Name: 인간-iPSC 파생 Cardiomyocyte Syncytia의 수축 온도 제어 384-잘 접시에 Ca 민감한 형광 염료와 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 학습하세요 온도 제어 384-웰 플레이트에서 Ca 민감 형광 염료를 이용해 인간-iPSC 유래 심근세포 시시티아의 수축을 측정하는 고속 스크리닝 방법을. 이 기술은 심장 안전성 약리학에서 약물의 심장 리듬 영향을 신속하게 평가하는 데 활용됩니다.

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1입니다. 셀 접시의 준비
참고: 셀 접시 3-약물 효과의 측정 하기 전에 4 주를 준비 합니다.
<ol><li>실험의 하루 0 참고: 계획에 대 한 테스트 복합 응용 프로그램은 일 22-는 실험의 28 날에 수행할 수 있습니다.<ol>
<li>37 ° C에 물 목욕 켜고 (제조업체에서 제공)로 도금 매체의 40 mL 따뜻한. 참고: 셀을 사용 하 여 미디어와 함께 그들의 공급 업체에서 제공한 일치 문화 및 유지 보수.</li>
		<li>2 분 동안 물 목욕에 고정 된 셀을 포함 하는 cryotubes를 배치 하 여 hiPSC CM를 녹여.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브에 1ml 세포 현 탁 액을 신중 하 게 전송 합니다.</li>
		<li>각 cryotube 남은 셀을 검색 하 여 단계 1.1.3 포함 된 셀에서 세척 미디어 같은 원뿔 튜브를 추가 따뜻한 도금 매체의 1 mL로 씻는 다.</li>
		<li>세포 현 탁 액에 따뜻한 도금 매체의 신중 하 게 또 다른 8 mL를 혼합.</li>
		<li>Trypan 블루 제외 메서드와 hematocytometer8를 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다. 참고: 6 x 106 의 요구 한 384-잘 셀 접시는 우리의 경험에서 최대 냉동된 셀 간에 최대 20% 죽은 세포의 가능성 고려에 대 한 세포.</li>
		<li>5 x 105 라이브 셀/ml 따뜻한 도금 매체와 세포 현 탁 액을 조정 합니다.</li>
		<li>각 잘 (당 잘 약 12500 세포)에 25 µ L을 추가 하 여 두 384-잘 셀 접시에 세포 현 탁 액을 배포 합니다. 참고: 셀 접시 필요가 없습니다 어떤 매트릭스와 도장 수 ( 내용참조).</li>
		<li>포함 된 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 셀 번호판을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험의 주 1<ol>
<li>37 ° C와 1 %v / v 페니실린 스 솔루션과 보완 유지 보수 매체의 따뜻한 50 mL에 물 목욕을 켭니다.</li>
		<li>에 셀 플레이트의 각 잘 따뜻한 유지 보수 매체의 50 µ L에 도금 매체를 바꿉니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일 2-는 실험의 (27 일)까지 21 참고: hiPSC CMs 필요 하지 않습니다 어떤 뿌리고이 기간 동안은 비 분할 셀.<ol>
<li>3 일 유지 보수 매체의 모든 2-을 갱신 하 고 전적으로 7, 14, 21 일에 갱신. 참고: 22와 실험의 28 일 사이 형광 측정을 수행할 수 있습니다. 긴 기간이 시도 하지 않은 하지만 아직 괜찮을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 악기, 복합 판, 및 분석 결과 접시의 준비
참고: 악기, 복합 판, 준비 하 고 시험 접시의 22와 실험의 28 일 사이 약물 효과의 측정의 날에. 온도 제어와 적절 한 형광 필터 키트와 여기 빛 형광 플레이트 리더를 사용 하 여 소스. 예를 들어 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 형광 필터 키트 사용 (여기: 472 nm; 방출: 520-560 nm) 및 150 W 여기 광원 장치.
<ol><li>적어도 2 시간 전에 첫 번째 셀 접시 플레이트 리더 측정을 위해, 안으로 배치 하는 독자를 설정 하 고 37 ° c.에 난방 시스템을 설정 참고:이 또한 전에 저녁 행 해질 수 있다.</li>
	<li>준비 긍정적인 컨트롤, 산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 및 E-4031에서 DMSO, DMSO, 10 mM 및 H2O, 3.33 m m 0.33 m m 재고 솔루션으로 각각. 참고: 재고 솔루션 333-fold 희석 될 것 이다 때 그들은 셀에 추가 되 고 최종 테스트 1 µ M 산림, 30 µ M N6-cyclopentyl-아데노신, 및 10 µ M의 농도 달성 하는 목표는 안정적이 고 재현 효과 E-4031.</li>
	<li>333-fold는 계획 된 테스트 농도 (예를 들어, 30 µ M에서 테스트에 대 한 10 m m)에서 DMSO 재고 솔루션으로 352 시험 화합물을 준비 합니다. 참고: 목표는 복합 응용 프로그램 후 0.3% (v/v) DMSO 셀 접시에서의 최종 농도 달성 하기 위해 이것은 가장 높은 DMSO 농도 cardiomyocytes의 리듬 활동에 영향을 주지 않습니다. 재고 솔루션 하루 전에 준비 또한 수 있습니다. 재고 솔루션의 5 µ L의 최소가 각 중복 측정을 위해 필요 합니다.</li>
	<li>복합 플레이트를 준비 합니다.<ol>
<li>따뜻한 실내 온도에 1 %v / v 페니실린 스 솔루션으로 보완 유지 보수 매체의 40 mL.</li>
		<li>잘 당 재고 솔루션의 1.5 µ L을 추가 하 여 두 384-잘 복합 판으로 배포: i) 테스트 화합물 (각 2 개의 우물), ii) 긍정적인 컨트롤 (산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 및 E-4031, 복합 플레이트 당 각 4 우물), 및 iii) 부정 컨트롤 (DMSO, 복합 플레이트 당 20 우물).</li>
		<li>1 분에 100 x g 에서 복합 플레이트 원심</li>
		<li>각 잘 (그 단계에서 38.5 µ L에 3.9 %DMSO)를 실 온에서 유지 보수 매체의 37 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1 분에 100 x g 에서 복합 플레이트 원심</li>
		<li>플레이트 리더를 복합 플레이트를 로드 합니다. 참고: 다음 단계 복합 플레이트에서 증발을 최소화 하기 위해 가능 한 한 빨리 실행 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 염료를 준비 합니다.<ol>
<li>37 ° C와 1 %v / v 페니실린 스 솔루션과 보완 유지 보수 매체의 따뜻한 100 mL에 물 목욕을 켭니다.</li>
		<li>Ca-민감한 형광 염료와 항생제로 따뜻한 유지 보수 매체의 10 mL와 함께 끄는 다시 구성. 참고: Ca-민감한 형광 염료, 보통 Fluo-4, 그리고 끄는,이 주식 형광 매체 포함 하 고 어떤 남은 4 ° C에 적어도 5 일 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 수집
참고: 데이터 수집을 수행 하는 약물 효과의 측정의 날에. 같이 하십시오 3.1-.10 완전히 첫 번째 셀 접시에 대 한 다음 두 번째 셀 접시에 대 한 그들을 반복.
<ol><li>(필요한 경우) 플레이트 리더 소프트웨어를 시작 하 고 로드 피펫으로 팁.</li>
	<li>각 잘 기준선 박동 속도 정의 하려면 적어도 10 헤르츠의 수집 주파수 칼슘 파도 2 분 세그먼트를 기록 하는 소프트웨어 설정을 조정 합니다.</li>
	<li>한 셀 접시, 형광 매체를 만들기 위해 항생제와 따뜻한 유지 보수 매체의 12 mL로 재고 형광 매체의 3 mL를 희석.</li>
	<li>20 µ L을 셀 플레이트의 각 우물에서 매체의 형광 매체의 30 µ L 바꿉니다.</li>
	<li>혼합 1 x 위아래 플라스틱.</li>
	<li>플레이트 리더에 온도에 순응 하는 hiPSC CM 수 있도록 가능한 한 빨리 셀 접시를 놓습니다.</li>
	<li>데이터 수집을 시작 하기 전에 60 분을 기다립니다.</li>
	<li>기록 속도 각 잘 치고 기준선을 정의 하려면 적어도 10 Hz의 주파수 수집 캘리포니아 파도 2 분 세그먼트를 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터 수집을 시작 합니다. 참고: 각 기록 순서에 대 한 세포 격판덮개 전송 되지 않습니다 자동으로 장치에서 데이터 수집 후 있는지 확인. 이 실내 온도에 냉각에서 셀 접시를 방지할 수 있습니다. 플레이트 리더 소프트웨어의 일부 버전, 그것 각이 완전히 종료 되기 전에 기록을 중지 하려면 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>셀 접시에 복합 플레이트에서 잘-투-잘 5 µ L를 pipetting으로 플레이트 리더 로봇 테스트 및 참조 화합물을 추가 (추가, 후 DMSO 농도 0.3% [v]).</li>
	<li>캘리포니아 파도 복합 추가 후 5, 15, 30, 45, 및 60 분에 대 한 시작의 기록 2 분 세그먼트를 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터 수집을 시작 (있는지 확인 셀 플레이트 유지 때마다 장치에).</li>
</ol>4. 데이터 분석
참고: 데이터 분석 측정 후 언제 든 지 수행할 수 있습니다.
<ol><li>ASCII 텍스트 파일으로 플레이트 리더 소프트웨어에서 각 녹음 기간에 대 한 원시 데이터를 내보냅니다.</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어에 원시 데이터를 가져옵니다.</li>
	<li>각 잘 및 모든 시간 포인트, 기본 박동 주파수를 추출 합니다. 참고: 재료의 테이블에에서 나열 된 데이터 분석 소프트웨어와 함께 구타 주파수 산출 될 수 있다 최소 제곱법 스펙트럼 분석7의 롬-Scargle 방법에 따라 LombPeriodogram 함수를 사용 하 여 사용자 정의 분석 루틴 . periodogram 0.01 5 Hz 사이의 주파수 범위에 대 한 계산 해야 합니다. 기본 주파수는 PeakAutoFind 루틴을 사용 하 여 periodogram에서 추출할 수 있습니다. 이 분석 방법은 플레이트 리더 소프트웨어와 함께 옵션으로 제공 하는 방법 보다 주파수 구타의 더 정확한 측정을 제공 합니다. 그러나, 후자는 여전히 사용할 수 있습니다 소프트웨어 사용자 지정 옵션이 없는 경우.</li>
	<li>클립보드 복사 또는 ASCII 텍스트 파일로 데이터 분석 소프트웨어에서 각 녹음 기간에 대 한 기본 박동 주파수를 내보냅니다.</li>
	<li>클립보드 붙여넣기 또는 텍스트 파일 가져오기 스프레드시트 소프트웨어에 기본 박동 주파수를 가져옵니다. 참고: 어떤 현대 스프레드시트 소프트웨어에서 4.9 4.5-단계를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>각 잘 표준화 기준 각 시간 지점에서 구타 주파수 약물 응용 프로그램 후 (5, 15, 30, 45, 및 60 분) 그 당시 주 박동 주파수를 나누어 주 구타 주파수 기준에 의해 포인트.</li>
	<li>약물 응용 프로그램 후 각 시간 지점에서 평균 DMSO 효과 계산 (5, 15, 30, 45, 및 60 분) DMSO 적용 된 20 웰 스에 대 한 정규화 된 값을 평균 하 여.</li>
	<li>각 잘 때마다 포인트 후 약물 응용 프로그램에 대 한 (5, 15, 30, 45, 및 60 분), 평균 DMSO 효과 (시간 일치 하는) 동일한 접시를 뺍니다.</li>
	<li>중복 측정 평균. 참고: 화합물 주파수 변경 또는 소프트웨어 복합 추가 후 기본 주파수를 찾을 수 없습니다, 경우 박동 패턴의 시각적인 검사 화합물 생산 부정맥 여부를 평가할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li>
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 <a target="_blank" href="http://cipaproject.org">http://cipaproject.org</a> (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

두 가지 측면은 구타 주파수의 성공적인 기록에 대 한 가장 중요 합니다. 첫 번째 셀 도금와 문화 주의 운동 하는. 특히, 그것은 시도 하 고 매체를 교환할 때 우물의 바닥에 셀 계층을 긁힘 방지 하는 것이 중요. 펫와 우물의 바닥을 터치 하 셔도 됩니다 하지만 할 때마다, 그로 인하여 생산 셀 계층에 분석 결과 성능 영향을 미치지만 작은 스크래치 같은 각도 사용 해야 합니다. 재현 가능한 균질 리듬의 두 번째 중요 한 측면 측정 기간에 대 한 셀 접시에서 37 ° C에서 좋은 온도 제어를 제공 하는. 우리가 여기, 사용 플레이트 리더 이외의 장치를 사용 하 여이 동질성을 가져올 수 없습니다 하지만 온도 조절에 특별 한 수정이 가능할 수 있습니다: 플레이트의 단일 브랜드를 넘어 더 넓게 사용할 수 여기에 제시 된 프로토콜 만들 것 이라고 독자입니다. 여기에 사용 되는 장치를 가진 실험의 기간에 대 한 온도 안정성을 달성, 그것은 각 종료; 하기 전에 기록을 중지 하는 데 필요한 그렇지 않으면, 로봇 측정된 셀 접시를 꺼낼 것 이다. 이 기술 문제는 플레이트 리더 소프트웨어의 다음 릴리스 사라질 수 있습니다 하지만 지금 중요 한 남아 있다. 셀 플레이트 플레이트 리더 밖에 서 실수로 전송 하는 경우 그것은 해야 합니다 로드 안에 다시 가능한 한 빨리. 온도 변화에 매우 빠르게 박동 속도 영향을 때문에 그럼에도 불구 하 고, 실험의 품질 저하 됩니다.
몇 가지 다른 측면, 테스트 되지 않은 철저 하 게, 덜 중요 한 있을 수 있습니다. 예를 들어 hiPSC CM 제조 업체 셀을 뿌리기 전에 코팅 세포 배양 접시를 권장 하지만이 특정 분석 결과 코팅 사용 하지 않은, 셀 다양 한 표면에, 아주 쉽게 준수 때문에 그것은 매우 어려운 제대로 코트 384-잘 접시입니다. 그러나, 셀 플레이트 코팅 수 있습니다 여전히 허용, 또는 그것은 심지어 분석 결과 품질을 향상 시킬 수 있습니다. 우리 테스트도 하지 여부 이외에 DMSO 용 제 허용, 될 하지만 다른 기록 기술로 경험에서 EtOH 또는 MeOH의 유사한 농도 또한 쾌활 될 것 이라고 예상 된다. 우리가 일반적으로 hiPSC-CMs 동일한 제조 업체에서 사용 하 고는 비슷한 방식으로 작동 하도록 등장 셀 하나만 추가 공급 업체에서 테스트 되었습니다. 마찬가지로, 초기 배치를 비슷하게 행동 확인을 그들을 prechecking 선정 됐다 hiPSC CMs의 다른 배치의 적은 수만 사용 했습니다. 하나 또는 두 개의 일괄 처리 여기 그들의 syncytia 가난한 안정성 또는 문화 조건에서 재현성 때문에 부적 절 한 사용 하는 것으로 간주 했다. 그렇지 않으면,는 약리학 등장 매우 유사한 배치에서 "전형적인" 화합물 (산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 그리고 E-4031, 뿐만 아니라 endothelin, isoproterenol, 암 로디 핀, 및 ponesimod)의 제한 된 패널을 테스트 하는 경우. 우리만 건강 한 기증자 로부터 파생 된 hiPSC CM을 사용 합니다. 그것을 서로 다른 결과 제공 하는 hiPSC CM 심장 질환 환자에서 파생 된 것 건강 한 기증자와 환자 사이의 차이가 tyrosine kinase 억제제의 cardiotoxicity 평가할 때 관찰 되었다 비록 가치가 있을 수 있습니다. 12. 마지막으로, 우리는 일반적으로 약물 효과 측정 하기 전에 문화에서 22 ~ 28 일 대기: 동일한 셀의 임피던스 녹음 우리의 경험에 대 한 정상 느린 임피던스 (셀 레이어 안정성의 지표) 및 빠른 임피던스 (지표의 박동 주파수)는 후에 도달 12-문화에서 15 일. 그러나이 때 심장 채널 및 성숙 마커 식 프로필13안정화는 시간 때문에, 우리 대기 22-28 일 결정 했다. 그것은 하지 여부를 이전 또는 이후 셀 사용 비교 결과 얻을 수 것 이라고 시험 되었다.
프로토콜 설명 여기 인간의 심장 전기 생리학에 잠재적인 약물 효과 평가 하 hiPSC CM의 자발적인 박동 속도의 매우 간단한 측정을 사용 하 여. 그것의 주요 장점이 다른 방법론은 i) 그것은 높은 처리량 검열 환경에 순종, ii) 기록는 cardiomyocytes의 활동과 생리 적인 온도에서 약물의 효과 및 iii) 그것은 필요 하지 않습니다. electrophysiological 전문성 실행 또는 결과의 평가 대 한.
유효성 검사 연구에서 인간 사용을 위해 승인 하는 많은 약물과 수행, 우리는 분석 결과 기존 임상 데이터5예측 인간의 의학에서 사용 되는 약물에 반응 다는 것을 보였다. 이 방법은 심장 리듬에 미치는 모든 잠재적 영향을 고려, 때문에 종합적인 생체 외에서 Proarrhythmic 분석 결과 (CiPA) 이니셔티브14 특히 프로 arrhythmic 잠재력을 평가 하는 보완 합니다.
미래에,이 방법은 자발적인 박동 속도 영향을 표시 하는 약의 행동의 모드의 추가 이해 제공할 수 있습니다. 추가 기계 정보는 Ca 과도 (예를 들어, 그들의 진폭 또는 모양에서)의 형광 녹음에 높습니다. 형광 녹음을 수행 높은 수집 속도 (예를 들어, 30 Hz), 이러한 매개 변수 쉽게 박동 속도, 뿐만 아니라 추출 되 고 그것의 알려진된 효과 변경 이러한 매개 변수를 연관 흥미로운 일이 될 수 있습니다. 임상 약물 사용.

현재 프로토콜 syncytia 순수 관련 리듬에 hiPSC cm의 자발적인 구타 주파수에 약물 효과 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 인간 유도 만능 줄기 세포는 저절로 박동 syncytia 생체 외에서1,2,,34를 설정 하는 기능 cardiomyocytes로 차별화할 수 있습니다. 이러한 hiPSC CM 다 수 상업적인 공급자를 통해 또는 실험실에서 생산을 통해 얻어질 수 있다 그리고 그들은 인간의 심장 생리학 및 약리학의 모델을 생성 하는 세포의 유용한 소스. 특히, 그들은 예측 하거나 심장 효과 마약 인 간에5로 관리 될 때 발생할 수 있는 특성을 사용할 수 있습니다.
HiPSC CM syncytia의 구타 주파수는 microelectrode 배열 또는 임피던스1감지를 사용 하 여 생리 적 조건 하에서 측정 될 수 있다: 이러한 비 침 투 적인 기법 약물 효과에 매우 자세한 정보를 제공 하지만 그들은 오히려 낮은 처리량 그리고 그들은 현실적인 시간 및 예산 제약 내에서 큰 화합물 라이브러리를 테스트 사용 하지는 않습니다. 384 잘 형광 이미징 플레이트 리더를 사용 하 여 더 효과적인 시스템을 정교 수 Ca 민감한 염색6, 하지만 클래식 플레이트 독자 차선 온도 제어 및 수집 주파수 방해. 이러한 제한은 통상 박동 속도 (~ 15 bpm, 제어 환경135-55 bpm에 비해)에 의해 설명 되 고 가난한 Ca 신호 해상도 (8 Hz의 수집 주파수 기록 속도 120 bpm을 도달할 수 있는 한에는 조건 하에서 자극, 그리고 그것은 경사 또는 기간 등의 정보를 추출할 수 없습니다). 여기 설명 하는 방법을 이러한 문제를 배제에 충분 한 해상도 생리 적 리듬에 패턴을 가면서 녹음을 결합 합니다.
긍정적인 측면에서이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 높은 처리량, 저렴 한 비용의 큰 숫자의 빠른 테스트를 수 있는. 부정적인 측면에서이 방법을 사용 하려면 비싼 투자는 효과적인 온도 제어와 빠른 플레이트 리더 고 추가 더 자세한 테스트를 할 거 수 있습니다 관찰된 약물 효과에 약간 기계 정보를 제공 합니다. 방법입니다.
Approximatively 6 x6 hiPSC-10CM 1 384-잘 셀 접시에 한 측정을 위해 필요 합니다. hiPSC CM ~ 106 셀 1 mL에 x 4의 언된 aliquots로 일반적으로 상업적으로 제공 됩니다. 따라서, 3 냉동된 aliquots와 두 셀 접시를 준비 하기 편리 하다. 대부분의 경우,이 분석 결과의 낮은 다양성 때문에 그것은 테스트 화합물의 중복 측정을 수행 하 고, 각 셀 접시에서 quadruplicate 긍정적인 컨트롤 (산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 및 E-4031)의 측정 하기에 충분 하 고 20 plicate 부정적인 컨트롤 (혼자 DMSO)의 측량. 따라서, 최대 352 화합물/농도 쌍 두 384-잘 세포 격판덮개로 평가할 수 있습니다. 352 테스트 화합물, 두 셀 접시와 12 백만 셀 3 언된 aliquots;으로 같은 실험을 고려 하는 다음 프로토콜 추가 데이터가 필요한 경우 쉽게 수직 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>FDSS7000 형광등 플레이트 리더</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td>카탈로그 항목이</td><td></td>아닙니다</tr><tr><td>FDSS7000 Fluo-3 / Fluo-4 / Fluo-8 형광 필터 키트</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td></td> FDSS7000<td>초기에 설치 </td></tr><tr><td>온도 제어</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td> <td>A10118-09</td><td></td></tr><tr><td>FDSS7000 150-W 여기 광원 장치</td><td>Hamamatsu Photonics (프랑스, 매시)</td><td>C11653-11</td><td></td></tr><tr><td>384웰 플레이트용 FDSS7000 피펫 팁</td><td>Hamamatsu Photonics (프랑스, 매시)</td><td>A8687-62</td><td></td></tr><tr><td>심근세포용 파형 분석 소프트웨어</td><td>Hamamatsu Photonics (프랑스, 매시)</td><td>U8524-12</td><td>Igor Pro 소프트웨어의</td></tr> <tr><td>대안 옵션Igor Pro 데이터 분석 소프트웨어</td><td>Wavemetrics (미국 오리건주 포틀랜드)</td><td>최신 버전</td><td></td></tr><tr><td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td><td>Cellular Dynamics International (위스콘신주 매디슨)</td><td>R1106</td><td>포함 세포, 도금 및 유지 관리 매체</td></tr><tr><td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td><td>Ncardia Germany (독일 쾰른)</td><td>Ax-B-HC02-4M</td><td>세포, 도금 및 유지 관리 매체 포함 iCell-Cardiomyocytes</td></tr><tr><td>384웰 세포 배양 플레이트</td>의 대안 <td>Greiner-Bio-One(Frickenhausen, 독일)</td><td>781091</td><td></td></tr><tr><td>384웰 복합 플레이트</td><td>Greiner-Bio-One(Frickenhausen, 독일)</td><td>781280</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td><td>Molecular Devices (Sunnyvale, California)</td><td>R8142</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich (스위스, Buchs)</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>N6-cyclopentyl-adenosine</td><td>Sigma-Aldrich (스위스, Buchs)</td><td>C8031</td><td></td></tr><tr><td>E-4031</td><td>Enzo Life Sciences (스위스, Lausen)</td><td>BML-KC158</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Gibco/ThermoFisher (스위스, Reinach)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco/ThermoFisher (Reinach, 스위스)</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

인간-ipsc 파생 cardiomyocyte syncytia의 수축 온도 제어 384-잘 접시에 ca 민감한 형광 염료와 측정

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

자발적으로 계약 syncytia cardiomyocytes 인간 유도 만능에서 파생 된의 줄기 세포 (hiPSC CM)는 인간의 심장 생리학 및 약리학의 유용한 모델입니다. 이 자연 스러운 활동을 기록 하 고 약물 효과 평가 하기 위해 다양 한 방법을 제안 하지만 이러한 방법의 많은 제한 처리량 그리고/또한 생리 적인 관련성에서 고통. 우리는 Ca-민감한 형광 염료와 온도 제어 영상 다 잘 플레이트 리더를 사용 하 여 hiPSC-CM의 박동 주파수에 외 인 화합물의 효과 계량 높은 처리량 검열 시스템을 개발. 우리 셀 접시와 복합 접시를 준비 하는 방법 및 높은 감도 재현성을 달성 하기 위해 자동화 된 분석 결과 실행 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 변환 하 고 자연 스러운 리듬에 대 한 약물 효과의 신뢰할 수 있는 측정을 제공 하기 위해 형광 데이터를 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 가이드에서 또는으로, 화학 최적화 화합물 인간의 심장 기능에 영향을 미치는 약물 발견 프로그램에 사용할 수 있습니다.

그림 1 1 384-잘 접시에 걸쳐 기준선에서 Ca 파도의 대표적인 녹음을 보여준다. 대부분의 경우에서 모든 우물 공개 일반 박동 속도 약간 가변성 접시에 걸쳐 (± SD 의미 = 40.1 ± 3.5 bpm; range = 34-54 bpm). 아주 가끔 (미만 1/10 실험), 몇 가지 우물 (5 미만)는 부정맥 또는 리듬의 부재. 3 384-잘 접시, 우리는 또한 시도 다른 업체 로부터 cardiomyocytes ( 재료의 표참조) 자발적인 박동에 대 한 매우 비슷한 초기 계획 값을 얻었다.
심장 이온 채널 차단제 재현할 수 방식으로5cardiomyocytes의 리듬을 영향을 줍니다. 암 로디 핀, 느린 Ca 채널9, 차단기는 1 µ M (그림 2A)까지 농도 의존 방식으로 100% 이상 리듬을 가속 한다. 효과 첫 번째 5 분 이내 개발 잘 하지만 그것은 여전히 증가 approximatively 다음 30 분 이내 50% 안정화 되기 전에. 1 µ M, 위 암 로디 핀 체포 구타 (파선)으로 사실에서 예상 될 수 있다 Ca는 자발적 수축에 중요 한. 다른 선택적 dihydropyridine Ca 채널 차단제 매우 비슷한 효과 생성합니다.
E-4031, 급속 한 지연된 정류기 K 채널10의 차단 10 µ M (그림 2B) 최대 농도 의존 방식에서 리듬 약 65-70% 감속. 첫 번째 5 분 이내 효과 개발 하 고 60 분 이내 다양 하지 않습니다. 다른 선택적 IKr 차단제 속도 최대 감소 (예:35-40 %cisapride, E-4031, 70%, 90%-95 %dofetilide 대 한) 다를 수 있지만 비슷한 효과 생성 합니다. 이 차이 대 한 기준으로 알려져 있지 않습니다.
테트로도톡신, 빠른 나 채널11, 차단기는 리듬 약 15%를 감속 하는 1-30 µ M (그림 2C) 최대 농도 의존 방식. 효과 잘 첫 번째 5 분 이내 개발과 많은 다음 60 분 이내 다. 그러나, 30 µ M 이상의 테트로도톡신 체포 첫 5 분 안에 뛰는 반면 30 분 후 그것은 1 µ M 이상의 체포. Lidocaine 또는 mexiletine와 같은 다른 나 채널 차단제과 단성 있는 비슷한 효과 생성합니다.
Bepridil, 심장 Na, Ca, K 채널9, 혼합된 차단기는 또한과 단성 있는 효과 (그림 2D)를 생성합니다. 이것이 준비 나 채널의 블록은 bepridil의 기본 동작을 제안 합니다. Ca 채널 블록으로 인해 가속 나타나지 않습니다 나타나고 IKr 블록으로 인해 둔화 더 많은 진보 나 채널 효과 의해 마스크.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> 그림 1: 384-잘 접시에 걸쳐 대표적인 초기 캘리포니아 파도. (A) 접시에 걸쳐 모든 우물 작은 가변성 일반 박동 속도 보여 줍니다. 이 이미지는 플레이트 리더 소프트웨어에서 직접 캡처됩니다. 각 추적은 10 기간에 s. 형광 강도 임의의 (상대 빛 단위 비디오 카메라 스케일에서 파생)입니다. (B)이이 폭발 한 10의 s 추적 저 잡음 신호를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> 그림 2: 심장 이온의 대표적인 효과 채널 차단제. 이러한 패널 표시 농도 응답 곡선 (A)는 선택적 Ca 채널 차단제 암 로디 핀, (B) 선택적 IKr 차단기 E-4031, (C)와 선택적 나 채널 차단제 TTX, 및 (D) 비 선택적 채널 차단기 bepridil입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

자발적으로 계약 syncytia cardiomyocytes 인간 유도 만능에서 파생 된의 줄기 세포는 인간의 심장 생리학 및 약리학의 유용한 모델. 여기 우리는 구타 주파수, Ca-민감한 형광 염료와 온도 제어 영상 다 잘 플레이트 리더를 사용 하 여 외 인 화합물의 효과 계량 하는 높은 처리량 검열 시스템을 제시.

인간-iPSC 파생 Cardiomyocyte Syncytia의 수축 온도 제어 384-잘 접시에 Ca 민감한 형광 염료와 측정

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

이 방법은 심장 안전 약리학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 새로운 인간 의학은 정상적인 심장 리듬을 수정할 위험이 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 화합물을 신속하고 적당한 비용으로 평가할 수 있다는 것입니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 동료 인 카밀 포니 (Camille Forny)가 될 것입니다. 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포 또는 HIPSCCM의 싱크로도의 수축측정을 준비하기 위해, 냉동 세포를 함유한 냉동세포를 2분간 섭씨 37도에 배치하는 것으로 시작한다. 각 튜브에서 하나의 신선한 50 밀리리터 원뿔 튜브로 해동 된 전체 셀 서스펜션을 전송합니다.남은 세포를 회수하려면 각 튜브를 섭씨 37도의 예동도금 배지로 세척하고 해동 된 세포를 포함하는 50 밀리리터 원뿔 관에이 배지를 추가하십시오. 튜브에 따뜻한 도금 매체의 8 밀리리터를 추가하고 조심스럽게 서스펜션을 혼합합니다. trypan 블루 제외 방법과 혈종계를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.따뜻한 도금 매체를 추가하여 밀리리터당 농도를 50, 000 세포로 조정합니다. 2개의 새로운 384웰 세포 배양 판으로 세포를 분배하기 위하여는, 우물 당 대략 12, 500 세포를 산출할 각 우물에 25 마이크로리터를 추가합니다. 가습 대기 중 384웰 플레이트에서 37도의 섭씨37도에서 총 3~4주 동안 5%의 이산화탄소를 배양합니다.다음 날, 도금 매체를 따뜻한 유지 보수 매체의 50 마이크로 리터로 교체하십시오. 그 후 2~3일마다 유지 보수 매체의 절반을 교체하십시오. 7일, 14일, 21일에는 배지를 완전히 교체한다.세포가 3~4주 동안 배양에서 유지되면, 그들은 자발적으로 수축싱크성을 형성하고, 이러한 수축에 화합물의 효과를 측정할 수 있다. 분석 당일, 제1 세포판이 플레이트 판독기 내부에 측정을 위해 배치되기 최소 2시간 전에 판독기를 켜고 가열 시스템을 섭씨 37도로 설정한다. 화합물 플레이트를 준비하려면, 실온 40 밀리리터의 유지 보수 매체에 1%의 부피 페니실린 연쇄절제술을 보충합니다.매체가 워밍업하는 동안, 잘 당 스톡 용액의 1.5 마이크로 리터를 추가하여 두 개의 384 웰 화합물 플레이트에 테스트 화합물과 제어를 배포합니다. 1분 동안 100G의 화합물 플레이트를 원심분리합니다. 각 웰에 37 마이크로리터의 유지 보수 매체를 추가하고 1 분 동안 100G에서 다시 원심 분리합니다.형광염을 준비하기 위해, 37도 섭씨 수조에서 1%의 부피페니실린 연쇄절제술로 보충된 유지 보수 매체의 따뜻한 100 밀리리터. 그런 다음, 칼슘에 민감한 형광염염과 담수의 혼합에 온난한 매체의 10 밀리리터를 첨가하여 주식 형광 매체로 재구성합니다. 플레이트 리더 소프트웨어를 시작합니다.최소 10 헤르츠의 획득 빈도로 칼슘 파의 2 분 세그먼트를 기록하는 소프트웨어를 준비합니다. 각 세포 판에 대한 형광 배지를 만들기 위해 항생제를 사용하여 12 밀리리터의 따뜻한 유지 보수 매체로 3 밀리리터의 스톡 형광 배지를 희석시하십시오. 세포 판의 각 우물에 있는 20마이크로리터를 형광 매체 30마이크로리터로 교체하고 한 번 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.그 직후 HIPSCCM이 판독기 온도에 60분 동안 적응할 수 있도록 플레이트 판독기에 플레이트를 넣습니다. 그런 다음 플레이트 리더 소프트웨어를 시작합니다. 적어도 10 헤르츠의 획득 빈도로 칼슘 파의 2 분 세그먼트를 기록하여 각 우물에 대한 기준치 박동 속도를 정의합니다.데이터 수집 후 셀 플레이트가 장치 밖으로 전송되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 일부 소프트웨어 버전을 사용하면 완전히 종료되기 전에 레코딩을 중지해야 합니다. 플레이트 리더 로봇을 사용하여 테스트의 5마이크로리터를 피펫하고 화합물 플레이트에서 세포 판으로 잘 화합물을 참조합니다.그 후, 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터 수집을 시작하여 화합물 첨가 후 5분, 15분, 30, 45 및 60분부터 칼슘 파의 2분 세그먼트를 기록한다. 데이터 분석을 시작하려면 ASCII 텍스트 파일의 플레이트 판독기 소프트웨어에서 각 기록 기간동안 원시 데이터를 내보냅니다. 그런 다음 데이터 분석 소프트웨어로 가져옵니다.데이터 분석 소프트웨어에서 각 녹화 기간동안 기본 박동 주파수를 클립보드 복사본으로 내보냅니다. 각 우물과 매시간 지점에 대한 기본 박동 주파수를 추출합니다. 마지막으로 클립보드 붙여넣기를 통해 박동 주파수를 스프레드시트 소프트웨어로 가져오고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 계속합니다.384웰 플레이트 의 기준선에서 칼슘 파도를 기록하는 것은 대부분의 경우 모든 우물이 접시에 걸쳐 가변성이 거의없는 규칙적인 구타 율을 드러낸다는 것을 보여줍니다. 심장 이온 채널의 차단제가 추가될 때, 심근세포의 리듬에 영향을 미칩니다. 느린 칼슘 채널의 차단제인 Amlodipine은 최대 1개의 마이크로몰라까지 농도 의존방식으로 리듬을 100% 이상 가속화합니다.그리고 그 위에, 암로디핀은 구타를 체포. E-4031은, 급속지연정류 칼륨 채널의 차단제는 최대 10 마이크로몰러까지 농도 의존방식으로 리듬을 약 65~70%까지 감속시다. 테트로도톡신은 빠른 나트륨 채널의 차단제는 최대 1~30마이크로몰러의 농도 의존방식으로 리듬을 약 15% 감속하는 반면, 30 마이크로몰라, 테트로도톡신은 처음 5분 이내에 구타를 체포한다.베프리딜은 심장 나트륨, 칼슘 및 칼륨 채널의 혼합 차단제인 Bepridil은 나트륨 채널 블록이 bepridil의 주요 작용임을 시사하는 전부 또는 전혀 효과가 없습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 세포 배양 판에서 파이펫 을 할 때 매우 부드러운 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 조직은 매우 깨지기 쉽고 파이펫에 의해 만지면 쉽게 손상됩니다.인간 세포와 활성 약물과 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 안전 장갑과 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

contractions-human-ipsc-derived-cardiomyocyte-syncytia-measured-with

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia의 수축은 온도 제어 384웰 플레이트에서 Ca에 민감한 형광 염료로 측정되었습니다.

제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

인간 유도만능 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 이용한 허혈성 심장질환 모델을 제시하고, 허혈에 의한 조직 손상의 정량적 평가를 위한 방법을 제시한다. 이 모델은 약물 검진및 허혈성 심장 질환에 대한 추가 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.

허혈성 심장 질환 및 심장 근막 수축의 비디오 기반 비교 모델

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

이 방법은 형광 태그 sarcomere 단백질을 가진 다능한 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 sarcomere 단축을 검사하는 것을 이용할 수 있습니다.

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축 기능 및 세포 무결성의 변화 분석은 비임상 약물 개발에 매우 중요합니다. 하이브리드 96웰 세포 분석 시스템은 임상 단계로의 안전한 전환에 필요한 신뢰할 수 있는 인간 관련 결과를 위해 실시간 및 생리학적 방식으로 두 파라미터를 모두 처리합니다.

전임상 심장 위험 평가를 위해 인간 iPSC 유래 심근 세포의 구조적 및 수축성 변화를 평가하기위한 하이브리드 세포 분석 시스템

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

이 프로토콜은 전임상 개발 중 약물에 의한 수축성 변화를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼인 MyoBLAZER 시스템을 사용하여 기증자 심장에서 성인 인간 원발성 심근세포의 수축성을 측정하는 방법을 설명합니다.

고립된 성인 인간 원발성 심근세포의 심장 수축성 측정

여기에서는 비디오 기반 현미경과 결합된 유연한 기판에 도금된 2D 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 단층을 사용하여 비침습적 심장 의료 기기 수축성 평가 방법을 시연합니다. 이 도구는 심장 전기 생리학 장치의 수축 특성에 대한 시험관 내 평가에 유용합니다.

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

여기서, 광학 기반 플랫폼을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 수축성 및 칼슘 측정을 수행하는 확립된 방법이 설명되어 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 돌연변이의 효과와 다양한 자극에 대한 반응을 빠르고 재현 가능한 방식으로 연구할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 칼슘 및 수축성 매개변수의 실시간 측정

학습하세요 온도 제어 384-웰 플레이트에서 Ca 민감 형광 염료를 이용해 인간-iPSC 유래 심근세포 시시티아의 수축을 측정하는 고속 스크리닝 방법을. 이 기술은 심장 안전성 약리학에서 약물의 심장 리듬 영향을 신속하게 평가하는 데 활용됩니다.

인간-iPSC 파생 Cardiomyocyte Syncytia의 수축 온도 제어 384-잘 접시에 Ca 민감한 형광 염료와 측정

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