Name: 조직 Microcolumns 수확 용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 배우세요 피부 재생 연구를 위한 최소 침습적 전층 피부 채취 기법입니다. 특수 제작된 채취 바늘을 사용하여 기증 부위 흉터를 최소화하면서 고효율 조직 수집이 가능합니다. 이 방법은 자가 조직 이식 및 상처 치료 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 육군, 해군, NIH, 공군, 버지니아 및 건강 업무 상 번호 아래 기업 II 노력을 지원 하기 위해 의해 부분적으로 지원 W81XWH-13-2-0054입니다. 미국 육군 의료 연구 수집 활동, 820 챈들러 스트리트, 요새 Detrick, MD 21702-5014 수 여 하 고 관리 수집 사무실입니다. 의견, 해석, 결론, 및 권장 사항 저자의 이며 반드시 국방부에 의해 승인 되지 않습니다.

모든 작업 관련 된 살아있는 동물 그리고 동물 조직 샘플 매사추세츠 일반 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 바늘의 생산
<ol><li>생산 단계의 설정<ol>
<li>게시물에 여성 luer 잠금 커넥터 연결 하 고는 luer 잠금 (그림 1A) 무대의 중앙에 회전 무대에 게시물을 탑재.</li>
		<li>이 첫 번째 회전 무대를 세로로 놓고 수직으로 (그림 1B) 두 번째, 수평 회전 단계에 그것을 마운트.</li>
		<li>2-축 번역 단계 (그림 1B)에 수평 회전 무대를 탑재 합니다.</li>
		<li>광학 브레드보드 등 안정적인 표면 결합 고정.</li>
		<li>별도로 회전/번역 조합 단계 (그림 1C)에 병렬로 브레드보드와 luer 잠금 커넥터와 대략 같은 높이에 위치 하는 도구와 같은 브레드보드 회전 도구를 탑재 합니다.</li>
		<li>회전 도구 (더 작은, 낮은 모래 다이아몬드 컷 바퀴 더 큰, 더 높은 모래 돌 잘라 바퀴 위에)에 동심 두 잘라 바퀴를 설치 (그림 1D). 참고: 9 m m에 대 한 두 바퀴의 직경 차이 일반적으로 충분 한.</li>
		<li>가벼운 오버 헤드가 절단 바퀴를 겨냥 하는 빛과 회전 도구를 통해 조정 가능한 팔으로 소스 위치입니다.</li>
		<li>을 강화 하기 위해 시각화를 놓고 해 현미경 생산 설치 되도록 접 안 렌즈 (그림 1C) 절단 디스크에 초점을 맞추고. 참고: 또는 사용자가 입을 수 있습니다 돋보기 안경.</li>
	</ol>
</li>
	<li>바늘 팁의 모양 변경<ol>
<li>보호 안경 및 눈 또는 항공에서 미세 금속 입자를 방지 하기 위해 수술 용 마스크를 착용 하십시오.</li>
		<li>피하 주사 바늘의 적절 한 측정 실험 요구 사항에 따라 크기를 선택 합니다.</li>
		<li>각 수확 바늘에 원하는 길이를 표시 합니다. 참고: 돼지 피부에서 수확에 대 한 8 m m 바늘은 일반적으로 충분 한; 길이 다를 수 있지만 실험 요구에 따라 (예., 대상 피부 조직, 바늘 게이지 크기의 두께). 일반적으로, 19-게이지 바늘은 돼지 피부.</li>
		<li>낮은 회전 도구, 파워와 수직으로 바늘을 바늘의 초과 길이 잘라 외부 절단 디스크의 가장자리를 사용 하 여 지점에서 표시 1.2.3 단계에서.</li>
		<li>생산 단계에 단축, 무딘 바늘 여성 luer 잠금 커넥터에 연결 합니다.</li>
		<li>바늘은 12 ° 각도 절단 디스크에 평행 하 게 회전 도구 (변경 각도 바늘 삽입에 필요한 힘에 영향을 줄 것 이다)에 수평 회전 무대를 조정 합니다.</li>
		<li>오버 헤드 라이트를 켜고 빛 바늘의 중간 (세로) 떨어져 반영 될 때까지 확대, 아래 바늘을 관찰 하는 동안 그것의 위치를 조정.</li>
		<li>내부 (다이아몬드) 디스크 (그림 2A) 절단으로 바늘을 회전 도구를 다음 번역 단계를 사용 하 여 전원.</li>
		<li>절단 디스크 (로 오버 헤드 라이트의 반사는 중간 선 따라 시각) 바늘의 약 중간에 도달할 때까지 천천히 절단 디스크에 대 한 바늘을 전진 계속.</li>
		<li>서서히 미세한 폴란드어 (그림 2B)으로 잘라 바늘 표면 마무리 외부 돌 바퀴에 내부 다이아몬드 바퀴에서 컷된 바늘 표면을 이동 합니다.</li>
		<li>절단 디스크에서 바늘을 철회.</li>
		<li>수직 회전 무대를 사용 하 여 바늘 180 ° 회전 합니다.</li>
		<li>바늘의 다른 측면의 모양을 변경 하려면 단계 1.2.9-1.2.10를 반복 합니다. 참고: 바늘 지금 약 길이 (그림 2C 및 2D)의 두 절단 팁을 가져야 한다.</li>
		<li>생산 단계에서 바늘을 제거 합니다.</li>
		<li>깨끗 한 내부 바늘의 내경 보다 약간 작은 금속 와이어로 낳았다.</li>
		<li>날카로운 나무 막대기를 사용 하 여 (예., 목화 제보 주걱에 작은 나무 막대기의 끝에서 스냅 여), 새로 형성 된 바늘의 가장자리에 아직도 붙어 있을지도 모른다 어떤 털 제거. 참고: 수확 바늘 전해 수 있으며 필요한 경우 압력솥에 의해 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 피부 조직 수확
<ol><li>수확 바늘을 사용 하 여 비보 전 조직이 나 살아있는 동물에서 스킨 microcolumns를 수집.</li>
	<li>Ex vivo 피부에 대 한 (특히 샘플에서 피하 지방 누락 되거나 멀리 손질 했다), 얇은 조직 대상 조직 50 mL 원심 분리기 튜브의 개통에 또는 서로의 위에, n의 손상을 방지 하려면 조직의 두 가지 스택 eedle 팁 하드 표면에 대하여 그들을 쳐서입니다. 참고: vivo에서 살아있는 동물에서 수확에 대 한 로컬 lidocaine과 피 네 프 린 진통 및 출혈을 줄이기 위해 피부 주입에 의해 관리 될 것이 좋습니다.</li>
	<li>아래 설명 된 대로 필요, microcolumns의 양에 따라 수확 기구를 조립 한다.</li>
	<li>낮은 중간 볼륨 옵션:<ol>
<li>Microcolumns의 중간 금액을 작은 수확, 단순히 표준 주사기 작성 (10-20 mL 주사기는 일반적으로 잘 작동) 일반적인 염 분으로 수확 바늘에 연결.</li>
		<li>완전히 기증자 피부에 수확 바늘을 삽입 한 다음 그것을 철회.</li>
		<li>수확 바늘을 통해 염 분을 제거 하 고 바늘 구멍에 박 혀 microcolumn 추방에 주사기의 피스톤을 눌러.</li>
		<li>수확 과정을 속도를, 반복 단계 2.4.2 3 ~ 5 번 단계 2.4.3에서에서 microcolumns를 추방 하기 전에 합니다. 참고: 일반적으로 microcolumns의 후속 컬렉션을 쉽게 하기 위해 표준 셀 스 트레이너에 있는 microcolumns를 추방 하는 편리 하다.</li>
		<li>바늘 막힌 될 경우 추방 걸린된 조직 덩어리를 제거 하는 피스톤에 압력을 증가. 간단 하 게 증가 하는 압력 충분 하지 않으면, 삽입 바늘에 덩어리를 바늘 팁 개방을 통해 금속 와이어 낳았다.</li>
		<li>계속에 빠져들 microcolumns 염 분 또는 중간까지 건조를 방지 하기 위해 사용. 참고: 숙련 된 연산자, 위에서 설명한 방법은 초당 약 1 microcolumn의 속도로 microcolumns 수확 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>높은 볼륨 옵션:<ol>
<li>많은 양의 microcolumns의 컬렉션을 촉진 하기 위하여 건설 될 수 있는 간단한 흡입 기반 장치를 만듭니다. 참고: 장치 수확 바늘, 20 mL 주사기 luer 잠금 노즐, 흡입 (그림 3A), 및 살 균 흡입 용기에 일반적으로 사용 하는 흡입 어댑터와 함께 구성 되어 있습니다.</li>
		<li>20 mL 주사기에서 플런저를 제거 합니다.</li>
		<li>주사기 흡입 어댑터에 연결 합니다.</li>
		<li>수확 바늘 주사기 (그림 3B)에 연결 하 여 어셈블리를 완료 합니다.</li>
		<li>살 균 흡입 배관의 일부를 사용 하 여 살 균 흡입 용기에 흡입 어댑터를 연결 하. 수확 기구 수 유체 흐름 (유출 보다는 유입에 대 한 표시 된 용기 포트 연결을 해야 합니다)이 한 시 빨리 벗어나게 하는 용기에는 용기 입력에 연결 되어 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>부정적인 압력 소스에 장치를 연결 합니다. 참고: 필요한 압력 앞에서 설명한8로 하는 바늘 직경 및 길이에 따라 다릅니다. 이 원고에 설명 된 장치에 대 한 일반적인 수술 실에 흡입 시스템은 일반적으로 충분 합니다.</li>
		<li>수확 바늘 주사기를 연결 합니다.</li>
		<li>추수는 수확을 삽입 하 여 microcolumns 피부에 바늘. 참고: microcolumns는 주사기로 흡입, 이끌려 다음 흡입 용기에 플러시 될 것입니다.</li>
		<li>시스템을 플러시 수확 절차 동안 수확 바늘 메 마른 염 분의 용기에 간헐적으로 찍어. 참고:이 분 플러시는 microcolumn의 수송을 용이 하 게 하 고 그들은 수 화 된 유지 되도록 합니다. 또는, MFF luer 어댑터 luer 잠금 주사기, 그리고 매달려 염 분 드립 부 대에 또한 연결 튜브를 통해에 연결할 수 있습니다.</li>
		<li>계속 손에서 금속 와이어 또는 작은 수확 바늘의 내경 보다 약간 작은 바늘 계기. 바늘 막힌 된다, 바늘 구멍에 금속 와이어를 삽입 하 여 지울 수 있습니다.</li>
		<li>때 microcolumns 원하는 양의 용기에 축적, 흡입에서 장치를 분리 한 후는 microcolumns를 수집 하는 필터를 통해 밖으로 흡입 용기의 내용을 붓는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수확 후 기증자 사이트에 국 소 항생제 연 고를 적용 합니다. 참고: 추가 드레싱 일반적으로 필요 하지 않습니다 기증자 사이트.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+skin+grafting+and+treatment+of+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds.</a> Science. 346 (6212), 941-945 (2014).</li>
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</ol>

저자는이 기사에서 그들은 라이선스 받은 및 그들의 기관, 매사 추세 츠 종합 병원을 통해 로열티 수익에 설명 된 기술에 관한 특허에 공동 발명가. 제이 베 레모 또한 Medline 산업, 주식 회사,이 기술에 대 한 상업 라이센스를 보유 하 고 참조 합니다.

여기에 설명 된 방법은 비보에 큰 동물 연구, 상용 실험실에서 만든 도구를 사용 하 여 충분 한 수량에 조직 microcolumns 컬렉션을 사용 하기 위한 것입니다. 이 장치는 이전 조직 삭제 인간의 피부4,9 라이브 돼지 피부3에서 수확에 사용 되었습니다. 설명 하는 특정 매개 변수는 돼지에 사용 하기 위해 가장 적합 하는 것을 발견 했다. 그것은 같은 장치를 수정 및 설치류와 다른 작은 동물에서 수집 하는 조직에 대 한 적응 수 있습니다 하지만이 우리의 실험실에서 테스트 되지 않았습니다으로 예상 된다.
이 프로토콜의 중요 한 단계 수확 바늘은 충분 한 길이 (비효율적인 수확은 일반적으로 너무 짧은 되 고 바늘 때문)의 보장, 방지 하기 위해 수확 과정을 통해 액체에서 침수는 microcolumns를 유지 건조, ...

자가 피부 이식 상처 복구의 주류 이지만 그것은 기증자 사이트 부족 및 병 적 상태, 기존의 피부 이식1,2 대체 하는 새로운 치료 옵션을 개발 하 최근 몇 십년 간에서 공동된 노력을 선도 의해 제한 . 우리는 최근 기증자 사이트 사망률을 최소화 하면서 전체 간격 피부 이식의 혜택을 활용 하는 피부를 수확의 다른 방법 개발. 소형 (~0.5 m m 직경) "microcolumns"의 형태로 전체 간격 피부 수집, 기증자 사이트 신속 하 고 정상적인 상황에서 흉터 없이 치유 수 있습니다 (잠재적인 예외 아래 토론 섹션 참조)3. Microcolumns 가속 상처 폐쇄, 수축3, 줄이고 상처 침대에 직접 적용할 수 있으며 다양 한 표 피 및 피부 세포 유형 및 기능 부속 구조4에서 결여 되는 많은 복원 기존의 분할 간격 피부 이식 또는 현재 bioengineered 피부 대체5. 치유 증가 시키기 위해 microcolumns의 능력과 그들의 기증자 사이트 흉터 없이 치료 하는 둘 다 독립적으로 유효성이 검증 되지 다른 연구 그룹6,7.
우리는 이전 규모8; microcolumns 컬렉션을 사용 하기 실험실 수확 시스템 개발 그러나,이 시스템은 널리 사용할 수 있는 여러 사용자 지정된 구성 요소 구성 된다. 여기, 우리가 자세히 설명 과정에서 주로 상용 구성 요소, 대량 수확을 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 만든 간단한 컬렉션 시스템, 뿐만 아니라 바늘, 수확 생산. 이 원고에 설명 된 장치는 적합 한 시험관 및 동물 작업, 그러나 인 간에 있는 사용. 인 간에 있는이 기술을 적용 하기 위한 임상 장치 FDA 허가를 상업적으로 사용할 수 있지만 여기에서 다루지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>다이아몬드 휠</td><td>Dremel</td><td>545</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 (19G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-98</td><td>실험적 필요에 따라 다른 바늘 크기를 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>스톤 휠</td><td>Dremel</td><td>540</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (루어 잠금 장치 포함 20mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-124-967</td><td></td></tr><tr><td>흡입 어댑터</td><td>Tulip Medical</td><td>PA20BD</td><td>선택 사항, 대량 수확용</td></tr><tr><td>흡입 캐니스터</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-212</td><td>선택 사항, 대량 수확용. 사용하기 전에 소독하십시오.</td></tr><tr><td>흡입 튜빙</td><td>Medline</td><td>DYND50216H</td><td>옵션, 대량 수확용</td></tr></tbody></table>

조직 microcolumns 수확 용

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

이 원고는 전체 두께 피부 조직의 microcolumns를 수집 하는 데 사용할 수 있습니다 상용 구성 요소에서 만든 실험실 기구에 대 한 생산 과정을 설명 합니다. 작은 크기는 microcolumns의 수 기증자 기증자 사이트 전체 두께 조직 활성화 피부 조직의 포함 하 여 모든 세포와 세포 외 구성 요소의 관련을 수확 하면서 흉터를 유발 하지 않고 신속 하 게 치료 하는 사이트 깊은 피부 지역와 부속 피부 구조는 기존의 조직 공학 기법을 사용 하 여 성공적으로 복제를 아직 있다. microcolumns을 치료, 보강 피부 상처에 직접 적용 될 수 있다 또는 다른 조직 공학 접근에 대 한 헌 세포/조직 소스로 사용할 수 있습니다. 수확 바늘 표준 피하 주사 바늘, 수정 하 여 만들어진 고 수확 하는 적은 양의 조직에 대 한 단독 사용 하거나 간단한 흡입 기반 컬렉션 시스템 (또한 일반적으로 사용 가능한 실험실에서 만든)을 함께 수 있습니다. 높은-볼륨에서 큰 동물 모델 연구를 촉진 하기 위하여 수확.

수확 바늘 microcolumns 약 80-90% 성공 속도, 전체 두께 피부 조직의 수집 수 그리고 각 microcolumn 표 피, 진 피, 그리고 피하 지방을 (그림 4)를 포함 해야 합니다. 수확의 성공률은 낮은, 또는 조직에 바늘을 삽입 하기 어려워진 경우 새로운 바늘 가능성이 필요 하다. 수확에 대 한 성공률도 새 바늘으로 일관 되 게 낮은 경우 바늘 너무 짧은 아마 있습니다.
Vivo에서사용 하는 경우 다시 epithelialization는 일반적으로 몇 일3이내 발생 기증자 사이트는 신속 하 게 치료 한다. Microcolumns3,4...

우리가 생산 하는 수확에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기 전체 간격 피부 조직 기증자를 유발 하지 않고 수집 하는 데 사용할 수 있는 바늘 흉터 사이트. 바늘 대량 수확을 달성 하는 간단한 컬렉션 시스템 결합 될 수 있다.

조직 Microcolumns 수확 용

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

이 방법은 천연 피부에 포함 된 다양한 세포 유형과 구조를 대체하는 방법입니다 피부 조직 재생 분야에서 필수적인 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자가 전체 두께 피부가 최소한의 기증자 부위 이환율로 수집 될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에 있는 연구 동료인 빌 Farinelli가 될 것입니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로덕션 단계를 설정하여 이 절차를 시작합니다. 로터리 도구에 두 개의 컷오프 휠을 동심으로 설치합니다. 더 작은 낮은 그리드 다이아몬드 컷오프 휠을 더 높은 그리드 스톤 컷오프 휠 위에 사용하십시오.오버헤드 광원을 회전 공구 위에 조절 가능한 암으로 배치하여 커팅 휠을 겨냥한 라이트를 배치합니다. 시각화를 향상시키기 위해, 원피스가 절단 디스크에 초점을 맞출 수 있도록 생산 설정에 해부 현미경을 배치합니다. 바늘 끝을 재구성 할 때, 눈이나 기도에 들어가는 미금속 입자를 방지하기 위해 보호 안경과 수술 마스크를 착용하십시오.실험 요구 사항에 따라 적절한 게이지 크기의 피하 바늘을 선택합니다. 각 수확 바늘에 의도 된 길이를 표시합니다. 외부 절단 디스크의 가장자리를 사용하여 로터리 공구에 수직으로 바늘을 낮추면 표시된 지점에서 바늘의 초과 길이를 차단합니다.단축된 무딘 바늘을 생산 단계의 여성 Luer 잠금 커넥터에 연결합니다. 수평 회전 스테이지를 조정하여 바늘이 로터리 공구의 절단 디스크와 평행하게 12도 각도로 되도록 합니다. 오버헤드 라이트를 켜고 바늘의 중간선에서 빛이 반사될 때까지 배율 하에서 바늘을 관찰하면서 위치를 조정합니다.로터리 도구의 전원. 그런 다음 번역 단계를 사용하여 바늘을 내부 절단 디스크쪽으로 진행합니다. 절단 디스크가 바늘의 중간선에 도달할 때까지 절단 디스크에 대해 천천히 바늘을 전진하십시오.내부 다이아몬드 휠에서 잘라낸 바늘 표면을 바깥쪽 돌 바퀴로 천천히 이동하여 절단 된 바늘 표면을 더 미세한 광택으로 마무리합니다. 절단 디스크에서 바늘을 철회합니다. 수직 회전 단계를 사용하여 바늘을 180도 회전합니다.바늘의 다른 쪽을 재구성하기 위해 이 단계를 반복합니다. 이제 생산 단계에서 바늘을 제거합니다. 바늘의 내경보다 약간 작은 금속 와이어로 내부 보어를 청소하십시오.날카로운 나무 막대기를 사용하여 새로 형성 된 바늘의 가장자리에 부착 할 수있는 버를 제거하십시오. 대량의 마이크로컬럼이 필요한 경우 20밀리리터 주사기에서 플런저를 제거합니다. 그런 다음 흡입 어댑터에 주사기를 부착합니다.주사기에 수확 바늘을 부착하여 조립을 완료합니다. 흡입 어댑터를 멸균 흡입 용기에 연결하기 위해 멸균 흡입 튜브를 사용합니다. 수확 장치가 액체가 방해받지 않고 캐니스터로 흐를 수 있도록 캐니스터 입력에 연결되어 있는지 확인하십시오.이제 장치를 음압 원에 연결합니다. 수확 바늘을 피부에 삽입하여 마이크로 컬럼을 수확하십시오. 수확 시술 시술 중에 수확 바늘을 멸균 식염수 용기에 간헐적으로 찍어 시스템을 플러시합니다.수확 바늘의 내경보다 약간 작은 금속 와이어 또는 바늘을 손에 보관하십시오. 바늘이 막히면 금속 와이어를 바늘 구멍에 삽입하여 지울 수 있습니다. 원하는 양의 마이크로컬럼이 캐니스터에 축적되면 장치를 흡입에서 분리합니다.그런 다음 흡입 캐니스터의 내용을 필터를 통해 부어 마이크로 컬럼을 수집합니다. 여기에 표시된 완성된 수확 바늘은 정면과 측면에서 바라보았다. 팁의 두 절삭점에 유의하십시오.수확 바늘은 대략 80 에서 90%의 성공률을 가진 전체 두께 피부 조직에서 마이크로 컬럼을 수집할 수 있어야 합니다. 이 그림에서 확인 표시는 1밀리미터를 나타냅니다. 각 마이크로컬럼에는 표피, 진피 및 일부 피하 지방이 포함되어야 합니다.마이크로 컬럼은 상처 치유에 직접 적용될 수 있거나 조합 구조를 생성하기 위해 다른 매트릭스 재료와 결합될 수 있습니다. 마이크로 컬럼은 또한 체외 연구를 위한 문화에서 유지될 수 있습니다. 대량 수확을 수행하는 동안 간헐적 식염수 플러시를 통합하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 방법은 피부 상처 수리를 위해 설계되었지만, 자가 조직 이식이 필요한 근육과 같은 다른 장기 시스템에도 유사한 원리를 적용할 수 있습니다.

apparatus-for-harvesting-tissue-microcolumns

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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