인간-iPSC 파생 Cardiomyocyte Syncytia의 수축 온도 제어 384-잘 접시에 Ca 민감한 형광 염료와 측정

이 방법은 심장 안전 약리학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 새로운 인간 의학은 정상적인 심장 리듬을 수정할 위험이 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 화합물을 신속하고 적당한 비용으로 평가할 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 동료 인 카밀 포니 (Camille Forny)가 될 것입니다. 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포 또는 HIPSCCM의 싱크로도의 수축측정을 준비하기 위해, 냉동 세포를 함유한 냉동세포를 2분간 섭씨 37도에 배치하는 것으로 시작한다. 각 튜브에서 하나의 신선한 50 밀리리터 원뿔 튜브로 해동 된 전체 셀 서스펜션을 전송합니다.

남은 세포를 회수하려면 각 튜브를 섭씨 37도의 예동도금 배지로 세척하고 해동 된 세포를 포함하는 50 밀리리터 원뿔 관에이 배지를 추가하십시오. 튜브에 따뜻한 도금 매체의 8 밀리리터를 추가하고 조심스럽게 서스펜션을 혼합합니다. trypan 블루 제외 방법과 혈종계를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.

따뜻한 도금 매체를 추가하여 밀리리터당 농도를 50, 000 세포로 조정합니다. 2개의 새로운 384웰 세포 배양 판으로 세포를 분배하기 위하여는, 우물 당 대략 12, 500 세포를 산출할 각 우물에 25 마이크로리터를 추가합니다. 가습 대기 중 384웰 플레이트에서 37도의 섭씨37도에서 총 3~4주 동안 5%의 이산화탄소를 배양합니다.

다음 날, 도금 매체를 따뜻한 유지 보수 매체의 50 마이크로 리터로 교체하십시오. 그 후 2~3일마다 유지 보수 매체의 절반을 교체하십시오. 7일, 14일, 21일에는 배지를 완전히 교체한다.

세포가 3~4주 동안 배양에서 유지되면, 그들은 자발적으로 수축싱크성을 형성하고, 이러한 수축에 화합물의 효과를 측정할 수 있다. 분석 당일, 제1 세포판이 플레이트 판독기 내부에 측정을 위해 배치되기 최소 2시간 전에 판독기를 켜고 가열 시스템을 섭씨 37도로 설정한다. 화합물 플레이트를 준비하려면, 실온 40 밀리리터의 유지 보수 매체에 1%의 부피 페니실린 연쇄절제술을 보충합니다.

매체가 워밍업하는 동안, 잘 당 스톡 용액의 1.5 마이크로 리터를 추가하여 두 개의 384 웰 화합물 플레이트에 테스트 화합물과 제어를 배포합니다. 1분 동안 100G의 화합물 플레이트를 원심분리합니다. 각 웰에 37 마이크로리터의 유지 보수 매체를 추가하고 1 분 동안 100G에서 다시 원심 분리합니다.

형광염을 준비하기 위해, 37도 섭씨 수조에서 1%의 부피페니실린 연쇄절제술로 보충된 유지 보수 매체의 따뜻한 100 밀리리터. 그런 다음, 칼슘에 민감한 형광염염과 담수의 혼합에 온난한 매체의 10 밀리리터를 첨가하여 주식 형광 매체로 재구성합니다. 플레이트 리더 소프트웨어를 시작합니다.

최소 10 헤르츠의 획득 빈도로 칼슘 파의 2 분 세그먼트를 기록하는 소프트웨어를 준비합니다. 각 세포 판에 대한 형광 배지를 만들기 위해 항생제를 사용하여 12 밀리리터의 따뜻한 유지 보수 매체로 3 밀리리터의 스톡 형광 배지를 희석시하십시오. 세포 판의 각 우물에 있는 20마이크로리터를 형광 매체 30마이크로리터로 교체하고 한 번 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.

그 직후 HIPSCCM이 판독기 온도에 60분 동안 적응할 수 있도록 플레이트 판독기에 플레이트를 넣습니다. 그런 다음 플레이트 리더 소프트웨어를 시작합니다. 적어도 10 헤르츠의 획득 빈도로 칼슘 파의 2 분 세그먼트를 기록하여 각 우물에 대한 기준치 박동 속도를 정의합니다.

데이터 수집 후 셀 플레이트가 장치 밖으로 전송되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 일부 소프트웨어 버전을 사용하면 완전히 종료되기 전에 레코딩을 중지해야 합니다. 플레이트 리더 로봇을 사용하여 테스트의 5마이크로리터를 피펫하고 화합물 플레이트에서 세포 판으로 잘 화합물을 참조합니다.

그 후, 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터 수집을 시작하여 화합물 첨가 후 5분, 15분, 30, 45 및 60분부터 칼슘 파의 2분 세그먼트를 기록한다. 데이터 분석을 시작하려면 ASCII 텍스트 파일의 플레이트 판독기 소프트웨어에서 각 기록 기간동안 원시 데이터를 내보냅니다. 그런 다음 데이터 분석 소프트웨어로 가져옵니다.

데이터 분석 소프트웨어에서 각 녹화 기간동안 기본 박동 주파수를 클립보드 복사본으로 내보냅니다. 각 우물과 매시간 지점에 대한 기본 박동 주파수를 추출합니다. 마지막으로 클립보드 붙여넣기를 통해 박동 주파수를 스프레드시트 소프트웨어로 가져오고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 계속합니다.

384웰 플레이트 의 기준선에서 칼슘 파도를 기록하는 것은 대부분의 경우 모든 우물이 접시에 걸쳐 가변성이 거의없는 규칙적인 구타 율을 드러낸다는 것을 보여줍니다. 심장 이온 채널의 차단제가 추가될 때, 심근세포의 리듬에 영향을 미칩니다. 느린 칼슘 채널의 차단제인 Amlodipine은 최대 1개의 마이크로몰라까지 농도 의존방식으로 리듬을 100% 이상 가속화합니다.

그리고 그 위에, 암로디핀은 구타를 체포. E-4031은, 급속지연정류 칼륨 채널의 차단제는 최대 10 마이크로몰러까지 농도 의존방식으로 리듬을 약 65~70%까지 감속시다. 테트로도톡신은 빠른 나트륨 채널의 차단제는 최대 1~30마이크로몰러의 농도 의존방식으로 리듬을 약 15% 감속하는 반면, 30 마이크로몰라, 테트로도톡신은 처음 5분 이내에 구타를 체포한다.

베프리딜은 심장 나트륨, 칼슘 및 칼륨 채널의 혼합 차단제인 Bepridil은 나트륨 채널 블록이 bepridil의 주요 작용임을 시사하는 전부 또는 전혀 효과가 없습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 세포 배양 판에서 파이펫 을 할 때 매우 부드러운 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 조직은 매우 깨지기 쉽고 파이펫에 의해 만지면 쉽게 손상됩니다.

인간 세포와 활성 약물과 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 안전 장갑과 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.