Name: 임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 각막 림발 상피 줄기 세포로의 효율적인 분화 방법을. 피더 세포 없는 배양 기술을 활용하여 임상 적용 가능한 세포를 생산하는 이 프로토콜은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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연구 기술 및 혁신, 핀란드 (부여 번호 297886)의 아카데미, 인간의 예비 부품 프로그램 Tekes, 핀란드 자금이 체 기구에 의해 지원 되었다 핀란드 눈 및 조직 은행 재단 및 핀란드 문화 재단. 저자는 생물 의학 실험실 기술자를 Outi Melin, 한 나 Pekkanen, 엠마 Vikstedt, 및 Outi Heikkilä 우수한 기술 지원 및 세포 배양에 기여 감사합니다. 교수 카트리나 Aalto-Setälä 형광 이미징 장비를 제공 하 고 사용 하는 hiPSC 라인 BioMediTech 이미징 핵심 시설 제공을 위한 인정 됩니다.

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 예상된 결과 성공적이 고 강력한 세대 LESCs의 FF hPSC의 단일 세포 현 탁 액에서 약 3.5 주 이내. 각 막 상피 표면 ectoderm29에서 개발, 프로토콜의 첫 번째 단계는이 혈통으로 hPSCs을 운영 목표로 합니다. 성장 인자 (TGF-β) 베타 길 항 제 SB-505124과 bFGF와 짧은 24 h 유도 세포 표면 ectoderm 향해 밀어 48 h mesodermal BMP-4 큐 다음 ectodermal 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 화학적 정의 차별화 매체와 열 4/LN-521 조합 매트릭스에 다음 부착 분화 단계 추가 안내 LESCs로 차별화 하는 데 사용 됩니다.
시작 자료 (FF hPSCs)의 높은 품질은 성공적인 차별화 중요 합니다. 만 FF hPSC 문화 합류 근처 및 미 분화 형의 100%를 사용 한다. 일반 hPSC karyotyping은 권장, 성장과 감 별 법 이점<sup cl...

안구 표면에 투명 한 각 막 빛이 망막을 입력을 허용 하 고 눈의 굴절 힘의 대부분을 제공 합니다. 바깥쪽 레이어 층 화 각 막 상피를 지속적으로 limbal 상피 줄기 세포 (LESCs)에 의해 다시 생성 됩니다. LESCs corneoscleral 접속점1,2limbal 틈새의 기저 레이어에 상주합니다. LESCs 부족 구체적이 고 독특한 마커, 그래서 그들의 식별 putative 마커 집합의 더 광범위 한 분석을 요구 한다. 상피 녹음 방송 요인 p63, 및 특히 N 말기 잘린 p63의 알파 isoform의 (ΔNp63α), 관련 긍정적인 LESC 마커3,4으로 제안 되었습니다. LESCs의 비대칭과 자기 갱신, 하지만 또한 centripetally 및 anteriorly 마이그레이션하는 자손을 생산 수 있습니다. 세포 막 표면으로 진행 그들은 점차적으로 그들의 stemness 잃게 되 고 마지막으로 지속적으로 각 막 표면에서 손실 표면 편평 세포에 분화 말기.
각 막 층의 손상이 심각한 시각 장애, 이어질 수 있습니다 그리고 각 막 결함은 이렇게 전세계 시각 손실의 주요 원인 중 하나. Limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD)는 limbus 질병 또는 conjunctivalization, 비전5,6의 후속 손실과 각 막 표면의 opacification 외상에 의해 소멸 됩니다. 세포 대체 요법 사용 헌 또는 수용자 limbal 이식 LSCD4,7,,89환자에 대 한 치료 전략을 제공 합니다. 그러나, 그리고 건강 한 눈에 합병증의 위험 곰 수확 자가 이식 기증자 조직 공급 부족 이다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 특히 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 임상 관련 종류의 세포, 각 막 상피 세포를 포함 하 여 무제한 원천이 될 수 있습니다. 따라서, hPSC에서 파생 된 LESCs (hPSC-LESCs) 안구 세포 대체 요법에 대 한 매력적인 새로운 셀 소스를 나타냅니다.
전통적으로, undifferentiated hPSC 문화 메서드 및 LESCs 그들의 분화 프로토콜 정의 되지 않은 피더 세포, 동물 세라, 바른된 미디어 또는 양수 막10,11, 의 사용에 의존 해야 12 , 13 , 14 , 15. 최근, 노력 더 안전한 세포 치료 제품으로 표준화 하 고 이종 문화 및 분화 프로토콜에 대 한 검색 하 라는 메시지가 있다. 그 결과, undifferentiated hPSCs의 장기 문화에 대 한 여러 가지 정의 및 이종 무료 방법을 상용16,,1718지금 있다. 연속체, 각 막 상피 운명에 hPSCs 가이드 분자 신호에 의존 하는 프로토콜은 최근 되었습니다 감독된 차별화 도입19,20,,2122, 23. 아직 이러한 프로토콜의 많은 소재, 또는 차별화에 대 한 복잡 한, xenogeneic 증가율 칵테일을 시작으로 중 정의 되지 않은, 피더 기반으로 hPSCs를 사용.
이 프로토콜의 목적은 제공 하는 강력 하 고, 최적화, 이종 하-급지대 무료 hPSC 문화 방법 및 각 막 LESCs에 후속 차별화. 단층 문화 정의 알 부 민 무료 hPSC 매체 (특히 필수 8 플렉스)에 laminin-521 (LN-521) 매트릭스에 만능 hPSCs의 차별점에 대 한 균질 시작 물자의 급속 한 생산을 허용 한다. 그 후, 간단한 2 단계 차별화 전략 hPSCs 서 스 펜 션, 부착 차별화 LESCs 뒤에 표면 ectodermal 운명 향해 가이드. 24 일 이내 > 65% ΔNp63α를 표현 하는 세포 인구를 얻을 수 있습니다. Xeno 급지대 무료 프로토콜 셀 라인 특정 최적화에 대 한 어떤 요구 든 지 없이 여러 hPSC 라인 (hESCs 및 hiPSCs), 테스트 되었습니다. 주말 무료 유지 보수, 뿌리고, cryostoring 및 hPSC LESC 형질 여기 설명에 대 한 프로토콜 사용에 대 한 높은-품질 LESCs의 큰 배치의 생산 임상 또는 연구 목적.

<table><tbody><tr><td><Ca2+ 및 Mg2+</td><td>Gibco</td><td>를</td><td></td>함유한</tr> <tr><td>strong>Material/Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr>1x DPBS Ca<tr><td>2+ 및 Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 세포 배양 접시</td> 부착성 hPSC-LESC를 위한 <td>Corning CellBIND#</td><td>3296</td><td>배양 용기 형식 분화</td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Corning CellBIND#</td><td>3336</td><td>IF 시료용 배양 용기 형식</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>IF 시료용 배양 용기 형식</td></tr><tr><td>2-메르토에탄올</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트, 초저 부착</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>현탁액 유도용 배양 용기 형식 culture</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21202</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21206</td> IF Alexa Fluor 568 anti-goat<td>에 대한 2차 항체</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11057</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-10037</td><td></td></tr><tr><td>IF Basic 섬유아세포 성장인자 2차항체 (bFGF, human)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>동물이 없는 재조합 인간 FGF 베이직(154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션</td><td>BD Biosciences</td><td>#554722</td><td>유세포 분석을 위한 고정 및 투과화 솔루션</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>유세포 분석을 위한 세척 버퍼</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 12 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td> IF Cytokeratin 14 항체<td>에 대한 1차</td></tr><tr><td>항체</td><td>R& D Systems</td><td>#MAB3164</td> IF <td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 15 항체</td>에 대한 기본 항체 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>#MS-1068-P</td> IF <td></td></tr><tr><td>CnT-30</td>에 대한 기본 항체 <td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30</td><td>부착성 hPSC-LESC 분화를 위한 배양 배지</td></tr> 콜라<tr><td>겐 IV형(인간)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5533</td><td>인간 태반 콜라겐 IV형</td></tr><tr><td>CoolCell LX 냉동 용기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure 튜브</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>hPSC-LESC 동결 보존을 위한 1.6mL 극저온 튜브</td></tr><tr><td>정의 트립신 억제제</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>라미닌 521</td><td>Biolamina</td><td>#Ln521</td><td>인간 재조합 laminin 521</td></tr><tr><td>&Delta; NP63&알파; 항체</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td> IF OCT3/4 항체 R&<td>에 대한 1차 항체</td></tr><tr><td></td><td> D Systems</td><td>#AF1759</td> IF p63&alpha<td>에 대한 1차 항체</td></tr><tr><td>; 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#ACI3066A</td> IF p63-&alpha<td>에 대한 1차 항체</td></tr><tr><td>; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td><td>세포 신호 기술</td><td>#56687</td><td>p63-&alpha; 유세포 분석을 위한 PE 접합 항체</td></tr><tr><td>PAX6 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td> IF 페니실린/스트렙토마이신<td>에 대한 기본 항체</td></tr><tr><td></td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>#158127</td><td>IF ProLong</td></tr><tr><td>Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#P36931</td><td>DAPI for hard IF</td></tr><tr><td>PSC 동결 보존 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' 장착 s 변형 된 독수리' s medium</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td> IF VectaShield Vector Laboratories<td>용 투과화제</td></tr><tr><td></td><td></td><td>#H-1200</td><td>IF</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cytocentrifuge, e.e. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유세포분석기, 예: BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경, 예: Olympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

임상 호환 막 limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

상피 각 막 limbal 줄기 세포 (LESCs)는 각 막 상피를 지속적으로 갱신 하 고 따라서 각 막 항상성 및 시각적 선명도 유지 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-각 막 세포 대체 요법에 대 한 유망한 셀 소스를 제공 하는 파생 된 LESCs. 정의 되지 않은, xenogeneic 문화와 차별화 조건 연구 결과에서 변형 원인과 hPSC 유래 치료제의 임상 번역을 방해. 이 프로토콜 hPSC LESC 차별화 이종-및 피더 세포 무료 조건 하에서 재현 하 고 효율적인 방법을 제공합니다. 첫째, 단층 문화 undifferentiated hPSC 재조합 laminin-521 (LN-521)에 정의 된 hPSC 매체의 차별점에 대 한 높은-품질 시작 물자의 강력한 생산 위한 기초 역할을 합니다. 둘째, 신속 하 고 간단한 hPSC LESC 차별화 방법 24 일만에 LESC 인구를 생성합니다. 이 방법은 작은 분자로, 정의 된 각 막 상피 분화 매체에 LN-521/콜라겐 IV 조합 매트릭스에 부착 문화 단계 다음에 4 일간 표면 ectodermal 유도 포함 합니다. Cryostoring와 확장된 차별화 더 세포 인구를 정화 하 고 대량 세포 치료 제품에 대 한 셀의 은행 수 있습니다. 결과 높은 품질 hPSC LESCs 치료 limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD) 각 막 표면 재건을 위한 잠재적인 새로운 치료 전략을 제공 합니다.

HPSC-LESCs에 hPSCs에서
FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs로의 분화 유도에서 전체 프로세스는 약 3.5 주 걸립니다. 그것의 주요 단계를 강조 차별화 방법의 도식 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 그림 1B 는 프로토콜의 여러 단계에서 세포 인구의 일반적인 형태학을 보여줍니다. 제공 된 데이터 Regea08/017 hESC 라인과 UTA.04607.WT hiPSC 선, 파생와 앞에서 설명한26,,2728탐 페 레, 핀란드의 대학에서 특징 모두 얻을 수 있습니다.</p...

이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산 가능

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포로부터 각막 사지 상피 줄기 세포를 분화하기 위한 정의된 피더 세포 무료 방법을 도입하였다. 림팔 상피 줄기 세포는 건강한 눈에서 각막 상피를 갱신할 책임이 있습니다. 이 세포에 손상은 사지 줄기 세포 결핍으로 알려져 있는 조건에 지도하고, 각막 선명도의 손실로 이끌어 냅니다.여기에 표시된 세포 배양 방법은 미래의 각막 세포 대체 요법을 위한 사지 상피 줄기 세포의 효율적인 생산을 가능하게 합니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 피더 가 없는 인간 만능 줄기 세포 배양을 통과하고 유지한다. 분화를 위한 시작 재료로 고품질의 인간 만능 줄기 세포만 사용해야 합니다.배아 체형성을 유도할 준비가 되면 필요한 모든 재료와 시약을 라미나르 플로우 후드의 실온으로 데워보세요. 피더 무료 인간 만능 줄기 세포를 각 우물에 xeno 무료 트립신 EDTA 500 마이크로리터를 추가하여 서스펜션에 분리합니다. 섭씨 37도, CO2 5%의 인큐베이팅.3분 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 세포 형태를 확인하여 트립신 제거를 위한 최적의 단계를 결정합니다. 세포를 주의 깊게 관찰하여 세포가 반올림되었지만 완전히 분리되지 않은 경우 xeno 무료 tryspin EDTA를 제거하는 최적의 시간을 결정합니다. 최적의 시간에, 세포에서 제노 무료 트립신 EDTA를 제거합니다.정의된 트립신 억제제와 부드럽게 파이펫을 추가하여 세포를 분리합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 단일 세포 현탁액을 수집합니다. 300g의 원심분리기는 5분간.그런 다음, 상체를 제거하고 배양 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 분리한다. 세포를 계산한 후, 5개의 마이크로몰라 블비스타틴으로 보충된 기저 유도 매체의 3밀리리터에 2~300만 개의 세포를 낮은 부착 6웰 플레이트의 각 웰에 분배한다. 하룻밤 사이에 37도에서 5%의 CO2로 배양합니다.다음 날, 현미경의 밑에 태아 바디의 질을 확인합니다. 매체를 제거하고, 인간 기본 유리 섬유 성장 인자의 밀리리터 당 10 마이크로 몰러 SB-505124 및 50 나노그램으로 보충 된 기저 유도 매체의 3 밀리리터로 대체하십시오. 5%의 CO2로 섭씨 37도에서 계속 배양하십시오.다음 이틀, 배지를 제거하고, 뼈 형태 유전학 단백질 4의 밀리리터 당 25 나노 그램으로 보충, 기저 유도 매체의 3 밀리리터로 대체. 그런 다음 이전 조건을 사용하여 인큐베이션을 계속

efficient-scalable-directed-differentiation-clinically-compatible

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

인간 당뇨병 장기 배양 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료의 예는 이러한 각막에서 지연된 상처 치유와 현저히 감소된 상피 줄기 세포 마커 발현의 정상화를 위해 제시됩니다. 또한 줄기세포가 풍부한 윤부 상피 배양에서 이 과정의 최적화를 설명합니다.

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

여기서는 콜라겐제 A와 트립신을 이용한 순차적 소화를 통해 전체 마우스 각막에서 고품질 단세포 현탁액을 얻는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 높은 RNA 무결성을 가진 생존 가능한 단일 세포를 생성하여 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포기체 y와 같은 후속 응용과 호환됩니다.

마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 채취하는 프로토콜

배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 각막 림발 상피 줄기 세포로의 효율적인 분화 방법을. 피더 세포 없는 배양 기술을 활용하여 임상 적용 가능한 세포를 생산하는 이 프로토콜은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

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