Name: 단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 학습하세요 단백질 기반 하이드로겔의 힘-클램프 레오메트리 기법을 이용한 기계적 특성 분석 방법을. PID 제어 시스템으로 소량 샘플에서도 정밀한 힘 제어가 가능하며, 생체재료 개발과 조직 역학 연구에 활용됩니다.

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연구 성장 이니셔티브 (보너스 번호 101 X 340), 국립 과학 재단, 주요 연구 계측 프로그램 (부여 번호 로부터 재정 지원을 인정합니다 PHY-1626450), 더 큰 밀워키 재단 (쇼 수상)와 위스콘신 대학 시스템 (응용된 연구 부여).

1. 시 약 솔루션 준비
<ol><li>[20 m m tris (hydroxymethyl) aminomethane 및 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris 버퍼를 사용 하 여 원하는 농도에 관심사의 단백질을 용 해/diluting 하 여 시작 단백질 솔루션을 준비 합니다. 참고: hydrogels로는 상호 연결에 대 한 작은 단백질 농도 단백질 사용에 따라 달라 집니다 및 일반적으로 > 1 m m 이다.</li>
	<li>Tris(bipyridine)ruthenium(II) 염화 암모늄 persulfate (APS) (1 M)의 주식을 준비 ([Ru(bpy)3]2 +) APS 용 해 하 여 (6.67 m m) 솔루션 및 Tris 버퍼에서 [Ru(bpy)3]2 + 파우더.</li>
</ol>2. 단백질 기반 하이드로 겔 합성
<ol><li>누르면된 플런저와 1 mL 주사기에 23 G 바늘을 수정.</li>
	<li>면도날을 사용 하 여 ()와 함께 0.022의 내부 직경에 0.044의 외부 직경 10 cm 소계 (PTFE) 튜브를 잘라. PTFE 튜브의 한쪽 끝을 바늘과 주사기를 연결 합니다.</li>
	<li>실 란 솔루션으로 튜브의 두 번째 끝을 삽입 하 고 튜브 주사기 플런저를 축소 하 여 작성. ~ 30 분에 대 한 튜브를 둡니다.</li>
	<li>실 란 솔루션을 제거 하 고 건조 한 압축 공기 튜브. 참고: 모든 실 란 솔루션은 건조 하 고 아무 잔류물은 튜브에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>APS와 [Ru (bpy) 3] 단백질 해결책 혼합2 + 일정 볼륨 비율을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 [예를 들어, 15:1:1 또는 15:0.5:0.5 (v:: v)].</li>
	<li>그것은 완전히 혼합 될 때까지 광 솔루션 소용돌이.</li>
	<li>(예를 들어, 14000 x g) 솔루션에서 모든 거품을 제거 하는 최대 속도로 혼합 원심</li>
	<li>광 혼합물으로 치료 PTFE 튜브의 열린 끝을 삽입 하 고 튜브에 주사기 플런저를 제거 하 여 솔루션을 그립니다.</li>
	<li>로드 튜브가 열을 방지 하 고 실내 온도 (그림 1B)에 최대 30 분 동안 그것을 유지 하는 100 W 수은 램프에서 ~ 10 cm를 놓습니다. 참고: 경우에 따라 빛을 노출 시간 수 30 미는 겔 화 시간 단축에 사용 되며 여기 형광 젤, photobleaching 제한으로 낮은.</li>
	<li>바늘에서 튜브를 제거 하 고 면도날으로 히드로 끝 근처 튜브의 가장자리를 잘라.</li>
	<li>무딘된 24 G 바늘을 사용 하 여 트리 스 솔루션 (그림 1C)에 히드로 돌출. 참고: 무딘된 바늘은 모든 노치를 피하기 위해 또는 하이드로 겔 샘플을 손상 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>돌출 하는 동안 또는 거품을 형성 하 고 결함을 가진 젤을 버리고 수도 있는 어떤 결점 든 지 젤을 않았는지 살펴보십시오.</li>
</ol>3. 단백질 기반의 히드로 첨부 및 힘-클램프 제가 설정
<ol><li>인스트루먼트 컨트롤 프로그램을 시작 합니다. 음성 코일 모터를 켭니다. 값 범위 (예를 들어, 7.5 m m)의 끝으로 코일 위치를 설정 합니다. 참고: 음성 코일 위치는 히드로의 가능한 확장을 최대화 하기 위해 최대 운동 범위의 끝으로 될 것이 좋습니다.</li>
	<li>Z에서 후크를 치환-방향 x벤드에 그들을 정렬-방향 (당기 좌표 이며 그림 2B참조). 마이크로미터 나사 x의 값을 기록-방향.</li>
	<li>2 살 균 봉합 길이가 가닥으로 잘라 (2-3 cm; 그림 3A 및 B참조).</li>
	<li>각각의 가닥에 느슨한 더블 overhand 매듭 고 힘 센서 (그림 3C 와 3D)에 연결 하는 연결에 2 루프를 배치.</li>
	<li>Tris 버퍼 실험 챔버와 의료 핀셋을 사용 하 여 채워진된 챔버로 하이드로 겔 샘플을 전송.</li>
	<li>음성 코일 및 놓고, 강제로 솔루션 표면 가까이 센서 후크 모든 방향으로 x를 사용 하 여 후크를 정렬 /y/z-조작자를 위치.</li>
	<li>의료 핀셋, 기다려 음성에 연결 하는 걸이에 단백질 하이드로 겔 샘플의 양쪽 코일과 센서 (그림 3C)을 강제로 사용 하 여.</li>
	<li>의료 핀셋으로 봉합 루프의 양쪽 끝을 잡고, 동시에 그들을 당기고 하 여 음성 코일에 하이드로 겔 샘플 주위 봉합 루프 1 조입니다 (그림 3D).</li>
	<li>루프에 대 한 반복 단계 3.8 힘 센서 (그림 3D)에 연결합니다. 참고: 어떤 구조적 손상 및 하이드로 겔 샘플의 횡단 절단을 방지 하기 위해 봉합의 극단적인 강화 하지 마십시오.</li>
	<li>어떤 미끄럼을 방지 하기 위해 각 연결의 벤드에 봉합 루프를 강화 참고로이 벤드 포인트 제로 구분 단계 3.2에서에서 후크를 찾을 수 사용. 의료가 위 (그림 3D)를 사용 하 여 봉합의 초과 길이 잘라.</li>
	<li>Z를 사용 하 여 연결 된 하이드로 겔 이동- z따라 조작자-실험 솔루션에 히드로 몰입할 실험 챔버 쪽으로 축.</li>
	<li>Y-z 는 젤 하지 어떤 스트레스는 조작자를 사용 하 여 하이드로 겔 샘플을 맞춥니다.</li>
	<li>제로 포스 센서와 x를 사용 하 여 2 개의 후크를 분리-마이크로미터 단계 젤 힘 발생 하기 시작할 때까지. 일단 이것이 일어나면, 약간 되돌릴 마이크로미터 나사 x-방향.</li>
	<li>음성 코일 모터 및 센서에 대 한 두 컨트롤러의 위치를 기록 하 고 이러한 값과 3.2 단계에서 측정 하는 것 들 사이의 차이 사용 하 여 정확한 실험의 시작에 tethering 후크 구분 계산.</li>
	<li>~1.5-2 m m로 여유 곡선에 대 한 범위를 설정 하 고 젤 여유 (그림 4A)를 측정 한다. 참고: 여유 각 측정 2 정권 (그림 4A)에 맞게 최적의 수의 데이터 요소에 대 한 허용 초기 음성 코일 위치 근처 여유 정권의 시작을 유지 하려고 합니다. 젤 길이 갈고리와 느슨하게에 2 정권 사이의 교차로 사이의 분리를 사용 하 여 미크론 분해능으로 결정 될 수 있다 곡선 (단계 5.1 참조). 힘 센서는 실험 조건에 있는 변이 때문에 시간 드리프트 수 있습니다로 젤이 없는 아래 여유 곡선의 부분 힘이 가능한 드리프트에 대 한 보고서. 계측기 제어 프로그램 PID 루프 (그림 4A 인세트)를 세트 포인트 명령을 보낼 때 이러한 차이 대 한 자동으로 보정 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 기반의 히드로 특성 제어 힘 램프를 사용 하 여 상수-힘 측정
<ol><li>
힘-램프 실험
	<ol>
<li>힘 램프 주기 원하는 로딩 속도 (예를 들어, 0.01 mN/s)에 힘을 증가 하 여를 수행 하려면 뒤집힌된 "V"로 시작 하 고 마지막 세력 및 프로토콜의 기간을 입력 합니다. 그런 다음 0 미네소타 (또는 낮은 힘) > 200 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 있도록 젤 잡으십시오.</li>
		<li>추적을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
상수-힘 실험
	<ol>
<li>정의 된 시간 동안 일정 한 힘 (예를 들어, 1만)에 30 s와 증가 힘에 대 한 낮은 힘 (예를 들어, 0.1 mN)를 적용 하 여 상수-힘 프로토콜을 수행 (예를 들어, 120 s), 뒤에 동일 하 게 다시 힘을 낮은 냉각 값 (예, 0.1 mN) > 300 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 수 있도록.</li>
		<li>첫 번째 펄스 다음 PID 설정을 조정 하는 피드백의 응답 시간을 최대화 (참조 그림 2D) 루프. 참고: 뻣 뻣 한 젤에 대 한 힘에 작은 변화에 대 한 루프의 응답 시간 힘 센서의 전자와는 코일의 응답 시간에 의해 제한 됩니다 그리고, 5 ms7만큼 낮을 수 있다. 부드러운 젤, 힘에 있는 큰 변화에 대 한 응답 시간이 hydrogels (그림 2D)의 탄성에 의해 결정 됩니다.</li>
		<li>추적을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>젤 힘 ( 그림 4A 삽입에서 δ x) 경험, 젤 길이 L 방정식을 사용 하 여 계산을 시작 하면 갈고리와 계산 된 코일 위치 측정된 구분 활용 하 여: L = L0 + ∆x 여기, L0 (단계 3.14) 실험 전에 마이크로미터 나사의 위치에서 측정 후크 사이 분리 이다. 참고: 완전 한 cross-linking 귀착되는 낮은 단백질 농도와 젤에 대 한 측정된 길이 추적 추적에서 변경 됩니다. 또한, 시간의 오랜 기간 동안 hydrogels 내부 단백질 발생할 수 노화 효과25, 젤의 전체 길이에 있는 결과.</li>
	<li>정상화 긴장을 젤 길이 측정된 확장.</li>
	<li>중 합에 사용 되는 관의 내부 직경을 사용 하 여 횡단 표면에 측정 된 힘을 정상화.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 낮은 볼륨 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 응답을 조사 하는 힘-클램프 rheometry 기법을 설명 합니다. 또한, 균일 한 원통형 낮은 볼륨 단백질 하이드로 겔 샘플을 합성 하는 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜도는 걸이에 어떤 기계적 변형 또는 단백질 기반 하이드로 겔 샘플 또는 젤의 미끄럼에 손상을 유발 하지 않고 다른 유형의 다양 한 신축성으로 단백질 기반 hydrogels 넥타이 하는 방법에 설명 합니다 제공 됩니다. 선형 음성 코일 및 힘 센서, 아날로그 PID 시스템 힘 램프 및 지속적인 힘 등 힘 제어 프로토콜의 응용 프로그램을 사용 합니다. 최근,이 기술은 다른 실험적인 솔루션7에 BSA 기반 hydrogels의 다른 복사해올된 농도의 biomechanical 반응을 하 사용 되었습니다.
공식화 하 고 단백질 hydrogels 작업할 때 중요 한 측면은 측정의 재현성. 젤은 너무 낮...

독특한 물리적 특성 떨어져, 단백질 기반 hydrogels 붐비는 환경에 있는 단백질의 연구를 활성화 한 '당겨'에 몇 십억 분자의 측정 함으로써 힘 분광학을 혁명의 약속을 잡으십시오 피부와 다른 조직에 있어서 그 비슷한. 단백질 도메인 유지 hydrogels, 강제로, biomechanical 반응의 연구를 수 있도록 내부 접힌 파트너 및 화학 조건 바인딩. 또한, biomechanical 응답 hydrogels 내부 단백질 도메인의 단일 분자 힘 분광학 기법으로 본 응답을 유사 합니다. 예를 들어 화학 denaturants 및 산화 제 접힌된 상태, 단일 단백질 도메인 수준1,2,3 와 거시적인 레벨4,5 에서 안정성을 감소 , 6 , 7. osmolytes 단일 단백질8,9, 동일한 힘 조건7,10대 hydrogels의 점 탄성 응답 감소로 이어지는의 안정성을 증가 하는 유사 하 게.
중 합성 단백질 기반 hydrogels 구현 되었습니다 몇 가지 방법을 사용 하 여 물리적 상호 작용11,12 또는 공유 상호4,13. 화학식 반응 고정된 가교 위치에 대 한 허용 하 고 이러한 hydrogels 기계적 또는 화학적 섭의 제거에 따라 초기 상태를 복구할 수 있습니다. 화학식 cross-linking를 위한 성공적인 접근 초기자 (그림 1)14는 산화 제와 루 테 늄 (II) 소금으로 암모늄 persulfate (AP)를 사용 하 여 노출 된 티로신 아미노산 사이 화학식 탄소-탄소 유대 형성에 의존 합니다. 하얀 빛에 노출 되 면 집중된 단백질의 해결책은 하이드로 겔으로 설정할 수 있습니다. 제어 하 여 반응을 시작, 단백질-APS 믹스 어떤 주조 형태, 투입 될 수 있는 때 소계 (PFTE) 등 튜브 (그림 1B 및 1 C), 수 있도록 매우 작은 솔루션 볼륨15를 사용 하 여. 또한, 가교 반응을 방 아 쇠를 흰색 빛으로의 사용 제한 표백 형광 단백질의 결과 하며 복합 hydrogels의 정립 형광 마커 (그림 1) 다른 단백질 기반 하이드로 겔 형성 방법 SpyTag SpyCatcher 공유 상호 작용16, 아민 가교 를 통해 도13또는 biotin streptavidin 상호 작용17에 따라 교차 연결을 사용 합니다.
동적 기계적인 분석 (DMA)는 현재 광범위 하 게 폴리머 기반 hydrogels13,18를 공부 하는 기술입니다. DMA 생체 재료에 일정 힘 프로토콜을 적용할 수 있습니다, 하는 동안 10 kPa, 및 이상의 200 µ L19의 큰 샘플 볼륨 영의 계수를 요구 한다. 이러한 제한으로 인해 단백질 hydrogels는 일반적으로이 기술에 의해 조사를 너무 부드러운. 설계 된 polyproteins 때문에 살아있는 시스템 생산에 필요한 고분자, 보다 합성 하 더로 같은 높은 볼륨 효율적, 최고의4,15되지 않습니다. 또한, 대부분의 생물 학적 조직 10 kPa 보다 부드럽고 있다. 몇 가지 방법은 생물 학적 샘플, 근육 탄력20,21연구에서 특히 개발 되었다. 이러한 기술은 또한 지속적인 힘을 피드백에서 동작할 수 있습니다 하지만 아주 짧은 시간 동안 강제로 노출 (미크론 범위)에서 작은 직경을 가진 샘플에 대 한 최적화 (일반적으로 1 s).
단백질 기반 hydrogels 수정된 rheometry 기술로 성공적으로 공부 했다. 예를 들어 반지 모양에는 히드로 주조 확장4,22의 기능으로 경험 있는 힘에 있는 변화를 측정 하기 위해 extensional rheometry 사용 하 여 수 있습니다. 단백질 기반 hydrogels의 유 변 학적 특성을 공부에 대 한 다른 접근 제어 전단 응력 rheometry를 사용 합니다. 이 기술은 또한 낮은 샘플 볼륨을 달성 하 고 부드러운 소재를 용납 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 부족을 당기기 모방 능력 그 원인 단백질 펼쳐진 vivo에서, 고 탄성 계수 다양 한 가정 및23필요로 하는 복잡 한 이론에 따라 계산 됩니다.
우리는 최근 단백질, 직경 튜브 내부 생산의 작은 볼륨을 이용 하는 새로운 접근 방식을 보고 < 1 m m. 이 기술은의 우리의 첫 번째 구현 젤 원하는 프로토콜15다음 확장 했다 길이 클램프 모드에서 운영 했다. 이 방법에서는, 단백질 경험 확장에 힘 연속 변경 도메인 전개 하는 동안 데이터 해석 복잡 하. 최근에, 우리는 새로운 힘-클램프 rheometry 기술, 피드백 루프는 사전 정의 된 힘 프로토콜7 (그림 2) 낮은 볼륨 단백질 hydrogels을 노출할 수 있습니다 보고 있다. 아날로그 PID 시스템 컴퓨터에서 보낸 세트 포인트와 힘 센서에 의해 측정 하는 힘을 비교 하 고 두 입력 간의 차이 최소화 하기 위해 음성 코일을 이동 하 여 젤 확장을 조정 합니다. 힘의이 '죄' 지금 허용 한다 실험의 새로운 유형에 대 한 단백질 hydrogels의 역학을 측정 하기 위하여.
힘-램프 모드에서 속박 되 단백질 히드로 지속적인 증가 시간 강제의 감소를 경험 한다. PID는 단백질 및 하이드로 겔 제제의 종류에 따라 비-선형 방법에 있는 확장명을 변경 하 여 점 탄성 변형에 대 한 보상. 힘 램프의 주요 장점은 그것은 영의 계수는 전개 및 refolding 단백질 도메인의 에너지 소비 등의 표준 매개 변수의 정량화를 허용 한다.
상수-포스 모드에서 적용 된 힘 단계 처럼에서 변경 됩니다. 이 모드에서 젤 확장 계약 탄력적 때 힘 증가 또는 감소, 각각, 시간에 따른 변형에 의해 따라. 이 점 탄성 변형, 젤 지속적인 힘을 경험 하는 동안 일어나는 도메인 전개 refolding와 직접 관련 됩니다. 단순화 된 방법으로,이 확장 몇 십억 단일 분자 추적 함께 평균 하 고 한 번에 측정의 동급으로 볼 수 있습니다. 상수-포스 프로토콜 크 리프 힘 및 시간의 기능으로 단백질 hydrogels의 휴식을 공부 하 고 사용할 수 있습니다. BSA-기반 단백질 hydrogels 위한 힘의 기능으로 우리 최근 나타났습니다 탄성 및 점 탄성 확장 및 적용 된 스트레인7반동 사이 선형 종속성입니다.
여기 우리 힘 클램프 고분자 형광 고 쉽게 전반적인 하이드로 겔을 만드는 단백질 L의 혼합물 (8 도메인24, L8로 묘사) 및 단백질 L eGFP 구문 (L-eGFP)에서 만든 복합 젤을 사용 하 여 작업 세부 사항 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>SI-KG4A 포스 트랜스듀서</td><td>월드 정밀 기기 (WPI)</td><td>SI-KG4A</td><td></td></tr><tr><td>리니어 보이스 코일 모터</td><td>설비 솔루션</td><td>LFA2010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>록키 마운틴 바이오 제제 (RMBIO)</td><td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 퍼설페이</td><td>트 Sigma-Aldrich</td><td>248614-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544981-1G</td><td></td></tr><tr><td>익스프레스 의료 용품&nbsp; 6-0 나일론 봉합사 12/PK</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>NC0395626</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기만, Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>실란, Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>마이크로보어 PTFE 튜빙, 0.022"ID x 0.042"OD, 100피트/롤</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘, 23 게이지</td><td>헬스케어 공급 전문가</td><td>305194</td><td></td></tr><tr><td>Jensen Global JG24-1.5X 레드 IT 분배 팁 - 24 게이지</td><td>KIMCO</td><td>JG24-1.5X</td><td></td></tr><tr><td>USH-103D USHIO 100W 짧은 아크 수은 램프</td><td>ALB</td><td>USH-103D USHIO</td><td></td></tr><tr><td>의료 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>의료 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 부품의 컴퓨터 코드 및 CAD 설계는 교신 저자에게 요청 시 제공될 수 있습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 기반 hydrogels 대상이 힘-클램프 rheometry

Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

여기, 우리는 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 속성 특성 힘-클램프 rheometry 메서드를 설명 합니다. 이 메서드는 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템을 사용 하 여 원통형 단백질 기반의 히드로 샘플, 선형 음성 코일 모터와 힘 변환기 사이 곁에 힘 제어 프로토콜을 적용. 작업 중 PID 시스템 측정 및 설정 포인트 세력 간의 차이 최소화 하 여 힘을 미리 정의 된 프로토콜에 따라 하이드로 겔 샘플의 확장을 조정 합니다. 단백질 기반 hydrogels이 독특한 접근 방식 다른 단백질 농도와 매우 낮은 볼륨 하이드로 겔 샘플 (< 5 µ L)의 밧줄 수 있습니다. 힘 램프 프로토콜, 어디 적용된 스트레스 증가 하 고 선형 시간 감소, 아래 시스템 표준 탄성의 측정 및 단백질의 폴딩 (유엔)와 관련 된 탄성과 히스테리시스 동작의 연구 활성화 및 점 탄성 매개 변수입니다. 상수-힘, 힘 펄스는 단계 같은 모양, 탄성 응답 인해 힘에 있는 변화에 아래에서 점 탄성, 전개 및 refolding 단백질 도메인에서 분리 된입니다. 낮은 볼륨 샘플 및 다양 한 기계적 섭 적용에 다양성, 힘-클램프 rheometry 대량 접근을 사용 하 여에서 단백질의 기계적 응답을 조사 하기 위해 최적화 됩니다.

그림 1A 는 L-£/ L8 하이드로 겔을 합성 하는 데 사용 하는 광 반응의 체계를 보여 줍니다. 그림 1B 는 photoactivation 전후 PTFE 튜브 히드로 혼합물을 보여줍니다. 그림 1C 트리 스 솔루션 내부 돌출된 L eGFP L8 하이드로 겔을 선물 한다. 하이드로 겔 샘플 노치 등 없는 구조적 결함이 있다. 명확 하 게 보이는 손상 Hydrogels 폐기 해야한다.
조립의 렌더링 및 힘-클램프 고분자의 분해 뷰 그림 2A 및 2B에 선물 된다. <strong cla...

새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 '죄'에 대 한 수 있습니다.

단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...

이 기술의 주요 장점은 단백질 하이드로겔 샘플에 제어된 힘 프로토콜을 적용하기 위해 비례 적분 유도 시스템인 PID를 사용하고 소량의 샘플을 사용한다는 것입니다. 힘 클램프에 대한 프로토콜은 데이터를 직접 해석할 수 있도록 하는 반면, 소량으로만 사용할 수 있는 단백질을 생산하기 어려운 경우 소량의 경우 매우 중요합니다. 이 기술의 의미는 단백질에 대한 하향 접힘, 재접힘 전이 특성을 사용하여 내구성 있는 탄성을 가진 새로운 생체 인식 재료를 개발하고 특성화하는 것으로 확장됩니다.이 방법은 한 번의 풀로 수십억 개의 단백질 분자를 측정하고 생물학적 조직에 특이적인 혼잡한 환경을 시뮬레이션함으로써 조직 및 생체 재료 역학의 질문에 답할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시약 용액 준비로 이 절차를 시작합니다. 단백질 기반 하이드로겔을 합성하려면 먼저 1밀리리터 주사기에 23게이지 바늘을 눌린 플런저로 고정합니다.그런 다음 면도날을 사용하여 10cm 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 PTFE 튜브를 자릅니다. 바늘과 주사기를 PTFE 튜브의 한쪽 끝에 부착합니다. 튜브의 두 번째 끝을 실란 용액에 삽입하고 실린지 플런저를 집어넣어 튜브를 채웁니다.튜브를 약 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 실란 용액을 제거하고 압축 공기로 튜브를 건조시킵니다. 이제 단백질 용액을 일정한 부피 비율로 1.5 밀리리터 튜브에 APS 및 Tris(bipyridine)ruthenium(II)chloride와 혼합합니다.광활성 용액이 완전히 혼합될 때까지 와류를 치십시오. 그런 다음 혼합물을 최대 속도로 원심분리하여 용액에서 기포를 제거합니다. 하이드로겔 광활성 혼합물을 테프론 튜브에 주입하는 동안 기포가 형성되어 샘플이 손상될 수 있습니다.기포 형성을 방지하려면 로딩 과정에서 테프론 튜브 끝을 용액 혼합물에 유지하고 주사기 플런저를 천천히 집어넣으십시오. 처리된 PTFE 튜브의 열린 끝을 광활성 혼합물에 삽입하고 주사기 플런저를 집어넣어 용액을 튜브로 끌어들입니다. 이제 적재된 튜브를 100와트 수은 램프에서 약 100cm 떨어진 곳에 놓아 가열을 방지하고 실온에서 최대 30분 동안 보관하십시오.바늘에서 튜브를 제거하고 면도날로 하이드로겔 끝 근처의 튜브 가장자리를 자릅니다. 그런 다음 무딘 24게이지 바늘을 사용하여 하이드로겔을 Tris 용액으로 압출합니다. 압출 중 또는 기포로 인해 형성될 수 있는 결함이 있는지 겔을 육안으로 검사하고 결함이 있는 겔을 폐기하십시오.기기 제어 프로그램을 시작하고 보이스 코일 모터를 켭니다. 그런 다음 코일 위치를 범위의 끝을 향하는 값으로 설정합니다. 후크를 Z 방향으로 변위시키고 X 방향의 절곡부에 정렬합니다.그런 다음 X 방향에 대한 마이크로미터 나사의 값을 기록합니다. 이제 봉합사 가닥 끝에 느슨한 이중 오버핸드 매듭을 묶어 루프의 직경이 약 4mm가 되도록 합니다. 그런 다음 가닥에서 고리를 자릅니다.반복하여 두 번째 루프를 만듭니다. 그런 다음 힘 센서에 연결된 후크에 두 개의 루프를 놓습니다. 실험 챔버에 Tris 버퍼를 채우고 의료용 핀셋을 사용하여 하이드로겔 샘플을 채워진 챔버로 옮깁니다.보이스 코일과 힘 센서 후크를 솔루션 표면 가까이에 놓고 모든 방향으로 후크를 XYZ 포지셔닝 매니퓰레이터와 정렬합니다. 의료용 핀셋을 사용하여 단백질 하이드로겔 샘플의 양쪽을 보이스 코일과 힘 센서에 연결된 고리에 걸어둡니다. 일반적인 오류는 부착 과정에서 하이드로겔 샘플 주위의 봉합사 루프가 과도하게 조여지는 것입니다.이는 노치(notch) 형성 및 하이드로겔 샘플의 절단으로 이어질 수 있습니다. 의료용 핀셋으로 봉합 루프의 양쪽 끝을 잡고 동시에 당겨 보이스 코일 후크의 하이드로겔 샘플 주위의 한쪽 봉합 루프를 조심스럽게 조입니다. 힘 센서에 연결된 루프에 대해 이 단계를 반복합니다.미끄러짐을 방지하기 위해 각 후크의 구부러진 부분에 있는 봉합 루프를 조입니다. 이러한 절곡부를 참조점으로 사용하여 후크 사이의 제로 분리를 찾습니다. 의료용 가위를 사용하여 봉합사의 여분의 길이를 자릅니다.Z축을 따라 Z축을 따라 부착된 하이드로겔을 실험 챔버 쪽으로 이동하여 하이드로겔을 실험 용액에 담급니다. 하이드로겔 s를 정렬합니다.amp겔이 스트레스를 받지 않도록 매니퓰레이터를 사용하여 YZ에 있습니다. 힘 센서를 영점화하고 젤이 힘을 받기 시작할 때까지 X 마이크로미터 단계를 사용하여 두 개의 후크를 분리합니다.이 경우 마이크로미터 나사를 X 방향으로 약간 뒤로 돌립니다. 보이스 코일 모터와 센서에 대한 두 매니퓰레이터의 위치를 기록합니다. 그런 다음 이러한 값과 이전에 측정된 값 간의 차이를 사용하여 실험 시작 시 테더링 후크 간의 정확한 간격을 계산합니다.원하는 로딩 속도에서 힘을 증가시켜 force-ramp 사이클을 수행하려면 시작 및 최종 force 값과 flipped V로 나타나는 프로토콜의 지속 시간을 입력한 다음 약 200초 동안 지속적으로 낮은 force를 입력하여 다음 cycle 전에 단백질 도메인이 다시 접힐 수 있도록 합니다. 30초 동안 낮은 힘을 가하여 항력 프로토콜을 수행합니다. 그런 다음, 정의된 시간 동안 힘을 일정한 힘으로 증가시킨 다음 단백질 도메인이 다시 접히고 겔 탄성이 회복될 수 있도록 300초 이상 동안 힘을 동일한 낮은 값으로 다시 냉각합니다.마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다. 각 측정은 슬랙 곡선으로 시작합니다. 두 개의 선을 장착하여 센서에 가해지는 영하중과 실제 젤 길이가 결정됩니다.실제 겔 길이는 끼움의 교차점과 마이크로미터 나사의 위치에서 계산됩니다. force-clamp 유변 물성 측정 시스템은 두 가지 유형의 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 힘 램프 모드에서 하이드로겔 샘플은 시간이 지남에 따라 반전된 V.In 일정한 힘 모드와 유사한 힘 변경 프로토콜을 경험하며, 적용된 응력은 계단과 같은 패턴으로 변합니다.측정하는 동안 PID 시스템은 힘 프로토콜에서 사전 정의된 설정점을 따르도록 코일 위치를 변경하여 하이드로겔 확장을 조정합니다. 그런 다음 측정된 확장을 실제 겔 길이로 나누어 변형률을 계산합니다. 응력은 하이드로겔 샘플의 단면적에 가해진 힘을 나누어 측정합니다.Force Ramp 트레이스는 응력 대 변형으로 가장 잘 표현됩니다. Young의 계수는 하중 단계 동안 기울기 측정에서 계산할 수 있습니다. 히스테리시스는 단백질을 풀고 다시 접을 때 오는 에너지 소실을 제공합니다.일정한 힘 추적은 시간의 함수로 가장 잘 표현됩니다. 변형률의 변화는 이중 지수를 피팅하여 풀림 및 재접힘 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 단백질을 추가하기 전에 튜브에서 실란을 건조하고, 단백질 혼합물을 원심분리하여 기포를 제거하고, 튜브 내부에 단백질 혼합물을 주입한 후 기포를 확인하고, 튜브에서 압출된 후 기계적으로 손상된 하이드로겔을 버리는 것을 기억하는 것이 중요합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 처음에는 하이드로겔 샘플에 손상을 주지 않고 수술용 봉합사를 사용하여 겔을 후크에 부착하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 튜브에서 젤을 빼내면 하이드로겔도 손상될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 저용량 하이드로겔 샘플에 일정한 힘 프로토콜을 적용할 수 있습니다.이러한 실험을 통해 탄성 및 점탄성 거동을 분리하고 벌크 접근 방식으로 단백질 풀림 및 접힘 역학을 연구할 수 있습니다. 개발 후 재료 과학 분야의 연구원들은 조직 공학 골격, 약물 전달 시스템 및 3D 프린팅을 위한 생물학적 잉크 역할을 할 수 있는 탁월한 잠재력을 가진 엔지니어링 폴리단백질 기반 하이드로겔과 같은 새로운 소프트 생체 재료를 탐구할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 기반 하이드로겔의 역학에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 근섬유의 등척성 반응 또는 피부와 같은 조직의 탄력성 측정과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

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세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.

mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

세포 및 약물 전달을 위한 장치로서 RGD 기능성 하이드로겔을 합성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 알킨 변성 폴리아크릴산(PAA)과 RGD-아지드 유도체 사이의 구리 촉매 알카인-아지드 고리첨가(CuAAC)가 포함됩니다. 하이드로겔은 마이크로파 보조 중축합을 사용하여 형성되며 물리화학적 특성이 조사됩니다.

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

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부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

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여기, 프로토콜 캡슐화 및 poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fluorogenic 매트릭스 metalloproteinase (MMP)와 기능성된에 세포 배양에 대 한 제시는-분해 펩 티 드. 세포질 MMP와 대사 활동 표준 microplate 리더를 사용 하 여 하이드로 겔 문화에서 직접 측정 됩니다.

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단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

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