아이스/에탄올 목욕에서과-80 ° c.에 저장</li>
	<li>-80 ° C에서 임베디드 눈 컵 및 전체 눈 금형 제거과 cryosectioning 전에 1 시간 동안-20 ° C에 equilibrate 수 있습니다.</li>
	<li>잘라 망막 횡단면 (12 µ m 두께) 축에 평행 temporonasal-20 ° c.에 있는 cryostat를 사용 하 여 시 신경 머리를 통해</li>
	<li>현미경 슬라이드53 -80 ° c.에가 게에 망막 섹션을 탑재</li>
</ol>2. Immunostaining 5-엠씨 및 5-hmC 항 체와
<ol><li>소수 성 장벽 펜으로 슬라이드에 장착 된 망막 섹션을 둘러싸십시오 소수 성 장벽을 펜 얼룩 조직 하는 데 필요한 항 체의 볼륨을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>10 분의 1 x PBS의 200 µ L 한번 망막 섹션을 씻어.</li>
	<li>0.1%의 200 µ L로 망막 섹션 permeabilize 실 온에서 10 분의 1 x PBS (PBS-T)에 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>변성 망막 섹션의 200 µ L 30 분 동안 37 ° C 배양 기에서 1 x PBS에 갓 2 N (HCl) 염 산을 만든. 참고: HCl 치료의 주의 적정 5mC 신호를 최적화 하기 위해 필요 합니다.</li>
	<li>항상 5mC 신호54를 최적화 하는 동안 생물 복제 (3-4)를 포함 합니다. 참고: 우리가 4 시간 포인트 (15 분, 30 분, 1 시간 및 2 시간)에서 항 원 검색 그리고 발견된 30 분 인큐베이션 5mC 신호에 대 한 최적입니다. HCl 가진 더 긴 외피 5mC 신호는 핵을 지역화 하는 무 능력으로 이어지는 핵의 구조 저하 됩니다.</li>
	<li>변성, 후 중화 망막 섹션 0.1의 100 µ L을 추가 하 여 10 분 동안 망막 부분에 트리 스-HCl (pH 8.3) M.</li>
	<li>차단 하는 솔루션의 500 µ L에 섹션을 품 어 (0.1%에서 5 %preimmune 정상 염소 혈 청 1 x PBS에 Triton X-100) 습도 챔버에 실 온에서 1 h.</li>
	<li>차단, 추가 안티-5mC; 안티-5hmC 항 체 희석 망막 섹션에 솔루션을 차단에 1: 500.</li>
	<li>망막 섹션 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤을 품 어.</li>
	<li>다음 날 세척, 망막 섹션 3 0.1% (10-15 분 각 시간) 시간 PBS-T 다음 해당 보조 항 체와 함께 솔루션을 차단에 품 어 고 (염소 안티 토끼와 염소 반대로 마우스 IgG, 희석; 1:1000), DAPI (4', 6-를 포함 하 diamidino-2-phenylindole) 솔루션 (1 µ g/mL) 솔루션을 차단에 1 시간을 위한 실내 온도에. 참고: 섹션의 immunodetection의 모든 단계 동안 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>씻어 슬라이드 1 mL의 0.1%와 3 시간 PBS.</li>
	<li>마지막 세척 후 수성 장착 매체는 coverslip 아래 섹션을 탑재 하 고 무색 매니큐어와 함께 인감.</li>
</ol>3. confocal Immunohistochemistry
<ol><li>항상 한 가지 방법 (예를 들어, 최대), 일관성에 대 한 직면 시 컵의 망막 색소 상피 면을 섹션을 방향을 정하십시오.</li>
	<li>Immunostained 망막 섹션 63 X에서 (대물 렌즈의 배율) 2 X의 이미지 캡처를 수행 또는 3 배 줌.</li>
	<li>각 선택 된 이미지의 여러 광학 섹션 생성 (z-스택) 모든 3 채널 (빨강, 녹색 및 파랑 RGB)에 0.35 µ m 단계를 사용 하 여. 참고: 견본 10-20 X에서 시각의 최종 배율 (대물 렌즈의 배율) 될 것입니다 63 X, 각각, (일반적으로 사용 되는) 10 배 눈 렌즈와 함께. 5mC와 5hmC 신호를 찾으려고 압축된 광학 스택을 시각화합니다</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

DNA 메 틸 화와 hydroxymethylation는 역동적이 고 가역 DNA 수정, modulatethe는 개발 뿐만 아니라 postmitotic 세포에서 생물 학적 메커니즘의 다양 한 범위. 여기, 우리가 설명 하는 단원의 paraformaldehyde 고정 냉동 마우스 망막의 immunohistochemical 기술 (안티-5mC와 안티-5hmC 항 체를 사용 하 여)에 의해 5mC와 5hmC DNA 수정에서 제자리에서 탐지 하기 위한 재현 기법 제공 개선 하 고 여러 다른 견본을 비교 하는 경우에 특히, 결과 표준화 지침. 우리 이전 5mC 변경 Dnmt1, Dnmt3a 및 Dnmt3b DNA methyltransferase 유전자를 망막 특정 프로세서용으로 마우스 망막에 윤곽을 그리 다이 메서드를 사용 하 고 보고 그들의 망막7에에서 5mC 마크 (예상된) 고갈 .
5mC immunohistochemical 감지에 중요 한 단계는 HCl 조직학 섹션의 처리의 최적화: HCl와 과도 한 치료는 핵을 파괴 하는 반면 15 분 전처리 재현성 결과 생산 하지 예상 보다 적은 아키텍처입니다. 우리는 HCl과 30 분 부 화 후 최상의 결과 발견. 우리는 항상 DNA 변성 및 망막 조직 고정을 위한 갓 희석된 HCl와 갓 만든된 4 %PFA 솔루션을 사용 하는 것이 좋습니다.
결과 해결 하려면 5mC 신호를 최적화 하는 동안 3 ~ 4 생물 복제를 포함 하도록 권장 합니다. 각각의 설정 하는 동안 immunohistochemical 얼룩 생성할 수 있습니다 약간 다른 결과 (다소 밝은 heterochromatic 지구를), 개별 집합 내의 immunohistochemical 방법, 5mC 및 5hmC 핵 분포에 예상 되는 섹션의 프로토콜 다음으로 재현성에 대 한 것으로 예상 된다.
이 기술은 또한 있다 제한 우리가 일관 되 게 동일한 섹션 포토 리셉터 세포 핵에 5mC 유통에서 변화 관찰. 우리는 인접 한 세포 핵 보였다 5mC 신호 하는 동안 강한 5mC 신호를 보여 일부 핵을 발견. 이것은 냉동된 섹션에서 HCl 처리에 의해 unmasking 5mC 항 한계 때문 이다.
이 기술의 중요성 DNase 및 가수분해 K 치료 chromocenters의 더 나은 보존을 선도 하지 않고 5mC 지역화를 수 있습니다. 이 기술은 모든 척추 동물의 조직, 운반 5mC, 5hmC 마크에서 어떤 섹션에 견고 하 게 작동 하는 것으로 예상 하 고 프로토콜 다음으로 뿐만 아니라 마우스 망막, 비슷한 방식으로 처리.

개발의 후 성적인 규정 및 마우스 망막의 postmitotic 항상성 retinogenesis 및 세포 운명 결정 제어 생물 학적 메커니즘에 대 한 새로운 이해를가지고 어떤 약속 셀 형식 관련 연구의 흥미로운 영역입니다. 신진 대사 기능, 세포 병 리, 세포 죽음 및 중생1,2,3,,45,6,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 스트레스, 대사 또는 세포 죽음 자극6,,1415, chromatin 가변 외부 신호에 대 한 응답에서 뿐만 아니라 개발, 동적 변화를 겪 습 16 , 17 , 18. 마우스 핵 chromatin 활성 euchromatin 및 비활성 섬으로6,,1920으로 분할 된다. Interphase 핵에 euchromatin 섬으로 라인 핵 주변 및 핵소체 반면 핵의 내부 영역에 상주 합니다. 이 패턴은 기존의 불리고 진핵생물에서 고도로 보존. 반면, 마우스와 쥐 같은 야행성 동물에 막대 핵 핵 섬으로 둘러싸인 euchromatin 바깥쪽 껍질6,18, 형성 하는 센터에 의해 점유 된다 패턴 거꾸로 있다 20. 출생 시, 로드 핵 기존의 핵 건축이 있다. 막대 핵의 반전 기존의 핵 건축 리 모델링 하 여 개발 하는 동안 발생 합니다. 이 과정 동안, 주변 섬으로 핵 주변에서 분리 하 고 chromocenters 융합 센터에서 단일 chromocenter 형태의 핵6,18.
게놈 DNA 메 틸 화 제어 로컬 chromatin 구조21에 참여 합니다. DNA 메 틸 화는 5' 풍성 하 게 CpG 디의 시 토 신 잔류물의 마우스 게놈22,23,,2425,26 에 많은 유전자의 발기인 지구에 있는 위치에서 발생 뿐만 아니라 intergenic intron 지역, 규제 요소27을 수행. 근 위 발기인21,24 에 CpG 섬 및 유전자 증강27,28 CpG 시퀀스의 메 틸 화는 포함 하는 많은 chromatin의 동적 상태를 조절에 중요 한 발달 유전자/녹음 방송 요인 개발, 암 및 노화29,30,31,32,,3334 에서 중요 한 역 . 3 DNA methyltransferases (DNMTs) 마우스 개발35동안 DNA 메 틸 화에 참여합니다. 모든 3 개의 DNMTs 마우스 망막 개발36 과 Dnmt 유전자 영향 망막 개발2,7망막 특정 변화 하는 동안 표시 됩니다. Hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-methylcytosine (5mC) demethylation의 산화 제품 이다. 3 10-11 전 (TET) 효소 5mC demethylation37,,3839에 참여. Hydroxymethyl C 수정 발기인, 유전자 몸과 유전자 부자와 적극적으로 베낀된 지역27,40intergenic 게놈 시퀀스에 농축입니다.
다양 한 방식의 설명 셀41,,4243,44,45,46에서 DNA 메 틸 화 패턴 변화를 결정 하는 데, 그들 중 일부는 사용 DNA 메 틸 화 CpG 풍부한 지역 발기인과 증강에에서 정확한 변화에 초점을 맞추고 다른 사람들의 세계적인 변화 측정 검색 및 5hmC의 정량화 방법 또한 보고 된47, immunohistochemistry13포함 했다. 5mC와 5hmC 변화에 핵 개발의 강력한 모니터링 활성화 Immunohistochemical 기법, postmitotic 세포, chromatin 역학에서 제자리에서 외부 또는 내부 변화에 대응 묘사에 대 한 매우 유익 하지 않습니다 셀4,13,,4849에 영향을. 그러나,이 접근은 DNA 메 틸 화 및 조직학 준비에서 시 토 신 수정 감지와 관련 된 기술적인 어려움 때문에 hydroxymethylation 변화를 과소 평가 하는 경향이 있다. 이 때문에 비 극성 DNA 기초, 5mC 5hmC 수정 시 토 신 등은 이중 가닥 DNA 나선50의 센터에서 숨겨지고 unmasking 필요. 이것은 가혹한 치료 적용 되 면 원래 조직의 유익한 조직을 잃을 수 있습니다 급속 하 게 냉동된 조직학 준비에서 특히 도전적 이다.
마우스 망막 신경 개발 및 postmitotic 항상성 DNA 메 틸 화에의 기여를 해 부하는 우수한 모델입니다. 뉴런의 6 종류만 있다 (막대와 콘 대뇌, amacrine, 바이 폴라, 수평 및 신경 절 세포), glial 세포 유형 (뮬러 명과) 및 한 neuroepithelial 세포 유형 (망막 안료 상피)51. 망막 세포 유형 DNA 메 틸 화18,19, 최근 단일 기본 해상도1,,59,12공부는의 명백한 본을 보고 했다. 우리는 최근 immunohistochemistry 응용 프로그램 묘사 5mC 성인 마우스 망막, 조건부 타겟팅 하 여 제거 된 모든 3 개의 DNA methyltransferases의 핵의 망막 세포 핵 내에서 분포의 패턴을 보고 7. 보고서, 망막 세포에서 DNA 메 틸 화의 존재는 긍정적 으로만 볼 수 또는 hypermethylated에서 부정적인 신호 겪고 apoptosis 세포의 수에 비해 우리의 접근 활성화 감지 특정 chromatin 우리 여러 그룹 보고 하 고 앞에서 설명한 망막 세포 핵 내 배열5,6,7,,1819,36 , 52. 여기, 우리 뿐만 아니라 우리의 원래 보고서7에서에서 재현 수 있었습니다 데이터 설명 단원의 냉동 paraformaldehyde 고정 조직학 세부 사항에 5mC 및 5hmC를 감지 immunohistochemical (IHC) 기술을 설명 .

<table><tbody><tr><td>용품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>안과 가위</td><td>Fine Science tools, Inc.&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 광학 절단 화합물 (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR 분석&nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>활성 모티프</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 Affini순수 염소 개미 토끼 IgG</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Affini순수 염소 개미 마우스 IgG</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

5-methylcytosine 개발에 5-hydroxymethylcytosine의 immunohistochemical 검출 및 postmitotic 마우스 망막

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Epigenetics 망막 개발의 다양 한 인간의 망막 퇴행 성 질병의 메커니즘에 대 한 이해의 새로운 수준을 약속 새로운 치료 접근을 정확 하 게 잘 공부 연구 분야 이다. 마우스 망막의 핵 아키텍처는 두 개의 서로 다른 패턴 구성: 전통과 반전. 기존의 패턴은 동안 활성 euchromatin 핵 내부에 있는 섬으로, 핵의 주변에 지역화는 보편적 이다.입니다. 반면, 거꾸로 핵 패턴은 섬으로 localizes 핵 센터 및 euchromatin 핵 주변에 있는 성인 봉 포토 리셉터 세포 핵에 고유 합니다. DNA 메 틸 화는 chromocenters에서 주로 관찰 된다. DNA 메 틸 화 CpG 디 많은 유전자의 발기인 지구에 풍성 하 게 하는 시 토 신 잔류물 (5-methylcytosine, 5mC)에 동적 공유 수정입니다. 3 DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A와 DNMT3B) 개발 중 DNA의 메 틸 화에 참여합니다. Immunohistochemical 기술로 검출 5mC은 매우 도전, 결과, 다양성에 기여 하는 5mC 수정 기지를 포함 하 여 모든 DNA 기초는 이중 가닥 DNA 나선 안에 숨겨져 있습니다. 그러나, 개발 하는 동안 5mC 배포의 상세한 묘사 매우 유익 하지 않습니다. 여기, 우리 5mC와 다른 후 성적인 DNA 마커 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 개발에 "오픈", transcriptionally 활성화 chromatin와 colocalizes는 강력한 immunohistochemical 감지에 대 한 재현 기법을 설명 하 고 postmitotic 마우스의 망막

Postmitotic 망막 및 망막 개발 하는 동안 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 분포를 결정 하기 위해 우리 immunostained C57BL/6J 마우스 망막 섹션 E16, P0, P15, p90 받게에서 특정 항 체와 5mC와 5hmC.
E16 5mC 얼룩 했다 세포 핵의 chromocenters에서 강한 동안 전체 세포 핵 (그림 1a)에서 관찰 되었다 약한 얼룩. 세포 핵에 국한 되었다 5hmC 얼룩이 지 고 결 석 했다 chromocenters (그림 1b)에서.
P0 망막 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 2a, 화살표 및 화살표)의 chromocenters에 지역화 되었습니다. 우리는 또한 세포 핵의 chromocenters 사이 5mC의 약한 얼룩이 관찰. 5hmC 신호 chromocenters (그림 2b) 제외한 세포 핵에 강력 하 게 존재 했다. 우리는 더 많은 핵 5mC와 5hmC 내부 neuroblast 레이어 (INBL) (그림 2 c, 점선)에 묻은 게 있다 발견
P15 망막에서 우리는 5mC와 외부 핵 층 (ONL), 안 핵 층 (INL)와 신경 절 세포 층 (GCL) (그림 3)에서 5hmC의 강한 얼룩 다는 것을 발견. ONL (로드 대뇌), 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 3a-3 c, 3 세대)의 chromocenters에 존재 했다. 5hmC 신호는 chromocenters (그림 3-3 층)를 제외한 전체 세포 핵에 발견 되었다. P15 망막에 전송 전자 현미경 검사 법 5mC 항 체 신호 (그림 3 h 와 3i) 발견 비슷한 막대 세포 핵에 heterochromatic 도메인의 분포를 보여줍니다.
INL 및 GCL 5mC 얼룩 세포 핵의 chromocenters에 강한 고 약한 얼룩 전체 세포 핵 (수치 3j-3 l 과 3t 3r)에서 또한 관찰 되었다. 5mC, 반면 5hmC 신호 했다 INL 및 GCL (그림 3 m-3o 및 3u 3w)에서 chromocenters 제외한 전체 세포 핵에 지역화 됩니다. 우리는 강한 관찰 GCL 세포 핵의 주변에서 5hmC 신호.
성인 봉 대뇌에서 5mC 신호 5hmc 신호는 핵 주변 (그림 4 d-4 층)에 국한 되었다 하는 동안 chromocenter 및 세포 핵 (그림 4a-4 c)의 핵 주변에 제한 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> 그림 1입니다. 지 배아 일 16에 방화 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine 5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunostaining (빨강) 및 5hmC (녹색, b). E16, 5mC 신호 세포 핵의 chromocenters에 매우 강하고 또한 훨씬 낮은 수준에서 전체 세포 핵에 존재입니다. 5hmC 얼룩 세포 핵에 독점적으로 수감 했다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> 그림 2입니다. Immunohistochemical 출생 후 하루 0에서 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine의 얼룩. 5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunolabeling (빨강) 및 5hmC (녹색, b). P0 망막 5mC와 5hmC에서는 외부 neuroblast 레이어 (ONBL)와 내부 neuroblast 레이어 (INBL)에 있습니다. 5mC) 신호는 chromocenters (화살표)과 셀 핵 (화살촉)의 핵 주변에 강력 하 게 존재. 5mC의 약한 얼룩 세포 핵의 chromocenters 사이 관찰 됩니다. b) 5hmC 얼룩은 세포 핵에 국한 하 고 강한 신호는 INBL (패널 c에서 점선)에서 관찰 됩니다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> 그림 3입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 마우스 망막에서 출생 후 하루 15에서. 안티-5mC와 5hmC 항 체 (a-g, j-y)와 함께 C57BL/6J 망막의 Immunostaining. 외부 핵 층 (ONL) (막대 대뇌) 5mC 신호에에서 (빨강, 셀 핵 (화살촉, b)의 chromocenters와 일치 한) 일반적으로 고도 (화살표, b) 핵 주변에 localizes. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 신호 (녹색, d)는 chromocenters 제외 하 고 전체 셀 핵에 국한 됩니다. 패널 (녹색)와 f (회색) g 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 패널 h와 나는 heterochromatic 도메인의 산 후 하루 15 보여주는 배포에서 포토 리셉터 핵의 전송 전자 현미경 이미지입니다. 패널 h에 검은 화살표 빨간색 화살표 핵 주변에 있는 섬으로 가리킨 동안 로드 포토 리셉터 핵 내의 heterochromatic 도메인을 가리킨 패널에 빨간 화살촉 단일 로드 포토 리셉터 핵 패널 i. 확대를 가리킵니다. INL (j-q), GCL 세포 핵 (r-y) 5mC 신호 (적색) 주변에 chromocenters를 지역화 하 고 약한 얼룩 감지 세포 핵의 나머지에서. 패널 k 씨 (빨간색)와 (회색) 이미지 j에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 5hmC 얼룩 (녹색) INL 및 GCL 세포 핵에 전체 세포 핵에 국한 됩니다. Note 강한 5hmC GCL 셀의 핵 주변에 얼룩. 패널 p와 x 패널 q 및 y 각각 이미지 p와 x에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 하는 동안 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> 그림 4입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 로드 포토 리셉터 핵에 C57BL/6J 마우스 망막의 산 후 하루 90에서. 5mC 얼룩 (빨강, 한) 핵 주변에 있는 세포 핵 및 또한 약하게 현재 chromocenter에 강력 하 게 존재 하는. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 얼룩 (녹색, d)은 독점적으로 핵 주변 패널 e (녹색)에 국한 하 고 g 병합된 5mC와 패널 h 동안 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 된 영역의 f (회색) 대표 확대 표시 영역의 확대 g. 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는 이미지에 별표. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

이 방법은 유사분열 후 망막에서 망막 발달 중 염색질의 변화와 같은 DNA 메틸화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유사한 접근법으로 처리되는 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신 분포를 가진 모든 마우스 망막 조직의 모든 절편에 견고하게 사용할 수 있다는 것입니다. 조직 준비 및 염색 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요한데, 이는 동결된 조직학적 준비를 사용하는 경우 귀중한 조직 및 원래 조직을 잃을 수 있기 때문입니다.나머지 절차는 우리 실험실의 연구원인 Pablo Diaz가 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 29 게이지 1/2인치 바늘을 사용하여 목이 잘린 안락사된 쥐의 눈 등 쪽에 구멍을 뚫습니다. 눈컵을 얻으려면 즉시 미세한 안과 가위로 공막 주위를 잘라 각막과 수정체를 제거함으로써 눈을 적출하십시오.눈컵과 E16 눈 전체를 4% 파라포름알데히드 또는 PFA를 1xPBS pH 8.0의 실온에서 20분 동안 고정합니다. 실온에서 10분 동안 1ml의 1xPBS에 두 번 세척합니다. 눈컵과 눈 전체를 동결 보호하려면 10% 자당과 함께 1xPBS pH 8.0에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 1시간 동안 1xPBS에서 20% 자당. 그리고 마지막으로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1xPBS의 30% 자당. 다음 날, 크라이오몰드에 아이컵과 눈을 최적 절단 온도 컴파운드(OCT)에 삽입합니다.그런 다음 드라이 아이스 에탄올 욕조에서 얼리고 섭씨 80도로 유지합니다. 동결 절편을 시작하기 전에 섭씨 80도에서 안대와 안구가 내장된 주형을 제거하십시오. 저온 유지 장치 홀더에 넣고 1시간 동안 섭씨 20도까지 평형을 이룹니다.섭씨 20도에서 저온 유지 장치를 사용하여 시신경두를 통해 측두축과 평행하게 12마이크로미터 두께의 망막 단면을 절단합니다. 현미경 슬라이드에 절편을 장착하고 섭씨 80도에서 보관하십시오. 면역 염색을 시작하려면 소수성 차단 펜을 사용하여 슬라이드에 장착된 망막 부분을 둘러쌉니다.200마이크로리터의 1xPBS로 10분 동안 섹션을 한 번 세척합니다. 실온에서 10분 동안 200마이크로리터의 PBST로 절편을 투과시킵니다. 그런 다음 5mC 신호를 최적화하기 위해 섭씨 37도에서 45분 동안 1xPBS에서 2개의 일반 염산을 신중하게 적정한 200마이크로리터로 변성시킵니다.변성 후 망막 부위에 0.1 Tris-HCl pH 8.3 100마이크로리터를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 중화시킵니다. 그런 다음 500마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다. 그리고 절편을 실온의 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.차단 용액에 1에서 500까지 희석한 적절한 항체를 섹션에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날에는 0.1% PBST로 10-15분 동안 섹션을 세 번 세척합니다. DAPI 용액이 함유된 차단 용액에 1에서 1000까지 희석한 적절한 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 첨가합니다.다음으로, 0.1%PBST 1밀리리터로 슬라이드를 각각 10분씩 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 수성 장착 매체를 추가합니다. 커버 슬립으로 덮으십시오.그런 다음 컨포칼 현미경 검사를 진행합니다. E16에서 망막 면역염색 후, 5mC 신호는 세포핵의 염색체에서 강하게 나타났으며, 전체 세포핵에서는 훨씬 낮은 수준으로 존재하였습니다. 5hmC 염색은 세포핵에서만 발견되었으며 염색 중심에는 없었습니다.P0 망막에서는 5mC 및 5hmC 신호가 모두 외부 신경아세포층과 내부 신경아세포층에 존재했습니다. 5mC 신호는 세포핵의 염색체와 핵 주변에서 강했고, 세포핵의 염색체 사이에서는 더 약했습니다. 5hmC 염색은 세포핵으로 제한되었습니다.P15 망막의 바깥쪽 핵층에서는 세포핵과 핵 주변부의 발색체에서 5mC 신호가 감지되었습니다. 반면 5hmC 신호는 염색중심을 제외한 전체 세포핵에 있었습니다. 내부 핵 및 신경절 세포층에서 5mC 신호는 세포핵의 발색층에서 강하고 전체 세포핵에서 약했습니다.반면 5hmC 신호는 염색중심을 제외한 전체 세포핵에서 발견되었습니다. 성체 간상 광수용체에서 5mC 신호는 염색중심과 핵 주변부로 제한되는 반면, 5hmC 신호는 핵 주변부로 제한되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 HCl의 최적 노출(30분)로 조직학적 절편을 치료하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.노출이 적거나 많으면 최적의 결과를 재현할 수 없습니다. 이 절차에 따라 고압 액체 크로마토그래피, 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 측정 시 변화 정량화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경 발달 분야의 연구자들이 염색질의 후성유전학적 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.HCl 및 PFA로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 폐기와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

이 비디오는 나일론 멤브레인에 DNA 샘플을 블롯팅하고 단클론 항체를 사용한 후속 시각화를 통해 체외에서 인간 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 결정하는 도트 블롯 기술을 설명합니다. 이는 배양의 다양한 단계에서 연골세포의 표현형을 결정하는 데 도움이 됩니다.

DNA 메틸화 정도를 결정하기 위한 5-메틸시토신 점 블롯

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

여기에서는 과산화효소 접합 2차 항체 및 티라미드 신호 증폭의 사용을 기반으로 5mC 산화 유도체의 공간 분포를 매핑하기 위한 민감한 면역화학적 방법을 설명합니다.

민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

마우스 망막 동결절편을 준비하고 광수용체에서 면역염색을 수행하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 이 논문을 통해 연구자들은 잘 보존된 형태와 고품질 면역염색 결과를 가진 마우스 망막 동결 절편을 일관되게 생성할 수 있습니다.

마우스 망막의 동결 절편 및 면역 염색

배우세요 마우스 망막에서 5mC와 5hmC의 면역조직화학적 검출 방법을 통해 후유사분열기 망막 발달 중 염색질 변화를 연구하는 기법입니다. 이 프로토콜은 신경발생 연구에 활용됩니다.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

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