Name: 식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 학습하세요 곤충 세포와 바클로바이러스를 이용한 식물 분비 단백질 대량 생산 프로토콜을. 저비용으로 재조합 단백질을 생산하여 결정학 및 구조생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품 Guozhou Xu에 대 한 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 새로운 교수 시작 자금에 의해 지원 되었다.

참고: 분 비 식물 단백질 표정 및 결정 화에 대 한 수정 된 식 벡터와 곤충 셀/잠재 시스템 사용 됩니다.
1. 식물 단백질 분 비 식 GP67 신호 펩 티 드와 잠재 식 벡터의 수정
<ol><li>5' BglII 절단 사이트13, GP67 분 비 신호 순서, 노트, BamHI, EcoRI, StuI, 사리, SpeI, XbaI, PstI, 및 XhoI (그림 1A)의 다중 복제 사이트를 포함 하는 DNA 파편을 음성 합성. 참고: BglII와 BamHI 소화 이후 같은 접착제 끝 귀착되 었 다 DNA, 선형화 벡터 단련된 결 찰 순서에 BglII 및 BamHI 사이트 여 쪼갤은 시퀀스를 변경 될 것입니다 하는 동안 소화 DNA 단편에 선 수 있습니다. BglII 또는 BamHI14.</li>
	<li>BglII와 XhoI, DNA의 다이제스트 4 µ g 그리고 BamHI 및 XhoI14는 식 벡터 DNA의 4 µ g. Dna 농도 반응 버퍼 (50mm 칼륨 아세테이트, 20 mM 트리 아세테이트, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 25 ° C에서) x 1에 각 제한 효소의 10 단위를 혼합 하 고 37 ° C 4 h에서 혼합물을 품 어.<ol>
<li>삭제 DNA 파편 및 선형화 벡터 DNA는 DNA 젤 추출 키트15정화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 x T4 DNA 리가 반응 버퍼 (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1 ATP, 그리고 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° C에서)와 T4 DNA의 5 대 1을 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서 조각 리가입니다. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. 5-10 식민지를 선택 하 고 220 rpm 및 16 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 파운드 매체의 2 mL에 각 식민지를 성장.</li>
	<li>DNA miniprep 키트17 각 플라스 미드 DNA를 추출 하 고 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG 뇌관 DNA 연속 클론을 확인.</li>
	<li>PCR 증폭 A. thaliana TDR 유전자 조각 인코딩 잔류물 구성 합성 TDR 유전자에서 30-642 (뇌관을 앞으로: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, 반전 뇌관: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). 0.5 m m dNTP 믹스, 0.2 µ M 뇌관, 템플릿 DNA의 0.1 µ g, 0.4 m m MgCl2및 DNA 중 합 효소의 1 반응 단위를 포함 하는 DNA 중 합 효소 반응 버퍼에 30 사이클에 대 한 DNA를 증폭.<ol>
<li>95 ° c 30에 대 한 초기 변성 PCR 주기 단계에 대 한 설정 들, 그리고 다음 30 주기 변성 95 ° C에서 30 s, 30 s 및 1 분에 72 ° C에서 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 확장에 대 한 55 ° C에 어 닐 링.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 파편 및 노트와 BamHI 제한 endonuclease 효소 수정된 벡터 다이제스트. 선형화 벡터와 유전자 단편 선 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 조각 T4 DNA 리가 반응 버퍼 및 T4 DNA 리가의 5 단위를 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. DNA 시퀀싱에 의해 정확한 복제를 확인 합니다.</li>
</ol>2. 식물 단백질 분 비 식 곤충 Hemolin 신호 펩 티 드와 잠재 식 벡터의 수정
<ol><li>5' BglII 절단 사이트13, 곤충 hemolin 분 비 신호 순서, 노트, BamHI, EcoRI, StuI, 사리, SpeI, XbaI, PstI, 및 XhoI (그림 1B)의 다중 복제 사이트를 포함 하는 DNA 파편을 음성 합성.</li>
	<li>BglII와 XhoI, DNA의 다이제스트 4 µ g 그리고 BamHI 및 XhoI14는 식 벡터 DNA의 4 µ g. Dna 농도 반응 버퍼 (50mm 칼륨 아세테이트, 20 mM 트리 아세테이트, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 25 ° C에서) x 1에 각 제한 효소의 10 단위를 혼합 하 고 37 ° C 4 h에서 혼합물을 품 어.<ol>
<li>삭제 DNA 파편 및 선형화 벡터 DNA는 DNA 젤 추출 키트15정화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 x T4 DNA 리가 반응 버퍼 (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1 ATP, 그리고 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° C에서)와 T4 DNA의 5 대 1을 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서 조각 리가입니다. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>100 µ L DH5α 유능한 세포의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시에 식민지를 선택 합니다. 5-10 식민지를 선택 하 고 포함 하는 100 µ g/mL 암 피 실린 220 rpm 및 16 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서의 2 mL 파운드 매체에 각 식민지를 성장.</li>
	<li>DNA miniprep 키트17 플라스 미드 DNA를 추출 하 고 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG 뇌관 DNA 연속 클론을 확인 합니다.</li>
	<li>PCR 증폭를 A. thaliana 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 유전자 조각 잔류물 20-237 합성 PRK3 유전자 구성에서 인코딩 (뇌관을 앞으로: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, 반전 뇌관: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC)입니다. 0.5 m m dNTP 믹스, 0.2 µ M 뇌관, 템플릿 DNA의 0.1 µ g, 0.4 m m MgCl2및 DNA 중 합 효소의 1 반응 단위를 포함 하는 DNA 중 합 효소 반응 버퍼에 30 사이클에 대 한 DNA를 증폭.<ol>
<li>초기 변성 95 ° C 30에 대 한 설정에 대 한 PCR 주기 단계 s, 그리고 다음 30 주기 변성 95 ° C에서 30 s, 30 s 및 30에 대 한 72 ° C에서 확장 하는 55 ° C에서 어 닐 링 각 주기 및 5 분 동안 72 ° C에서 마지막 확장 내에서 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 파편 및 노트와 BamHI 제한 endonuclease 효소 수정된 벡터 다이제스트. 선형화 벡터와 유전자 단편 선 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 조각 T4 DNA 리가 반응 버퍼 및 T4 DNA 리가의 5 단위를 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. DNA 시퀀싱에 의해 정확한 복제를 확인 합니다.</li>
</ol>3. 생산 및 잠재의 증폭 재조합 형 단백질 표정 카세트를 품고 생성
<ol><li>DH10Bac 유능한 세포 잠재 식 시스템1의 프로토콜을 다음의 40 µ L 변환 구문 플라스 미드의 사용 100 ng. 48 h에 대 한 37 ° C에서 변환 접시를 품 어.</li>
	<li>각 변환 플레이트에서 두 개의 백색 식민지를, 각 식민지 파운드 매체 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin, 그리고 10 µ g/mL 항생물질의 2 mL에 접종. 추출 하 고 bacmid DNA 확인 잠재 식 시스템1 의 프로토콜을 따릅니다. Aliquot 20 µ L 각와 함께 두 개의 튜브에서 각 DNA-20 ° c.에 튜브를 저장 참고: 다음 단계는 무 균 작업이 필요합니다.</li>
	<li>27 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 µ g/mL (또는 100 I.U./mL) 문화 미디어 스 페니실린 항생제에 Sf9 세포의 단층 6 잘 플레이트 합류 점 80% 성장. 합류의 조직 문화 접시에 덮여 영역 비율에 따라 백분율을 예상 하고있다.</li>
	<li>2 살 균 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>1 관: 각 transfection에 대 한 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 100 µ L로 bacmid DNA의 20 µ L 희석. 튜브의 측면을 터치 하 여 희석을 부드럽게 혼합.</li>
		<li>2 관: 각 transfection에 대 한 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 100 µ L로 지질 transfection 시 약의 8 µ L를 희석. 6 x를 위아래로 pipetting으로 희석을 철저 하 게 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 솔루션을 결합, 3 x를 위아래로 천천히 pipetting으로 그들을 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 20-40 분 동안 그들을 품 어.</li>
	<li>각 잘 Sf9 단층의 세포 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 3 mL 2 x 세척. 각 transfection 지질-DNA 혼합물을 포함 하는 각 관에 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 0.8 mL를 추가 합니다. 3 x를 위아래로 천천히 pipetting으로 튜브의 내용의 부드럽게 혼합. Transfection 혼합 샘플을 오버레이 및 격판덮개에서 세척 미디어 발음.</li>
	<li>Transfection 혼합물의 추가 후에 품 어 27 ° c.에 5 h transfected 플레이트 10 %FBS 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 포함 된 완전 한 Sf9 세포 배양 매체 transfection 미디어 바꿉니다 항생제 페니실린 스. 4 d 27 ° C에서 transfected 접시를 품 어.</li>
	<li>수확 하 고 재조합 잠재 증폭.<ol>
<li>외피의 4 d 후 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 1010 x g 세포 파편을 제거 하 5 분에 상쾌한 스핀. 펠 릿을 삭제 하 고 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 4 ° C에서 최대 1 년 동안 그것을 저장. 참고: 이것은 P0 바이러스입니다. 그것은 시간이 더 긴 기간 aliquoted 및-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>각 재조합 바이러스를 증폭, 80% 합류 150 mm 접시에 Sf9 세포의 단층 성장. 접시에서 미디어를 발음 접시에 세포 부착에 P0 바이러스의 2 개 mL를 추가 하 고 품 어 27 ° C 배양 기에서 1 시간에 대 한 접시. 셀으로 매체를 혼합 판 매 15 분 바위.<ol>
<li>10 %FBS 100 µ g/mL (100 I.U./mL)를 포함 하는 완전 한 그레이스의 미디어의 25 mL를 추가 항생제 페니실린 스. P1 통행 바이러스를 27 ° C 인큐베이터에서 3 d 격판덮개를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>살 균 50 mL 원뿔 튜브에 세포 파편을 제거 하 5 분에 대 한 1010 x g 에서 스핀 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 고 최대 1 년 동안 4 ° C에서 그것을 저장 합니다. 참고: P1 바이러스 수 있습니다 aliquoted-80 ° C에서 저장 시간이 더 긴 기간에 대 한.</li>
		<li>P1에서 P2 통행 바이러스를 증폭, 90% 합류를 150 mm 접시에 Sf9 세포의 단층을 성장 하 고, 접시의 미디어를 발음 하 고, 접시, P1 바이러스의 2 개 mL를 추가 한 27 ° C 배양 기에서 1 시간을 위해 그것을 품 어.</li>
		<li>3.8.2 및 3.8.3 바이러스의 P2 및 P3 구절을 단계를 반복 합니다. 2 개월 이상 P3 바이러스를 저장 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 단백질 식, NiNTA, 및 결정 화 정화
<ol><li>27 ° C 배양 기 통에 100 rpm에서 2 x 106 의 밀도 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 문화 미디어 페니실린 스 항생제에 Hi5 곤충 세포의 1 L 문화. 570 x g 5 분에 셀 아래로 회전 시키십시오, 가만히 따르다는 상쾌한, 갓 생산된 P3 바이러스의 20 mL에 셀 resuspend 그리고 1 헤 부드럽게 흔들어 각 15 분 x 1 셀 resuspend 스핀 병에 대 한 실내 온도에서 보관.</li>
	<li>와 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 문화 미디어 스 페니실린 항생제의 1 l 셀을 전송 하 고 72 h. 스핀 1,010 x g 5 분에 셀 아래에 27 ° C 배양 기 통에 100 rpm에서 셀 문화는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>사용 pH 지시자 0.1 M HCl 또는 0.1 M NaOH 추가 하 여 상쾌한 8.0의 pH를 조정 하 고 최종 농도, pH 8.0, 100 mM NaCl, 20 mM Tris 버퍼 및 5mm 이미에 바인딩 버퍼를 추가를 제거 합니다. 표현된 그의 태그 재조합 단백질의 예상된 수익률에 따라 NiNTA 수 지 (10-40 mL)의 일정 금액을 추가 합니다.<ol>
<li>수 지 1 h. 워시 4 ° C에서 낮은 속도와 자기 파문에 솔루션을 혼합 하 고 표준 NiNTA 정화 프로토콜18다음 바인딩된 단백질을 elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이온 교환 정제 단백질 주제와 젤 여과 착 색 인쇄기, 뿐만 아니라 다른 단백질 정화 방법, 균질 샘플을 얻을. 참고: TDR ectodomain, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl 젤 여과 버퍼로 사용 했다. PRK3 ectodomain, 20 m m 두번째-트리 스에 대 한 pH 6, 100 mM NaCl 선호 젤 여과 버퍼로 사용 되었다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

크기 및 생물 학적 시스템에 단백질의 수천의 안정성에 다양성을 감안할 때, 그것은 종종 경험적 연구에 대 한 실험실을 분리 표현 시스템을 결정 하는 특정 단백질의 표현에 대 한 선택. 대장균 식 시스템은 종종19최대 규모 박테리아, 문화 미디어, 그리고 상대적으로 완화의 저렴 한 비용의 짧은 라이프 사이클에 따른 단백질 표정에 대 한 첫 번째 선택. 그러나 60 kDa,, 대장균 을 사용 하 여 보다는 더 크기와 큰 진 핵 단백질의 표현에 대 한 시스템은 종종 포함 본문 또는 집계20에서 불용 성 단백질에 결과. 그 어려운 단백질의 표정을 위해, 그리고 다른 secreted 단백질에 대 한 잠재-곤충 세포 표현 시스템 전자 대장균보다 더 유리한 수 있습니다. 진 핵 단백질 분 비를 표현 하는 경우에 특히이 수정된 잠재 곤충 세포 표현 시스템 선호 하는 선택 일 수 있었다.
<p class=...

특히 x 선 결정학 연구에 대 한 생화학 및 생물 characterizations 위해 균질 재조합 단백질의 대량 생산의 수 연구 실험실을 위한 필수적입니다. 대장균, 효 모, 곤충 세포, 포유류 세포, 식물 세포, 등 그들의 사이에서 많은 확고 분리 식 시스템, 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템은 가장 중 일반적으로 구조적으로 접힌된 대형 재조합 진 핵 단백질의 단백질 결정 화1대량 생산 기법을 사용.
잠재 식 시스템의 식 벡터는 강한 polyhedrin 또는 재조합 세포내 단백질2,3의 높은 수익률을 생산 하는 P10 발기인을 포함 하도록 설계 되었습니다. 재조합 잠재 수 있도록, 관심사의 유전자 Autographa californica nucleopolyhedroviral 멀티 게놈의 polyhedrin (polh) 로커 스를 포함 하는 곤충 벡터에 복제 됩니다. 결과 구문 다음 시퀀스 및 올바른 열려있는 독서 프레임 (ORF) 확인. 올바른 구문 다음 transfection의 과정을 통해 호스트 곤충 세포에 도입 되었습니다. 관심사의 유전자는 상 동 재조합에 의해 바이러스 성 게놈에 삽입 됩니다. 이 이벤트는 재조합 생산 하는 후 복제 바이러스 입자1언약궤 재조합 형 바이러스 성 게놈의 생산에서 발생 합니다.
곤충 세포 표현 시스템에서 가장 일반적으로 사용 되는 Sf9 및 높은 5 (Hi5) 세포 이다. Sf9 세포는 Sf21, Spodoptera frugiperda의 번데기 난소 세포에서 파생 된의 클론 분리 되며 Hi5 세포 클론 분리는 부모의 Trichoplusia ni 난소 세포 선 테네시-3684,5에서 파생 된. Hi5 셀 일반적으로 재조합 단백질6의 더 높은 양을 생성을 선택 하는 동안 공동 transfections, 바이러스 증폭 및 상 패 분석 실험, Sf9 세포에 지휘 된다. Hi5 세포는 돌연변이 바이러스를 생산 하는 그들의 추세 때문에 세대 및 바이러스 progenies의 증폭에 적합 하지 않습니다 지적 가치가 있다. 전통적으로, 25-30 ° C의 온도 범위는 곤충 세포의 경작에 좋은 것으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 27-28 ° C 곤충 세포 성장과 감염7,8에 대 한 최적의 온도 보고 되었습니다.
강한 신호 순서 선행 하는 유전자의 소개 secreted 단백질의 높은 식이 필요 합니다. 신호 순서 효율적으로 단백질 분 비와 포스트 번역 상 수정 적절 한 접는 및 안정화3에 필요한에 대 한 바인딩과 그물에 번역 된 재조합 단백질을 안내 것입니다. 신호 펩 티 드 순서는 잠재 봉투 단백질 GP64/67, 꿀벌 melittin, 그리고 다른 사람, 같이 잠재 중재 식 시스템3분 비 재조합 형 단백질의 표정을 촉진 하기 위해 선택 되었습니다. GP67의 신호 펩 티 드의 도입 대상 유전자9의 내장 신호 펩 티 드를 사용 하 여 비교 secreted 재조합 단백질의 식 수율을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. Hemolin는 거 대 한 실크 나 방 Hyalophora cecropia, 박테리아 감염10시 유도의 hemolymph 단백질 이다. 유도 식의 상대적으로 높은 수준으로 인해 유전자의 신호 펩 티 드 순서 잠재 곤충 세포 시스템에서 재조합 단백질의 분 비 식 중재에 사용할 수 있습니다.
A. thaliana Tracheary 요소 차별화 금지 요인 수용 체 (TDR)와 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 둘 다 단백질11,12의 식물 신 부유한 반복 같은 수용 체 키 니 아 제 (LRR-RLK) 가족에 속하는 . 구조와 공장 수용 체 단백질의, 뿐만 아니라 다른 식물 분 비 단백질의 구조 및 생 화 확 적인 특성 있을이 가족의 기능을 공부 하기 위하여 잠재 곤충 세포 표현 시스템 수정 되었습니다. 단백질의 품질 및 생산 수율을 향상 시킵니다. TDR 및 PRK3의 세포 외 도메인 성공적으로 두 개의 수정된 식 벡터를 사용 하 여 잠재 곤충 세포 표현 시스템에서 표현 되었습니다. TDR 및 PRK3 단백질의 extracellular 도메인 모두 화 시키는 되는. 이 문서는 GP67 또는 발기인 및 여러 복제 사이 hemolin 신호 순서를 통합 하 여 표현과 많은 양의 두 수정된 잠재 식 벡터와 재조합 분 비 식물 단백질의 정화를 보고 사이트입니다.

<table><tbody><tr><td>인큐베이터 쉐이커</td><td>VWR</td><td>모델 Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>VWR</td><td>모델 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td>모델 J-6</td><td>스윙 버킷 로터</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA 중합효소</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td> DNA <td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>의 PCR 증폭용BIO-RAD</td><td>모델 C1000 터치</td> DNA <td></td></tr><tr><td>인큐베이터 셰이커</td>의 PCR 증폭 <td>뉴 브런 즈윅 과학</td><td>모델 I 24</td><td>박테리아 배양 성장을위한</td></tr><tr><td>고객 DNA 합성</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td> <td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>제한 엔도 뉴 클레아제</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>제한 엔도 뉴 클레아제</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>제한 엔도뉴클레아제</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>제한 엔도뉴클레아제</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>DNA 결찰</td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Agorase gel에서 DNA 정제</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>박테리아 배양에서 플라스미드 DNA 정제</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>DNA 겔 전기 pherosis</td></tr><tr><td>MAX 효율성 DH5&alpha; competen cell</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>DNA 결찰 혼합물의 형질전환용</td></tr><tr><td>Lennox L LB Broth</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>박테리아 배양</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>만들기용 Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>항생제</td></tr><tr><td>카나마이신 황산염</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>항생제</td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>항생제</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH10Bac competent cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>For making bacmid</td></tr><tr><td>DNA S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>DNA 형질전환용</td></tr><tr><td>CellFECTIN II 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>곤충 세포 형질주입 시약</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac 발현 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Baculovirus-insect cells expression kit</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>recominant Bacmid DNA</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>recominant Bacmid DNA</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Baculorirus 발현 벡터</td></tr><tr><td>Sf9 세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 단층 세포</td></tr><tr><td>Hi5 세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five 곤충 세포</td></tr><tr><td>Grace' s 곤충 배지, 비보충</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 세포 형질 주입 최소 배지</td></tr><tr><td>Grace' s 곤충 배지, 보충</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 단층 세포 배양 전체 배지</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>FBS Express Five 없는 Sf9 현탁 세포 배양 배지</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10,000 I.U./ml)</td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS 인증</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>바닥이 평평한</td></tr><tr><td>150 mm 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/케이스</td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 튜브/백</td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 스크류 캡 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 튜브/백</td></tr><tr><td>50 ml 원추형 스크류 캡 원심분리기 튜브</td><td>USA</td><td>Scientific 1500-1211</td><td>25 튜브/백</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>NiNTA 수지</td></tr><tr><td>pH 지시자 스트립</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>산도 0 - 14</td></tr></tbody></table>

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

그것은 구조 및 생화학 연구 재조합 분 비 진 핵 단백질을 표현 하는 과학자에 대 한 도전이 되었습니다. 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 일부 포스트 번역 상 수정 재조합 진 핵 세포 분 비 단백질을 표현 하는 데 사용 하는 시스템 중 하나입니다. 분 비 단백질 단백질 glycosylation, 이황화 결합 형성, 및 다른 포스트 번역 상 수정 분 비 경로 통해 라우팅할 필요가 있다. 를 개선 하기 위해 분 비 식물 단백질의 기존 곤충 세포 표현 잠재 식 벡터 중 하나는 GP67의 추가 또는 발기인 및 다중 복제 사이트 간에 hemolin 신호 펩 티 드 순서에 의해 수정 됩니다. 이 새롭게 설계 된 수정된 벡터 시스템은 성공적으로 애기 thaliana의 수용 성 재조합 분 비 식물 수용 체 단백질의 높은 수익률을 생산. 두 애기 TDR 및 PRK3 원형질 막 수용 체의 세포 외 도메인 표현된 식물 단백질의 x 선 결정학 연구 화 시키는 했다. 수정 된 벡터 시스템 뿐만 아니라 동물의 왕국에 있는 재조합 형 분 비 단백질의 표정을 위해 잠재적으로 이용 될 수 있는 향상 된 도구입니다.

그림 1에서 보듯이 두 수정된 pFastBac1 잠재 식 벡터는 GP67 또는 hemolin 신호 순서 대상 유전자의 본질적인 신호 순서를 대체 하는 secreted 단백질을 표현 하기 위해 사용 되었다. 바이러스 성 GP67와 곤충 hemolin 유전자 세포에 있는 높은 분 비 식 수준 입증 되었습니다. 융해 단백질이 두 신호 시퀀스 중 하나가 크게 분 비 식 수준 향상으로 예상 된다. 동일한 다 수 클로닝 위치 (MCS) 이러한 두 수정된 벡터에서 설계 했다. 노트 사이트 노트 8-뉴클레오티드 순서 보다는 가장 일반적인 6 뉴클레오티드 순서 다른 많은 금지 사이트에 있기 때문에 가장 5'-측면에 있는 MCS의 신중 하 게 배치 했다. 따라서, 노트 사이트는 대부분의 다른 제한 사이트, 제한 소화를 만들고 사용 하 여 다른 제한 사이트에 비해 더 실현 가능한 대부분 대상 유전자의 클로닝 보다 덜 대상 유전자에 존재....

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

이 방법은 결정학 및 Cryo-EM을 통한 단백질 구조 측정과 같은 분비 단백질의 생화학 및 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 구조 결정을 위한 상대적으로 저렴한 비용으로 많은 양의 재조합 분비 단백질을 생성한다는 것입니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다중 클로닝 부위에서 관심 분비 신호 서열인 5개의 프라임 BglII 절단 부위를 포함하는 DNA 단편을 합성합니다.다음으로, 4마이크로그램의 DNA를 BglII 및 X1로 분해하고, 4마이크로그램의 발현 벡터 DNA를 BamH1 및 X1로 분해합니다. 각 제한 효소 10 단위를 1X 농도 반응 완충액에서 DNA와 혼합합니다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 1X T4 DNA 리가아제 반응 완충액과 5단위의 T4 DNA 리가아제를 함유한 10마이크로리터의 결찰 반응 혼합물을 새로운 1.5 밀리리터 Eppendorf 튜브에 추가합니다.그런 다음 선형화된 벡터 DNA 100나노그램과 분해된 DNA 단편 400나노그램을 추가합니다. 섭씨 16도에서 16시간 동안 배양합니다. 5마이크로리터의 ligation 혼합물을 100마이크로리터의 DH5 알파 수용 세포로 변환하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Ampicillin LB 한천 플레이트에서 생성된 콜로니를 선택합니다.5개에서 10개 사이의 콜로를 선택하여 각각 밀리리터당 100마이크로그램의 암피실린을 함유한 2밀리리터의 LB 배지로 이동합니다. 이 군체를 섭씨 37도에서 220rpm으로 진탕하는 인큐베이터에서 16시간 동안 성장시킵니다. 그런 다음 DNA Miniprep 키트를 사용하여 각 플라스미드 DNA를 추출합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 순방향 염기서열분석 프라이머를 사용하여 DNA 염기서열분석을 통해 클론을 확인합니다. 100 나노그램의 구성 플라스미드를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 40마이크로리터의 DH10Bac 수용 세포를 변형시킵니다. 형질전환판을 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다.각 형질전환 플레이트에서 두 개의 흰색 콜로니를 선택하고 각 콜로니에 카나마이신, 겐타마이신 및 테트라사이클린을 포함하는 2밀리리터의 LB 배지를 접종합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 bacmid DNA를 추출하고 검증합니다. 각 DNA를 20마이크로리터의 튜브로 옮기는 두 개의 튜브로 분주합니다.그런 다음 진행할 준비가 될 때까지 튜브를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이후의 모든 단계는 무균 방식으로 수행해야 합니다. 6웰 플레이트에서 10%의 소 태아 혈청과 섭씨 27도에서 80% 합류점에서 밀리리터당 100마이크로그램의 페니실린-스트렙토마이신 항생제가 포함된 배양 배지에서 Sf9 세포의 단층을 성장시킵니다.각 transfection에 대해 1.5ml 원심분리 튜브에 항생제를 사용하지 않은 비보충 Sf9 세포 배양 배지 100마이크로리터를 추가합니다. 20마이크로리터의 바크미드 DNA를 각 튜브에 희석하고 부드럽게 튕겨 섞습니다. 다음으로, 각 transfection에 대해 1.5ml 튜브에 항생제를 투여하지 않은 100마이크로리터의 비보충 Sf9 세포 배양 배지를 추가합니다.8마이크로리터의 지질 transfection 시약을 각 튜브에 희석하고 위아래로 6회 피펫팅하여 혼합합니다. 이 두 용액을 결합하고 천천히 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 실온에서 20-40분 동안 배양합니다.세척할 때마다 항생제 없이 3ml의 보충되지 않은 Sf9 배양 배지를 사용하여 배양 플레이트의 각 웰을 두 번 세척합니다. 다음으로, 지질 DNA 혼합물을 포함하는 각 튜브에 항생제가 없는 0.8ml의 비보충 Sf9 세포 배양 배지를 추가합니다. 천천히 위아래로 세 번 피펫을 넣어 섞습니다.플레이트에서 세척 매체를 흡입하고 샘플에 transfection 혼합물을 오버레이합니다. 형질주입된 플레이트를 섭씨 27도에서 5시간 동안 배양합니다. 그런 다음 transfection 배지를 10% FBS 및 밀리리터당 100마이크로그램의 페니실린-스트렙토마이신 항생제를 함유한 완전한 Sf9 세포 배양 배지로 교체합니다.섭씨 27도에서 4일 동안 배양합니다. 그런 다음 상등액을 멸균 15ml 원추형 튜브에 모으십시오. 1, 010 회 g에서 5 분 동안 회전하여 세포 파편을 제거합니다.펠릿을 버리고 상등액을 깨끗한 튜브에 디캔팅합니다. 섭씨 4도에서 최대 1년 동안 또는 바로 사용할 수 있을 때까지 보관하십시오. 각 재조합 바이러스를 증폭하려면 먼저 150mm 플레이트에서 Sf9 세포의 단층을 80% 합류점으로 성장시킵니다.그런 다음 배지를 흡인하고 각 웰에 2밀리리터의 P0 바이러스를 추가합니다. 섭씨 27도의 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하고 15분마다 플레이트를 흔들어 배지와 세포를 혼합합니다. 다음으로, 10%FBS가 함유된 완전한 Grace's Media 25ml와 페니실린-스트렙토마이신 항생제 100마이크로그램을 추가합니다.P1 통로 바이러스를 얻기 위해 섭씨 27도의 인큐베이터에서 3일 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 상등액을 모으십시오. 1, 010 회 g에서 5 분 동안 회전하여 세포 파편을 제거합니다.상층액을 깨끗한 튜브에 디캔팅하고 최대 1년 동안 또는 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 바이러스를 P1에서 P2 통로로 증폭하려면 먼저 150mm 플레이트에서 Sf9 세포의 단층을 90% 합류점으로 성장시킵니다. 원하는 합류점에 도달하면 매체를 흡인합니다.P1 바이러스 2ml를 넣고 섭씨 27도의 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 증폭 단계를 반복하여 바이러스의 P2 및 P3 통로를 얻습니다. 본 연구에서는 두 개의 변형된 pFastBac1 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 표적 유전자의 고유 신호 서열을 대체하여 gp67 또는 헤몰린 신호 서열로 분비된 단백질을 발현합니다.PBEC gp67은 a-thal-leano 수용체 TDR의 세포외 도메인을 발현하는 데 성공적으로 활용됩니다. PBEC1 헤몰린은 세포외 도메인 PRK3를 발현하는 데 성공적으로 활용됩니다. 다음으로, 정제된 단백질을 밀리리터당 5mg으로 농축하고 결정화 스크리닝을 실시합니다.각 단백질에 대한 예비 결정을 산출한 조건은 20마이크로미터보다 큰 단백질 결정이 관찰될 때까지 최적화됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 크기 배제 크로마토그래피, 다각도 광 산란 및 기타 분석을 통해 재조합 단백질의 비응집 상태에 대해 단백질의 품질을 검사한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 단백질의 순도를 확인하는 것도 잊지 말고, 은색 염색으로도 확인하십시오.이 절차에 따라 X선 결정학 및 Cryo-EM과 같은 다른 방법을 수행하여 생성된 단백질의 3차원 구조와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 식물과 포유류에서 분비되는 단백질의 구조적, 기능적, 생화학적 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 아가로스 젤의 DNA 밴드를 시각화하기 위해 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 자외선 차단제, 안면 보호대, 눈 고글, 실험실 가운을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.또한 완충제를 만드는 동안 강산과 염기를 취급할 때 주의하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Kindlins는 인테그린을 ​​통해 세포 부착 해 기본적인 그러나 그들의 연구는 세균의 호스트에서 재조합을 표현에서 발생하는 어려움에 의해 방해되었다. 우리는 여기에서 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 효율적인 생산 방법을 설명합니다.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl- 채널을 활성화.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

학습하세요 곤충 세포와 바클로바이러스를 이용한 식물 분비 단백질 대량 생산 프로토콜을. 저비용으로 재조합 단백질을 생산하여 결정학 및 구조생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

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