Name: Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: 학습하세요 항암 항체와 항종양 약물 간의 시너지 효과를 평가하는 방법을 Chou-Talalay 조합 지수 방정식을 사용하여 전임상 모델에서 약물 상호작용을 정량화하고 최적의 암 치료법을 개발하는 데 활용하세요.

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부여 지원: Fondation 드 Projet 드 L '대학교 드 낭트, 레 Bagouz' 일품 마 농, 라 리그 죄수 르 암 위원회 회의 드 루아르-아 틀 랑 티크, 위원회 회의 뒤 모 르 비 앙, 및 위원회 회의 드 Vendée, 한 장미 S.A.R.A.H, 별미 드 마틴과 라 사회 프랑세즈 데 루 테 순이 레 부 어 암 외 레 leucémies 드 랑팡은 동부 표준시 드 L'adolescent (SFCE). M.B. 및 J.F. 라 리그 죄수 르 암에 의해 지원 됩니다. 저자는 UTE-시설 구조 Fédérative 드 검색 프랑수아 Bonamy의 감사합니다. 저자는 또한 그녀의 기술 지원 제공 하는 IMR5 세포에 대 한 박사 S. Suzin (Inserm, 파리)와 양 H. Estéphan 감사 합니다.

동물 주택 및 실험 절차 (계약 #C44-278와 #APAFIS 03479.01) 프랑스 정부에 의해 승인 되었다. 동물 보호 및 절차 #2013-118 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 지시문 EU 2010/63/EU 및 프랑스 법에서 실시 했다.
1. mAb 8B6 약물 상호 작용 사이 Topotecan 체 외에서 평가
<ol><li>96-잘 샘플 준비 주의: 기관의 건강과 안전 위원회를 참조 하 고 실험실 안전에 관련 된 지역 규제 규칙을 따릅니다. 모든 미디어, 셀 라인, 또는 시 약을 사용 하기 전에 재료 안전 데이터 시트 정보를 검토 합니다. 적절 한 무 균 기술을 사용 하 고 층 류 두건에서 작동. 셀을 조작 하는 데 사용 되는 모든 솔루션/장비 살 균 해야 합니다. 참고: 다음 프로토콜 부착 세포와 함께 사용 하기 위해 설계 되었습니다. 수정 nonadherent 셀에; 성장에 메서드를 적용 하는 데 필요한 이 프로토콜은 각 실험 조건에 대 한 quadruplicate를 사용합니다.<ol>
<li>T75 플라스 크에 IMR5 세포 성장.</li>
		<li>첫 날 (0 일), 셀 confluency 확인을 현미경으로 세포 배양을 관찰 합니다. 플라스 크에서 셀 중간 발음, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5 mL와 함께 그것을 씻어 하 고 0.05 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 3 개 mL를 추가 / PBS 솔루션. (37 ° C, 5% CO2) 3 분 인큐베이터에 플라스 크를 반환 합니다.</li>
		<li>셀 분리에 대 한 현미경으로 세포 배양을 검사 합니다. 참고: 필요한 경우 종양 세포 유형에 따라 추가 3 ~ 5 분 동안 인큐베이터에 플라스 크를 반환 합니다.</li>
		<li>완전 한 세포 매체의 10 mL 플라스 크에 추가 하 고 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 300 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>제거 하 고 삭제는 상쾌한. 완전 한 성장 매체에 셀 펠 릿을 resuspend. 1 x 105 셀/mL의 최종 농도를 중간 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>세포 현 탁 액의 100 µ L은 각, 104 셀 96 잘 문화 접시의 씨 84 우물 그림 2에 표시 된 실험 레이아웃을 따릅니다.</li>
		<li>(37 ° C, 5% CO2) 세포 배양 기에 18 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol></li>
	<li>마약 솔루션 준비 참고: 마약/mAb 민감성 연구, 타이밍, 길이 및 집중 치료는 특정 약물/mAb 질문에 맞게 수정 합니다. 참고 초기 농도 3 배 최종 농도 이다.<ol>
<li>다음날 아침 (주 1), 완전 한 성장 매체를 사용 하 여 다음 마약 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>
mAb 솔루션 준비
			<ol>
<li>MAb 240 µ g/mL의 mAb 농도와 항 체 작업 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에 희석.</li>
				<li>그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Topotecan 솔루션 준비
			<ol>
<li>희석로 위, 120의 최종 농도와 약물 작업 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에 약 nM.</li>
				<li>그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
항 체 및 약물 솔루션 준비
			<ol>
<li>120 nM 약물 및 240 µ g/mL mAb (작업 솔루션)에 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에서 약물 및 mAb 솔루션을 희석.</li>
				<li>그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>실험적인 레이아웃 ( 그림 2)에 표시 된 대로 최종 농도에 도착, 해당 우물에 각 약물 솔루션의 50 µ L를 전송. 참고: 그림 2에 표시 된 대로 치료 셀 우물에 완전 한 성장 매체의 50 µ L를 전송.</li>
		<li>(37 ° C, 5% CO2) 인큐베이터에서 72 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT 분석 결과
	<ol>
<li>각 우물에 MTT 시 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C 4 h에서 품 어.</li>
		<li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 음에 lysis 용액 (0.01 M HCl에 10 %SDS) 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 철저 하 게 혼합.</li>
		<li>37 ° C 습도 챔버 (95% 습도)에 4 h에서 품 어.</li>
		<li>570에서 흡 광도 읽고 (570) 및 620 nm (620)는 분 광 광도 계를 사용 하 여. 참고: 각 샘플 흡 광도; 읽기 전에 pipetting으로 다시 믹스 흡 광도에서 620 nm 일반적인 배경 값의 수정 수 있습니다.</li>
		<li>수정 된 흡 광도 계산: 수정 흡 광도는570-620=.</li>
		<li>세포 생존 능력을 다음과 같이 계산: 세포 생존 능력 = 100 x (평균 수정된 흡 광도 샘플 / 뜻 수정된 흡 광도).</li>
		<li>계산 하는 다음 수식을 사용 하 여 분수의 영향을 받는 값 (Fa): 1-(평균 수정된 흡 광도 샘플 / 뜻 수정된 흡 광도).</li>
	</ol></li>
	<li>단일 약물 상호 작용 분석 시뮬레이션 소프트웨어 및 약물 조합 연구
	<ol>
<li>시작 창을 열려면 시뮬레이션 소프트웨어를 실행 합니다.</li>
		<li>새로운 실험 버튼을 메인 창을 클릭 합니다.</li>
		<li>이름 창에서 실험의 이름을 입력 합니다. 참고: 날짜 날짜 창에 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>새로운 단일 약물 버튼 클릭 합니다.</li>
		<li>전체 이름 창에 이름을 입력 합니다.</li>
		<li>Abbrev 창에 약어를 입력 합니다.</li>
		<li>단위 창에서 약물 농도 단위를 입력 합니다.</li>
		<li>입력 데이터 포인트 1 복용량 및 Fa 값, Enter키를 누릅니다.</li>
		<li>모든 데이터 요소는 입력 될 때까지이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>마침 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>MAb 데이터 포인트를 입력 하는 동일한 단계를 따릅니다. 참고: 약물 사용은 동일한 농도 단위를 사용 합니다.</li>
		<li>새로운 약물 콤보 버튼 클릭 합니다.</li>
		<li>약물 및 mAb를 선택 합니다.</li>
		<li>일정 비율 을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>전체 이름 창에 이름을 입력 합니다.</li>
		<li>Abbrev 창에 약어를 입력 합니다.</li>
		<li>마약/mAb 비율의 비율 창에서 입력 합니다.</li>
		<li>데이터 포인트 1 복용량 을 입력 하 고 Enter키를 누릅니다. 참고: 프로그램 자동으로 mAb 및 콤보의 복용량 계산 됩니다.</li>
		<li>데이터 포인트 1 Fa 값을 입력 하 고 Enter키를 누릅니다.</li>
		<li>모든 데이터 요소는 입력 될 때까지이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>마침 버튼을 클릭 하 고, 보고서 생성 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>약물 및 mAb를 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>콤보 를 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>헤더, CI 테이블및 요약 테이블을 선택 합니다. 그런 다음 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>분석 파일의 파일 이름을 입력 하 고 보고서를 생성 하기 위해 저장 을 클릭 합니다. 참고: 확인을 클릭 하면 보고서 자동으로 열립니다 컴퓨터의 기본 웹 브라우저에서.</li>
		<li>보고서를 인쇄 하려면 웹 브라우저의 파일 메뉴에서 인쇄 을 선택 합니다. 보고서 포함 어느 에이전트에 드50, ED 에서 각 조합에 대해 monotherapy 또는 조합, 및 CI 테이블 사용에 대 한 제목, 날짜, 파일 이름, 설명 참고, 매개 변수 (m, Dm, 및 r)에 드50 를 포함 하는 요약 테이블 섹션 75에 드90및95에 드. 참고: CI 값 < 1 나타냅니다 성분, CI 값 = 가산, 그리고 CI 값 1 나타냅니다 > 1 적개심을 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 인간의 신경 Xenografts Nonobese 당뇨병 끄 덕 Scid 감마 생쥐 (NSG 쥐)의 생성
참고: 세포 배양의 어떤 오염 든 지를 제외 합니다. 5 ° C의 위 젤을 형성 하는 지하실 멤브레인 매트릭스, 이후 모든 cultureware 또는 미디어 지하실 멤브레인 매트릭스 시 약의 만남 prechilled/얼음-감기 해야 합니다. 전체 과정에서 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지.
<ol><li>
IMR5 세포 현 탁 액의 준비
	<ol>
<li>사용 하기 전에 4 ℃ 냉장고에서 얼음에 유리병을 물속으로 밤새 지하실 멤브레인 매트릭스 시 약을 녹여.</li>
		<li>0 일에 교양된 IMR5 셀으로 위의 수확.</li>
		<li>15 mL 원뿔 튜브를 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기는 세포를 전송 합니다.</li>
		<li>폐기는 상쾌한. 2 세포를 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 15 mL x 5 x 107 셀/mL에 얼음 처럼 차가운 PBS의 세포 현 탁 액을 준비 하 고. 참고: 필요한 경우 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.</li>
		<li>지하실 막 매트릭스 유리병을 소용돌이 친다. 참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 시 해 동 고 분산 될 해야 합니다.</li>
		<li>지하실 막 매트릭스 시 약의 한 볼륨을 추가 하 고 2.5 107 셀 /mL x의 세포 현 탁 액을 pipetting으로 혼합.</li>
		<li>얼음에 세포 현 탁 액을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
쥐의 준비 참고: 쥐 6 ~ 7 주 이전 이어야 한다.<ol>
<li>특정 병원 체 자유로운 상태에서 생쥐를 유지 합니다.</li>
		<li>쥐 도착 후 3-5 일 순응 기간을 허용 합니다.</li>
		<li>접종 당일 면도 측면 주사 될 것 이다 일 (단계 2.3.6 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
종양 세포 주입의 준비 참고: 차가운 지하실 멤브레인 매트릭스 셀 서 스 펜 션 절차 동안 무 균 유지.<ol>
<li>세포를 혼합 하 고 신중 하 게 1 mL 주사기 21g 바늘으로 장착으로 세포 현 탁 액을 그립니다.</li>
		<li>주사기에 없는 기포는 확실 하 게 확인 하십시오.</li>
		<li>소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.</li>
		<li>부드럽게 주사 사이트에서 손가락 측면에 마우스의 피부를 짠 다.</li>
		<li>피부 겹에 정확히 바늘을 삽입 합니다. 바늘을 배치 하지 마십시오 피하 주입 되도록 조직에 깊이.</li>
		<li>쥐의 더 낮은 오른쪽 측면에 IMR5 세포 현 탁 액 (즉, 2.5 x 106 셀)의 100 µ L를 피하 주사.</li>
		<li>누설을 방지 하 고 바늘을 철회를 주사기를 회전 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
몸 무게 변화 및 종양 성장 모니터링
	<ol>
<li>길이 (A)와 (B)는 캘리퍼스와 종양의 너비를 측정 합니다.</li>
		<li>0.5 x (A x B2) 수식을 사용 하 여 종양 볼륨을 계산 합니다.</li>
		<li>종양에는 50-60 m m3의 평균 볼륨에 도달 했습니다 때 치료를 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 약물 및 생쥐에서 항 체 관리
<ol><li>
MAb 8B6의 정 맥 행정
	<ol>
<li>신중 하 게 작성 1 mL 주사기 25 G 바늘 mAb 솔루션 탑재.</li>
		<li>10 분 같은데요 꼬리 정 맥 열 램프 아래에서 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>설치류 restrainer에 마우스를 제 지.</li>
		<li>소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.</li>
		<li>병렬 꼬리 정 맥, 관통 2-4 m m (그림 3A) 위쪽으로 바늘의 경사를 유지 하면서 루멘에 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>항 체 해결책의 100 µ L를 정 맥 주사 (i.v.).</li>
		<li>주입이 끝나면 출혈을 방지 하기 위해 사출 사이트 압력 부드럽게.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Topotecan의 복 관리
	<ol>
<li>25g 바늘으로 장착 1 mL 주사기에 약물 솔루션을 그립니다.</li>
		<li>그것의 후부 끝이 약간 상승 부정사 위치에 마우스를 잡아.</li>
		<li>소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.</li>
		<li>마우스의 복 부 정중 선 찾아서 정신적으로 사분면으로 복 부를 분할 합니다. 오른쪽 또는 왼쪽 하단 사분면 (그림 3B)에서 주사 사이트를 찾습니다.</li>
		<li>오른쪽 또는 왼쪽 하단 사분면에 ~ 10 ° 각도로 (5 m m 깊은) 복 부에 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>Intraperitoneally 마약 솔루션의 100 µ L를 주사 (i.p.).</li>
		<li>접종 사이트 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+basis%2C+experimental+design%2C+and+computerized+simulation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies.</a> Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).</li>
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S.Fa., J.F., 그리고 S.B. 중인 안티-O-아 세 틸-g d 2 치료 항 체의 임상 적용을 포함 하는 특허의 발명가로 지정 됩니다.

약물 상호 작용의 효과 예측, 세 가지 방법을 사용할 수 있습니다: isobologram 방법론17, 비선형 혼합 모형18그리고 조합 색인1. 결합 인덱스 분석은 그것의 응용 사용자 컴퓨터 프로그램의 가용성에 의해 간단 하 게 하기 때문에 가장 일반적으로 사용 됩니다. 이 위해 우리는 먼저 MTT 분석 결과19를 수행 하 여 단독으로 또는 조합으로 사용 하는 각 에이전트의 복용량 효과 응답 특징. 이 방법론을 570 nm19의 흡수도 최대 색깔 자주색 formazan 제품에서 tetrazolium 소금 줄이기 위해 가능한 세포의 능력에 의존 합니다. 죽음에 셀 formazan로 MTT를 변환 하는 능력을 잃게됩니다. 따라서, 색된 formazan 제품의 수량 문화19에 실행 ...

많은 암 종류의 치료에 접근 하는 기존의 방식은 monotherapy에 근거 했다. 경우에 그것은 여전히 많은 경우에 사용 하 고,이 방법이 결합된 요법2선택에 지도 하는 몇 가지 장애물을 만났다. 특히, 암 세포 개발 대안 생존 메커니즘3, 치료 실패 환자4결과 유도 하 여 단일 약물으로 치료 하면 저항을 더 따르게 됩니다. 또한, monotherapy에 약은 높은 복용량에서 관리 일반적으로. 이 상황을 자주 참을 수 의사 치료2중지를 강제로 수 있는 강한 복용량 의존 부작용의 발생에 발생 합니다. 이러한 이유로 항 암 분자의 협회는 지금 monotherapy 선호.
이상적인 약물 조합 정상 세포에 대 한 증가 독성 없이 종양 세포에 대 한 시너지에 행동 하는 그 것입니다. 성분 치료 효과 별도로 행동 하는 각 개별 약물의 합계 보다 큰 두 개 이상의 약물의 상호 작용을 말합니다. 이러한 상호 작용은 향상 된 임상 치료 효능2발생할 수 있습니다. 그것은 치료 저항을 제한, 효능, 증가 하 고 또한 독성2를 줄일 수 있습니다. 사실, 다른 경로 대상으로 그들의 부작용을 낮은 각 약물의 복용량을 줄일 수 있습니다. 또한, 분자의 하나 또한 암 세포에 대하여 sensitizing 요원으로 사용할 수 있습니다. 적은 복용량 사용된5수 그리고 두 번째 약물의 효과 민감하게 셀에 향상 될 수 있습니다.
결합된 치료는 화학요법 약물 및 생물 의약품, 단일 클론 항 체6등 두 개 이상 포함할 수 있습니다. 이러한 mAbs 특별히 대상으로 관심과 항 체 의존 세포 매개 세포 독성 (ADCC)를 포함 하 여 면역 경로 통해 종양 세포를 죽 일 수의 세포 표면 항 원 표출 세포 면역 효과 기 세포의 참여와 7, 그리고 보완 의존 세포 독성 (CDC)6. 그들은 또한 메커니즘을 통해 비 면역학 apoptosis8,9,,1011중재 역할 수 있습니다. 이 경우에, 프로그램 된 세포 죽음의 과정의 유도 고 수 있습니다 암 세포를 민감하게, 그들의 기능을 약하게 관련된 화학요법 약물 더 효과적인 낮은 복용량에. 이와 같이, proapoptotic mAb antineoplastic 약물 조합 식이요법을 디자인을 위한 좋은 후보자 이다.
다른 수학적 모델 마약 성분; 평가 설명 되었습니다. 그들 중 하나는 결합 인덱스 방법1을 기반으로 합니다. 이 방법은 추1에 의해 개발 된 중간값 효과 원리를 기반으로 합니다. 중간값 효과 방정식 상관 약 복용량 및 약물 효과 다음과 같이 한다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq1.jpg">
여기서, D 는 약 복용량; Dm 은 중간값 효과 복용량; Fa 는 분수; 복용량에 의해 영향을 m 복용량 효과 플롯1의 모양을 의미 하는 지 수입니다. 중간값 효과 복용량은 dx 를 억제 또는 셀의 "x" % 죽이고 약물의 복용량을 계산 하는 데 사용 됩니다. CI 값1을 다음과 같이 약물 조합의 첨가제 효과 평가 하기 위해 다음 계산 됩니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq2.jpg" style="font-size: 14px;">
CI 값 1 나타냅니다 첨가제 효과 CI 값 &lt; 1 &gt;의 CI 값 하면서 시너지 효과 나타냅니다 1 적개심1나타냅니다. 이 방법의 응용 프로그램은 컴퓨터 프로그램, CompuSyn, 성분 및 모든 복용량에서 적개심 결정 하는의 가용성에 의해 촉진 추가 또는 효과 레벨 시뮬레이션 자동으로12.
우리의 그룹 오 틸 g d 2 ganglioside (OAcGD2) 신경 항 원13 mAb 8B6 특정 개발과이 mAb는 apoptosis11의 특성을 가진 세포 죽음을 유도 수 입증 했다. MAb 8B6 antineoplastic 요원 topotecan 신경 세포를 민감하게 할 수 있는지 여부를 테스트 하려면 우리는 위에서 언급 한 방법 추1에 의해 개발 된 적응. 첫째, 우리는 mAb 8B6 및 topotecan의 효과적인 복용량 50 (에 드50) 값을 결정합니다. 다음,에 드50 값에 따라 두 화합물의 equipotent 비율 신경 세포 위에서 언급 한 시뮬레이션 소프트웨어를 사용 하 여 CI 값을 결정 하기 위해 노출 됩니다. 이 방법은 mAb 8B6 및 topotecan 시험관사이 성분 설명 수 있습니다. 다음, 우리는 더이 조합은 처방에서 vivo에서의 안전과 효능을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 전 임상 연구에서 강력 하 고 안전한 항 암 mAb 및 화학요법 에이전트 조합 선택에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 연구의 도식 대표는 그림 1에 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>세포 증식 키트 (MTT)</td><td>Roche</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>CompuSyn 소프트웨어</td><td>ComboSyn</td><td></td>은 http://www.combosyn.com <td></td></tr><tr><td>Electric shaver</td><td>Bioseb</td><td>BIO-1556</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVFF00-01</td><td>10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640</td></tr><tr><td>Firefox에서</td> 무료로 다운로드할 수 있습니다.<td>Mozilla Corporation</td><td></td><td>Firefox는 http://www.mozilla.org/en-US/firefox/</td></tr> <tr><td>Heat lamp</td> Verre&에서 무료로 다운로드할 수 있습니다<td>. Quartz</td><td>4003/1R</td><td></td></tr><tr><td>인간 신경모세포종 IMR-5 세포주</td><td>Accegen Biotechnology</td><td>ABC-TC0450</td><td>IMR-5는 인간 신경모세포종 세포주 IMR32 5459762의 클론입니다. IMR-5 세포는 Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>2 mM에 의해 RPMI 1640</td></tr><tr><td>용해 용액</td>에 아낌없이 제공되었습니다.<td>로슈&nbsp;</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>mAb 8B6</td><td>낭트 대학교</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC</td><td>Thermofischer Scientific&nbsp;</td><td>N08625</td><td></td></tr><tr><td>바늘 21G 1 &frac12; &nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Needle 25G 1</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>NSG 마우스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-well microplates</td><td>Thermofisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 0,05% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>PC 실행 윈도우 7</td><td>마이크로소프트</td><td></td><td>윈도우 7 http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 units/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신에서 구입할 수 있습니다. RPMI 1640</td></tr><tr><td>시약 저장기</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>8094</td><td></td></tr><tr><td>설치류 억제</td>기 <td>Bioseb</td><td>TV-150-SM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Topotecan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2705</td><td></td></tr></tbody></table>

potentiation antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

적대적 단일 클론 항 체 (mAb) 화학요법 에이전트에 의해 potentiation 암에 대 한 효과적이 고 안전한 치료 설계를 위한 중요 한 전략을 구성 합니다. 여기 우리는 전 임상 단계에서 합리적인 조합을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다. 첫째, 우리는 Chou와 Talalay1의 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 제 mAb 및 세포 독성 약물 사이 성분 평가 셀 기반 분석 결과 설명 합니다. 측정의 종양 세포 약물 및 항 체-감도 MTT 분석 결과, 다음 조합 색인 (CI) 값을 계산 하는 자동화 된 컴퓨터 분석을 사용 하 여 포함 됩니다. CI 값 < 1 성분 테스트 mAbs와 세포 독성 대리인1사이 나타냅니다. 생체 외에서 연구 결과 vivo에서승산이 더이 종이 식 종양 모델에서 조합 처방 효능을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델에서 결합 된 처방 크게 종양의 성장, 단일 에이전트 컨트롤에 비해 상당한 확장된 생존에 어떤 결과 지연 합니다. 중요 한 것은, vivo에서 실험 보여 조합 식이요법 잘 용납입니다. 이 프로토콜에는 항 암 약물 조합 전 임상 모델에서의 효과적인 평가 임상 시험에서 평가 하는 합리적인 조합 식별 수 있습니다.

대표 결과 및 수치는 이전 게시 작업14허가 적응.
안티 OAcGD2 mAb 8B6 Synergistically 신경 세포 선 성장에 Topotecan의 억제 효과 향상:
하는 약물 및 항 체 농도 성분 topotecan 및 mAb 8B6, 약물 및 항 체 감도 MTT 분석 결과 사용 하 여 신경 세포가 먼저 측정 했다 인간 IMR5의 사이 평가 하는 데 사용할 설정 합니다. MAb 8B6 또는 topotecan 72 h에 대 한 혼자 IMR5 세포 생존 능력 (그림 4A)의 농도 의존 억제 귀착되는. 복용량 응답 곡선50...

이 프로토콜 Chou와 Talalay 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 항 체와 전 임상 모델에서 antineoplastic 마약 성분 평가 하는 방법을 설명 합니다.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

화학요법과 결합된 면역 요법은 암에 있는 능률적인 치료를 개발하는 혁신적인 접근을 나타냅니다. 주요 목표는 시너지 효과를 달성하는 것입니다, 치료 효과, 복용량 및 독성 감소, 최소화 하거나 약물 저항의 유도를 지연. 그러나, 실용적이고 윤리적인 이유로, 환자에서 시너지 효과를 결정하는 것은 불가능합니다. 따라서, 임상 시험에서 직접 조합하기 전에, Prenicaptor 조합 연구, 시험관 내 및/또는 동물에서, 임상 연구에 대한 근거를 얻기 위하여 실행되어야 한다. 약물 간의 시너지 효과를 정량화하기 위한 간단한 견고한 방법은 이 비디오에서 설명한 바와 같이 슈안 탈랄레가 개발한 조합 지수 방정식을 기반으로 합니다. 이 방법을 사용하여, 그리고 그것의 전산화 된 시뮬레이션, 우리는 여기에서 증거, 모노 클로노날 항체 8B6 사이의 시너지 효과, 이는 O-아세틸-GD2 강교 측 신경 모세포종 항원과 신경 모세포종 세포에 화학 요법 약물 Topotecan에 대한 특정. 간략하게, 인간 IMO에서 각 화합물의 유효 용량 50 값을 결정한 후, 5 신경모세포종 세포주, 이들 세포는 두 화합물의 공평한 비율로 삽관되었고, 조합 지수 값은 자동화된 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 계산하였다. 우리는 다음으로 생체, IMO, 5 종양 xenographed 모형에서 이 결과를 확인했습니다. 우리는 T75 플라스크에서 IMR-5 세포를 성장, 현미경으로 그들을 관찰, 세포 합류를 확인. 플라스크에서 세포 배지를 아스피레이트하고 PBS 5mL로 세척합니다. 0.05%EDTA/PBS 솔루션3mL를 추가합니다. 플라스크를 인큐베이터에 3분간 반납합니다. 세포 분리를 위한 현미경의 밑에 세포 배양을 검사합니다. 플라스크에 완전한 셀 배지 10mL를 추가하고 세포 현탁액을 멸균, 15mL 원추형 튜브로 옮킨다. 혈청계를 사용하여 300 g.Count 세포에서 5분 동안 원심분리기. 상체를 제거하고 폐기합니다. 완전한 성장 배지에서 세포를 다시 일시 중단합니다.중간 부피를 조정하여 100, 000 세포/mL.Seed 84 우물, 96 개의 잘 배양 플레이트10, 000 세포, 즉 세포 현탁액의 100 마이크로리터입니다. 세포 인큐베이터에서 18시간 동안 세포를 배양합니다.완전한 성장 매체의 500 마이크로리터에 단일 클론 항체를 희석하여 mL당 240 마이크로 그램의 단일 클론 항체 농도를 가진 항체 작동 용액을 얻습니다.프로토콜에 표시된 바와 같이 5 개의 2 배 연속 망상을 수행합니다. 최종 농도 120 나노 몰러약물 작업 용액을 얻기 위해 완전한 성장 매체의 500 마이크로 리터에서 약물을 희석. 프로토콜에 표시된 대로 5배, 2배 의 직렬 망상을 수행합니다. 약물플러스 단클론 애니바디 솔루션과 동일한 방식으로 희석합니다. 최종 농도에 도달하려면 이 실험 레이아웃에 표시된 대로 각 약물 솔루션의 50 마이크로리터를 해당 우물에 전달합니다. 인큐베이터에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 각 웰에 10마이크로리터의 MTT 시약 솔루션을 추가합니다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하세요. 멀티채널 파이펫을 사용하여 100마이크로리터의 리신 용액을 각 웰에 넣고 파이펫팅으로 철저히 섞습니다. 가습실에서 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 분광광계를 사용하여 570 및 620 나노미터에서 흡수를 제거하십시오. 셀 생존 가능성을 다음과 같이 계산합니다. 다음 방정식을 사용하여 영향을 받는 값의 분수를 계산합니다. 시뮬레이션 소프트웨어를 실행하고 새 실험 버튼을 클릭하여 주 창을 가져옵니다. 실험 이름을 입력합니다. 새 단일 약물을 클릭합니다. 이름을 입력합니다. 약어를 입력합니다. 약물 농도 단위를 입력합니다. 데이터 1 용량 및 FA 값을 입력합니다. Enter.Repeat 이 단계를 모든 데이터 요소가 입력할 때까지 반복합니다. 완료를 클릭합니다.동일한 단계를 따라 단일 클론 항체 데이터 포인트를 입력합니다. 신약 콤보를 클릭합니다.약물 및 단일 클론 항체를 선택합니다. 상수 비율을 선택합니다.확인을 클릭합니다. 이름을 입력합니다. 약어를 입력합니다. 약물 단일 클론 항체 비율을 입력합니다. 데이터 1 용량을 입력합니다. Enter.이 프로그램은 자동으로 단일 클론 항체 8B6 및 콤보의 복용량을 계산합니다. 데이터 1 FA 값을 입력합니다.Enter.Repeat 이 단계를 모든 데이터 요소가 입력할 때까지 반복합니다. 완료.다음을 클릭, 보고서 생성을 클릭합니다.약물 및 단일 클론 항체를 선택 한 다음 확인을 클릭합니다. 콤보를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 헤더, CI 테이블 및 요약 테이블을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 파일 이름과 분석을 입력하고 저장을 클릭하여 보고서를 생성합니다. 보고서는 기본 웹 브라우저에서 자동으로 열립니다. 이 보고서에는 제목, 날짜, 최종 이름, 설명 주, m, Dm 및 r 파라미터, 단독 요법 또는 조합으로 사용되는 제제에 대한 유효 용량 50, 유효 용량 50, 유효 용량 50, 75, 90 및 95.A 조합 인덱스 값이 1 미만인 시너지 효과를 나타내는 요약 표 섹션이 포함되어 있습니다. 값은 첨가도를 나타냅니다. 값이 1보다 큰 값은 적대감을 나타냅니다. 사용 전에 4도 C 냉장고에 얼음에 유리병을 침수하여 하룻밤 지하 멤브레인 매트릭스를 해동하십시오. 지하 막 메트릭과 접촉하는 모든 문화 복 또는 미디어는 미리 냉각되어야 합니다. 문화 IMR5를 수확하십시오. 세포를 15mL 원문 관및 원심분리기로 5분 동안 300g으로 옮긴다. 상부체를 폐기합니다. 15mL 얼음 차가운 PBS로 셀을 두 번 세척하십시오. 얼음-차가운 PBS에서 mL당 5백만 개의 세포에 대한 세포 현탁액을 준비합니다. 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로튜브로 전송합니다. 회전 지하 막 매트릭스 유리병. mL.100만 세포의 세포 현탁액을 얻기 위해 파이펫팅에 혼합된 지하 막 매트릭스 시약 1부(셀 서스펜션)를 얼음 위에 보관한다. 주사가 수행 될 곳의 측면을 면도. 세포를 혼합하고 셀 서스펜션을 21g 바늘로 장착된 1mL 주사기에 조심스럽게 그립니다. 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오. 방부제 용액으로 마우스의 접종 부위를 소독합니다. 주입 부위의 손가락 사이에 마우스 피부를 부드럽게 짜냅니다. 바늘을 스킨폴드에 정확히 삽입합니다. 피하 주사를 보장하기 위해 조직에 바늘을 깊숙이 두지 마십시오. IMR5 세포 현탁액의 100 마이크로리터를 피하로 주입하십시오. 주사기를 회전하여 액체 확산을 방지하고 바늘을 철회하십시오. 체중과 종양 성장을 위해 마우스를 모니터링하십시오. 구경으로 종양의 길이와 폭을 측정합니다. 이 수식을 사용하여 종양 부피를 계산합니다. 종양이 50~ 60mm의 평균 부피에 도달하면 치료를 시작하세요.

potentiation-anticancer-antibody-efficacy-antineoplastic-drugs

Research

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모형 유기체에 있는 큰 유전 스크린은 부정적인 유전 상호 작용의 확인으로 이끌어 냈습니다. 여기에서는 모델 유기체의 유전 화면에서 데이터를 사용하여 암에 있는 합성 치명적인 상호 작용을 표적으로 하는 약물 조합을 설명하는 데이터 통합 워크플로우를 설명합니다.

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

매우 정확한 체외 고처리량 분석 시스템은 암 조직과 유사하지만 96웰 및 384웰 플레이트를 가진 체외 고처리량 분석 시스템에 적합하지 않은 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs)를 사용하여 항암제를 평가하기 위해 개발되었다.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

여기에서는 ADCC bioassay kit를 사용하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 ADCC 메커니즘을 규명하고 암 면역 요법에서 항체의 치료 가능성을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

항체 의존성 세포 매개 세포 독성 리포터 생물학적 분석을 사용하여 암세포의 항체 의존성, 세포 매개 세포 독성 평가

Balb-c Ola Hsd-Fox1nu 마우스의 췌장에 녹색 형광 단백질 발현 췌장암 세포(PANC-1 GFP)를 항소적으로 이식하여 종양 진행 및 전이를 평가하는 절차가 여기에 나와 있습니다.

췌장암의 형광 동소 이식 마우스 모델

학습하세요 항암 항체와 항종양 약물 간의 시너지 효과를 평가하는 방법을 Chou-Talalay 조합 지수 방정식을 사용하여 전임상 모델에서 약물 상호작용을 정량화하고 최적의 암 치료법을 개발하는 데 활용하세요.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

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