단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

이 기술의 주요 장점은 단백질 하이드로겔 샘플에 제어된 힘 프로토콜을 적용하기 위해 비례 적분 유도 시스템인 PID를 사용하고 소량의 샘플을 사용한다는 것입니다. 힘 클램프에 대한 프로토콜은 데이터를 직접 해석할 수 있도록 하는 반면, 소량으로만 사용할 수 있는 단백질을 생산하기 어려운 경우 소량의 경우 매우 중요합니다. 이 기술의 의미는 단백질에 대한 하향 접힘, 재접힘 전이 특성을 사용하여 내구성 있는 탄성을 가진 새로운 생체 인식 재료를 개발하고 특성화하는 것으로 확장됩니다.

이 방법은 한 번의 풀로 수십억 개의 단백질 분자를 측정하고 생물학적 조직에 특이적인 혼잡한 환경을 시뮬레이션함으로써 조직 및 생체 재료 역학의 질문에 답할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시약 용액 준비로 이 절차를 시작합니다. 단백질 기반 하이드로겔을 합성하려면 먼저 1밀리리터 주사기에 23게이지 바늘을 눌린 플런저로 고정합니다.

그런 다음 면도날을 사용하여 10cm 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 PTFE 튜브를 자릅니다. 바늘과 주사기를 PTFE 튜브의 한쪽 끝에 부착합니다. 튜브의 두 번째 끝을 실란 용액에 삽입하고 실린지 플런저를 집어넣어 튜브를 채웁니다.

튜브를 약 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 실란 용액을 제거하고 압축 공기로 튜브를 건조시킵니다. 이제 단백질 용액을 일정한 부피 비율로 1.5 밀리리터 튜브에 APS 및 Tris(bipyridine)ruthenium(II)chloride와 혼합합니다.

광활성 용액이 완전히 혼합될 때까지 와류를 치십시오. 그런 다음 혼합물을 최대 속도로 원심분리하여 용액에서 기포를 제거합니다. 하이드로겔 광활성 혼합물을 테프론 튜브에 주입하는 동안 기포가 형성되어 샘플이 손상될 수 있습니다.

기포 형성을 방지하려면 로딩 과정에서 테프론 튜브 끝을 용액 혼합물에 유지하고 주사기 플런저를 천천히 집어넣으십시오. 처리된 PTFE 튜브의 열린 끝을 광활성 혼합물에 삽입하고 주사기 플런저를 집어넣어 용액을 튜브로 끌어들입니다. 이제 적재된 튜브를 100와트 수은 램프에서 약 100cm 떨어진 곳에 놓아 가열을 방지하고 실온에서 최대 30분 동안 보관하십시오.

바늘에서 튜브를 제거하고 면도날로 하이드로겔 끝 근처의 튜브 가장자리를 자릅니다. 그런 다음 무딘 24게이지 바늘을 사용하여 하이드로겔을 Tris 용액으로 압출합니다. 압출 중 또는 기포로 인해 형성될 수 있는 결함이 있는지 겔을 육안으로 검사하고 결함이 있는 겔을 폐기하십시오.

기기 제어 프로그램을 시작하고 보이스 코일 모터를 켭니다. 그런 다음 코일 위치를 범위의 끝을 향하는 값으로 설정합니다. 후크를 Z 방향으로 변위시키고 X 방향의 절곡부에 정렬합니다.

그런 다음 X 방향에 대한 마이크로미터 나사의 값을 기록합니다. 이제 봉합사 가닥 끝에 느슨한 이중 오버핸드 매듭을 묶어 루프의 직경이 약 4mm가 되도록 합니다. 그런 다음 가닥에서 고리를 자릅니다.

반복하여 두 번째 루프를 만듭니다. 그런 다음 힘 센서에 연결된 후크에 두 개의 루프를 놓습니다. 실험 챔버에 Tris 버퍼를 채우고 의료용 핀셋을 사용하여 하이드로겔 샘플을 채워진 챔버로 옮깁니다.

보이스 코일과 힘 센서 후크를 솔루션 표면 가까이에 놓고 모든 방향으로 후크를 XYZ 포지셔닝 매니퓰레이터와 정렬합니다. 의료용 핀셋을 사용하여 단백질 하이드로겔 샘플의 양쪽을 보이스 코일과 힘 센서에 연결된 고리에 걸어둡니다. 일반적인 오류는 부착 과정에서 하이드로겔 샘플 주위의 봉합사 루프가 과도하게 조여지는 것입니다.

이는 노치(notch) 형성 및 하이드로겔 샘플의 절단으로 이어질 수 있습니다. 의료용 핀셋으로 봉합 루프의 양쪽 끝을 잡고 동시에 당겨 보이스 코일 후크의 하이드로겔 샘플 주위의 한쪽 봉합 루프를 조심스럽게 조입니다. 힘 센서에 연결된 루프에 대해 이 단계를 반복합니다.

미끄러짐을 방지하기 위해 각 후크의 구부러진 부분에 있는 봉합 루프를 조입니다. 이러한 절곡부를 참조점으로 사용하여 후크 사이의 제로 분리를 찾습니다. 의료용 가위를 사용하여 봉합사의 여분의 길이를 자릅니다.

Z축을 따라 Z축을 따라 부착된 하이드로겔을 실험 챔버 쪽으로 이동하여 하이드로겔을 실험 용액에 담급니다. 하이드로겔 s를 정렬합니다.amp겔이 스트레스를 받지 않도록 매니퓰레이터를 사용하여 YZ에 있습니다. 힘 센서를 영점화하고 젤이 힘을 받기 시작할 때까지 X 마이크로미터 단계를 사용하여 두 개의 후크를 분리합니다.

이 경우 마이크로미터 나사를 X 방향으로 약간 뒤로 돌립니다. 보이스 코일 모터와 센서에 대한 두 매니퓰레이터의 위치를 기록합니다. 그런 다음 이러한 값과 이전에 측정된 값 간의 차이를 사용하여 실험 시작 시 테더링 후크 간의 정확한 간격을 계산합니다.

원하는 로딩 속도에서 힘을 증가시켜 force-ramp 사이클을 수행하려면 시작 및 최종 force 값과 flipped V로 나타나는 프로토콜의 지속 시간을 입력한 다음 약 200초 동안 지속적으로 낮은 force를 입력하여 다음 cycle 전에 단백질 도메인이 다시 접힐 수 있도록 합니다. 30초 동안 낮은 힘을 가하여 항력 프로토콜을 수행합니다. 그런 다음, 정의된 시간 동안 힘을 일정한 힘으로 증가시킨 다음 단백질 도메인이 다시 접히고 겔 탄성이 회복될 수 있도록 300초 이상 동안 힘을 동일한 낮은 값으로 다시 냉각합니다.

마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다. 각 측정은 슬랙 곡선으로 시작합니다. 두 개의 선을 장착하여 센서에 가해지는 영하중과 실제 젤 길이가 결정됩니다.

실제 겔 길이는 끼움의 교차점과 마이크로미터 나사의 위치에서 계산됩니다. force-clamp 유변 물성 측정 시스템은 두 가지 유형의 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 힘 램프 모드에서 하이드로겔 샘플은 시간이 지남에 따라 반전된 V.In 일정한 힘 모드와 유사한 힘 변경 프로토콜을 경험하며, 적용된 응력은 계단과 같은 패턴으로 변합니다.

측정하는 동안 PID 시스템은 힘 프로토콜에서 사전 정의된 설정점을 따르도록 코일 위치를 변경하여 하이드로겔 확장을 조정합니다. 그런 다음 측정된 확장을 실제 겔 길이로 나누어 변형률을 계산합니다. 응력은 하이드로겔 샘플의 단면적에 가해진 힘을 나누어 측정합니다.

Force Ramp 트레이스는 응력 대 변형으로 가장 잘 표현됩니다. Young의 계수는 하중 단계 동안 기울기 측정에서 계산할 수 있습니다. 히스테리시스는 단백질을 풀고 다시 접을 때 오는 에너지 소실을 제공합니다.

일정한 힘 추적은 시간의 함수로 가장 잘 표현됩니다. 변형률의 변화는 이중 지수를 피팅하여 풀림 및 재접힘 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 단백질을 추가하기 전에 튜브에서 실란을 건조하고, 단백질 혼합물을 원심분리하여 기포를 제거하고, 튜브 내부에 단백질 혼합물을 주입한 후 기포를 확인하고, 튜브에서 압출된 후 기계적으로 손상된 하이드로겔을 버리는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 처음에는 하이드로겔 샘플에 손상을 주지 않고 수술용 봉합사를 사용하여 겔을 후크에 부착하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 튜브에서 젤을 빼내면 하이드로겔도 손상될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 저용량 하이드로겔 샘플에 일정한 힘 프로토콜을 적용할 수 있습니다.

이러한 실험을 통해 탄성 및 점탄성 거동을 분리하고 벌크 접근 방식으로 단백질 풀림 및 접힘 역학을 연구할 수 있습니다. 개발 후 재료 과학 분야의 연구원들은 조직 공학 골격, 약물 전달 시스템 및 3D 프린팅을 위한 생물학적 잉크 역할을 할 수 있는 탁월한 잠재력을 가진 엔지니어링 폴리단백질 기반 하이드로겔과 같은 새로운 소프트 생체 재료를 탐구할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 기반 하이드로겔의 역학에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 근섬유의 등척성 반응 또는 피부와 같은 조직의 탄력성 측정과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.