엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

이 방법을 사용하면 작은 모델 유기체를 포함하여 작은 밀리미터 스케일 샘플에서 3차원 조직학적 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 임베디드 샘플이 매우 안정적이기 때문에 오랜 시간 동안 샘플을 유지하고 여러 번 이미지화 할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 출력은 높은 처리량 모형 시스템 유혈학, 독성학 및 잠재적으로 인간 적인 조직 진단에 매우 유용할 것입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 는 개별은 견본이 상대적으로 작고 방향을 지정하거나 기동하기 어렵기 때문에 투쟁할 것입니다. 샘플 손상을 피하기 위해 주의가 필요하기 때문에 시각적 데모가 중요합니다. 청소년 또는 더 오래된 얼룩말 물고기의 경우 고정 하기 전에 창 자 콘텐츠의 볼륨을 줄이기 위해 적어도 24 시간 동안 굶어.

10% 중립 완충파 포르말린 또는 NBF및 2x 트리카인-S를 얼음 위에 섭씨 4도까지 미리 냉각합니다. 신속하고 인도적인 안락사를 위해 2배 MS-222로 생선 수량을 두 배로 늘라. 물고기가 움직이지 못하고 60초 후, 인도적인 안락사 후, 물고기를 실온에 평평한 바닥 유리 바이알에 10%NBF 용액에 넣고 밤새 고치세요.

둘째 날에는 고정어 표본을 1x PBS pH 7.4로 각각 10분 씩 헹구는 다. 세척 후, 35 %에탄올에 샘플을 침수하고 부드러운 동요와 실온에서 20 분 동안 배양. 그런 다음 50%에탄올로 이 단계를 반복합니다.

샘플을 새로 준비한 0.3%의 인산 또는 PTA 용액을 실온에서 하룻밤 동안 배양하여 부드러운 교반을 통해 얼룩지게 합니다. 100% 에탄올과 LR 백색 아크릴 수지의 일대일 볼륨별 혼합물을 준비하여 셋째 날을 시작합니다. 샘플을 각각 70%에 탄올에서 각각 10분 동안 3회 헹구고, 부드러운 동요로 30분 동안 실온에서 90%에탄올로 샘플을 배양합니다.

동일한 조건에서 인큐베이션을 반복하지만 95%에탄올과 100%에탄올로 두 번 더 반복합니다. 결국, 샘플을 일대일 에탄올 과 LR 백색 아크릴 수지 혼합물에 담그고, 밤새 부드러운 동요로 실온에서 배양한다. 넷째 날에는 유리병에서 혼합물을 제거하고 100% LR 백색 수지를 추가하여 샘플을 침수합니다.

부드러운 동요와 실온에서 2 시간 동안 배양. 2시간 후 수지를 신선한 100% LR 화이트 수지로 교체하고 실온에서 1시간 동안 부드러운 교반을 합니다. 임베딩 장치를 조립하려면, 시편의 직경보다 0.1밀리미터 더 큰 직경의 폴리 MI 튜브를 사용하여 표준 길이30mm로 자른다.

그런 다음 P1000 마이크로 파이프 헤드를 포함 어댑터의 흰색 끝에 부착하고 폴리 MI 튜브를 좁은 끝에 삽입합니다. 샘플이 100 % LR 흰색 수지에서 1 시간 동안 배양 한 후, 작은 계량 보트로 전송하고 완전히 100 % LR 흰색 수지에 침수. 고정 된 샘플의 넓은 끝에 포함 장치의 튜브를 조준하거나 머리를 향해 천천히 표본을 튜브로 피킹하십시오.

샘플을 튜브 중간에 배치하여 시편 위와 아래에 튜브가 수지로 채워져 있는지 확인합니다. 그 직후 튜브의 열린 끝을 밀봉하려면 오일 기반의 부드러운 모델링 점토 조각을 약 1mm 두께의 시트로 평평하게 하고 인덱스와 가운데 손가락 사이의 튜브를 안정화시하십시오. 그런 다음 천천히 엄지 손가락으로 튜브의 끝에 점토를 누르고, 여분의 점토를 제거합니다.

마이크로 파이프 헤드에서 포함 장치를 제거합니다. 부드러운 회전으로 튜브를 당깁니다. 점토의 배출을 막기 위해 밀봉된 끝에 손가락을 대고 있는 동안, 튜브의 봉인되지 않은 끝을 천천히 점토로 밀어 다른 쪽 끝을 밀봉하십시오.

튜브를 튜브 랙에 수평으로 놓고 수지가 오븐에서 섭씨 65도에서 24시간 동안 중합되도록 합니다. 다음 날의 끝에서 이미지 수집을 위한 샘플을 수집합니다. 성공적으로 내장 된 제브라피시 유충에는 기포가 갇혀 있지 않습니다.

임베딩 공정 중에 공기가 갇혀 있는 경우, 중합화 중에 시료가 수평으로 배치되지 않으면 시편쪽으로 이동하여 이미지 품질을 저하시킬 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 모델 유기체를 포함시키는 데 성공했습니다. 제브라피시, 드로소필라, 다프니아 및 마우스 배아와 같은.

성공적인 포함은 제브라피시, 다프니아 및 드로소필라에 대한 마이크로 CT 스캔으로 이미지된 재구성된 3D 렌더링으로 표시할 수 있습니다. 포함 수지는 샘플 외부의 모든 검사에서 볼 수 있지만 샘플 자체를 방해하지는 않습니다. 이 견본은 2011년에 심된 제브라피애애와 같이, 오랜 시간 동안 저장하고 다중 화상 진찰 세션을 위해 재사용할 수 있습니다.

그리고 다시 2013. 해부학 적 특징은 두 검사에서 근육의 클로즈업에서 볼 수 있듯이 저장 후 보존됩니다. 또한 분할된 선을 따라 해당 평균으로 정규화된 강도 프로파일은 두 검사 모두에서 공간적으로 일치하는 로컬 피크를 보여줍니다.

두 검사모두에서 선택한 영역의 평균 강도 값은 배경의 평균으로 나누어져 스캔 간에 잘 대응하는 신호 대 잡음 비율을 생성하는 데 사용되었습니다. 이 방법을 시도하는 동안, 샘플 손상을 방지하고 기포의 도입을 방지하기 위해 신중하게 작업하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 조직학 또는 전자 현미경 검사법과 같은 그밖 방법은 단백질 발현의 패턴을 공부하기 위하여 이용될 수 있고, 2D에 관심있는 지구의 더 높은 해상도를 달성하기 위하여 이용될 수 있습니다.

우리의 희망은이 간행물이 고해상도 조직 마이크로 CT의 힘에 접근하는 것을 도울 것입니다.