Name: 액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 13일 프로토콜로 iPSC에서 인간 원시 생식세포유사세포(PGCLCs)를 생성하는 방법을. 배아체 형성과 배양 기술을 활용하여 생식계 독성 연구와 게놈 무결성 분석에 활용할 수 있습니다.

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우리 인정 시오미 야와타 Chie Owa 초기 연구 기간 동안 기술 지원 합니다. 이 연구는 JHH 승무원 의료 연구 연구소 (FAMRI) 부여와 NIEHS/NIH 보조금 R01 ES023316 및 R21ES024861 TS에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+primordial+germ+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).</li>
<li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375(2012).</li>
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<li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li>
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<li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li>
<li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li>
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<li>Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li>
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<li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li>
<li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li>
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<li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erasure+of+DNA+methylation%2C+genomic+imprints%2C+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li>
<li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 hPGCLCs의 강력한 생산 일반 2 중 karyotype10인간의 Ipsc의 3 개의 독립적인 클론으로 확인 됐다. 이러한 iPSC 클론 같은 인간의 신생아 피부 피부 섬유 아 세포 세포 문화10에서 파생 되었다. 그들은 조사 요청 시 및 적절 한 자료 전송 계약 및 배송 냉동된 라이브 인간 세포의 배열에서이 문서의 저자에 의해 제공 됩니다. 그것은 현재 정상 karyotype 우리의 프로토콜 또는 그 다른 실험실에 의해 보고를 사용 하 여 강력한 hPGCLC 생산에 필요한 인지로 알려진.
최근 연구에서 hiPSCs11 또는 ESCs14 교토 대학8 의 사이토의 그룹에 의해 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 hPGCLCs의 생산은 EOMESODERMIN의 표현에 따라, T-상자 전사 요소에 필요한 SOX17의 감 응 작용입니다. SOX17 인간 pluripotent 줄기 세포6의 생식 차별화에 녹음 방송 요인 결정 하는 마스터 혈통으로 기능 것으로 보인다. EOMESODERMIN, EOMES 유전자에 의해 부호화 및 EOMES 의 CRISPR/Cas9 녹아웃 생산 조건11, hPGCLC에 SOX17 유도의 거의 완전 한 부재를 발생 및 표현의 다른 유전자의 동일한 패턴에 따라 고 SOX17-null 녹아웃 셀입니다. EOMES에서 유도할 수 있는 벡터에서 EOMESODERMIN의 overexpression-hPGCLC 유도 문화 중 null 녹아웃 셀 효율적으로 강력한 hPGCLC 생산 뿐만 아니라 생식 유전자, SOX17 등의 유도 구조. 반면, 유도 overexpression SOX17는 또한 강력한 PGCLC 생산을 구출 하지 않고 EOMES를 유도. 따라서, EOMESODERMIN SOX17의 중요 한 업스트림 유도 이며이 인간 만능 줄기 세포에서 hPGCLC 유도에 EOMESODERMIN의 단 하나 가장 중요 한 역할을 것으로 보인다. 우리의 프로토콜 hiPSCs10, SOX17 유도 하지만 EOMESODERMINE 유도에 종속성 결정을 기다리고 있다.
이 프로토콜 변환 액 pluripotency 인간의 Ipsc ERK 독립적인 순진한 pluripotency mTeSR1 매체에서는 수정된 순진한 인간 줄기 세포 매체 (NHSM)5중간6, 프로그래밍에 4i 96 시간에 대 한 유지 합니다. 같은 인간의 iPSC 클론으로 시작 하지만 다른 상용 인간의 iPSC 성장 매체에 유지 하는 정도의 낮은 hPGCLC 수율의 귀착되 었 다 문화는 4i에 매체를 프로그래밍 하기 전에 hPGCLCs를 생성 하는 우리의 시도 합니다. 다른 미디어에서 장기 적응 hPGCLC 생산을 향상 또는 유지 하지 여부는 미래 연구에 결정 될,이 관찰을 제안 크게 프로그래밍는 4i 전에 인간의 Ipsc의 끝났다 pluripotency의 정확한 상태 EB 형성 4i 매체에서와 hPGCLC 매체에 EB 차별화에 미치는 영향.
HiPSCs 우리의 프로토콜을 다음에서 hPGCLCs의 생산은 강력 하 고 EBs의 다 수의 효율적인 생산을 가능 하 게 microwell 플레이트의 사용 때문에 부분적으로 높은 재현성 (~ 8000 일괄 처리당 EBs) 균일 한 크기 (EB 당 3000 hiPSCs). 쉽게 우리의 프로토콜을 사용 하 여 실험의 단일 일괄 처리에서 생산 하는 EBs의 수는 일반 U-하단 셀 문화 우물을 사용 하는 방법 보다 훨씬 더 큰 수 있습니다. 많은 수의 동등 하 게 크기의 EBs hPGCLCs에 균일 하 게 박 혀의 생산 작은 분자 무게 활성 제 또는 PGC 사양에 영향을 미치는 억제제를 식별 하기 위해 높은 처리량 화학 검사의 기회를 제공할 수 있습니다 또는 그들의 epigenetic 프로그래밍 등 생물학적 특성입니다. 이러한 EBs 또한 생식 세포 이용과, 환경 오염 물질 뿐만 아니라 또한 임상 처방된 약물 화학요법 에이전트 등을 포함 하 여 다 수의 독성 평가에 유용할 수 있습니다.
(I) (ii)를 엄격 하 게 지정 된 셀의 정확한 수를 접종 세포 외 기질 단백질에 mTeSR1에서 유지 하는 건강 한 hiPSCs의 사용을 포함 하는 제시 프로토콜을 사용 하 여 hPGCLCs의 강력 하 고 재현할 수 생산의 중요 한 요소 중간 변경 및 subculture, (iii) 좋은 많은 인간 재조합 BMP4, 및 (iv) 락 문화 중 EBs의 실제 손해를 최소화 하기 위해 선택의 타이밍에 따라. 그것은 우리의 경험 BMP4 시 약의 다른 많은 2 X 또는 더 큰 복용량을 요구 하는 반면 BMP4 시 약의 가장 많은 100 ng/mL 농도에서 일했다. 반면에, hPGCLCs 생산을 사용 하 여 가장 많이 BMP4 BMP4의 더 높은 복용량에서 오히려 감소의 수확량 (예를들면, 200 ng/mL). 여러 다른 많은 hPGCLC 세대를 지 원하는 그들의 성능에 대 한 여러 공급 업체에서 얻은 재조합 인간 BMP4 시 약을 테스트 하 고 최고의 많은의 큰 금액을 확보 하는 것이 좋습니다.
우리의 hPGCLC 프로토콜의 독특한 특징은 hPGCLCs EBs10 (그림 8)의 가장 바깥쪽 표면 층에 지역화 된 반면 다른 프로토콜 셀 집계6,8중간 hPGCLCs를 생성할 수 있습니다. Embryoid 몸 표면, 바깥쪽, 안쪽 껍질, 코어, 등 여러 가지 계층을 형성 하는 경향이 있으며 중앙 코어 지역 종종 프로 살아남은 성장 요인 제공 형태는 문화 뿐만 아니라 영양소, 산소의 제한 된 공급으로 인해 괴 사 성 매체 유포20. EBs의 중심으로 제한 된 보급 때문 가능한 제한 없이 EBs의 표면에 hPGCLCs의 지역화, 시간 및 복용량 제어에 직접 노출 hPGCLCs의 약물 이나 독성 물질에 대 한 도움이 될 수 있습니다 약물 또는 독성에 관한 연구입니다.
마우스 PGCLCs 쇼 강력한 게놈 전체 DNA demethylation는 각 인을 포함 적어도 부분적으로 영역을 제어 하는 반면7,,1920, hPGCLCs에서 글로벌 gDNA demethylation의 마우스 보다 약한 것 같다 PGCLCS 또는 PGCs6,7. Transcriptomal 프로 파일 hPGCLCs 마우스 PGCLCs10PGCs 배아의 초기 단계를 유사할 수 있습니다는 것이 좋습니다. 그것은 알려졌다 hPGCLC 생산의 조건 하에서 EBs의 장기간된 문화 gDNA demethylation7;의 증가 발생 그러나, 미래 연구에 의해 결정 될 필요 hPGCLCs EBs에서 또는 고립 된 세포로 서의 문화의 장기간 생식 차별화의 고급 단계를 달성할 수 있는 여부.

원시 생식 세포 (PGCs)는 남녀 모두에서 모든 생식 세포의 일반적인 선구자. 포유류 배아에 PGCs의 개발에 우리의 지식의 대부분이 실험실 쥐1,2공부를 통해 얻은 되었습니다. 마우스 배아의 배아 하루 6.0-6.5, 6 또는 유사한 PGC 선구자의 작은 숫자 epiblast, 그리고 창립 ~ 40 PGCs 방식으로 뼈 morphogenetic 단백질 Bmp2, Bmp4 인접에서 분 비에 의존 그들 로부터 유도 된다 인구에 있는 셀입니다. 배아에서 지금까지 확인 된 가장 이른 인간 PGCs 임신3의 제 3의 주에의 끝 주위에 노 른 자 골목의 endodermal 벽에 있었다. 이것이 같은 장소 마이그레이션 PGCs 마우스 배아에서 관찰 된다, 때문에 그것은 가능성이 관찰된 인간의 PGCs 마이그레이션 하지 창립 인구의 경로에 있었다. 그러나, 이전 단계를 다시 추적 연구 PGCs 또는 PGC의 인간 배아에서 일어나 누락 되었습니다.
인간의 배아 PGCs에 대 한 액세스 기술 및 윤리적인 장애 때문에 도전 이다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 PGC 같은 셀 문화 모델 최근 인간 만능 줄기 세포 (PSCs)에서 생성 된 것. Pluripotency는 생식 및 3 개의 미 발달 세균 층4으로 차별화 하는 세포질 기능입니다. 반면 인간의 Psc mTeSR1 매체 (준비--사용, 상업적으로 이용 가능한 매체 끝났다 pluripotency 상태에서 인간의 Psc의 유지 보수에 대 한 구상)에 세포 외 기질 단백질으로 코팅 하는 요리에 유지는 액 상태 pluripotency 4, 2013 년에 야 곱 한 나의 실험실 보였다 끝났다 pluripotency 셀 ERK1/2, GSK3, 설립, 바위, PKC, 단백질 kinases에 화학 억제제를 포함 순진한 인간 줄기 세포 매체 (NHSM)에 노출 하 여 순진한 pluripotency 상태도 변환할 수 있습니다 및 p38 MAPK 뿐만 아니라 성장 요인 LIF, TGF, bFGF5. 순진한 pluripotency 인간의 Psc에서 2015 년에 나와 Azim Surani 이끄는 연구 그룹 PSCs6에서 인간 PGC-Like 셀 (hPGCLCs)의 첫 번째 강력한 생산 달성. 나중에, 우리를 포함 한 다른 여러 실험실 보고 약간 다른 프로토콜7,8,,910을 사용 하 여 Psc에서 hPGCLCs의 세대. 우리의 연구 제공 증거 (우리가 이전에 게시 연구10의 표 s 1에서 요약 된다)는 서로 다른 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 hPGCLCs transcriptomally10를 서로 비슷합니다. 사용할 수 있는 증거는 초기 단계의 인간 배아 PGCs 글로벌 epigenetic 삭제7 또는 혈 마이그레이션10이전에 인간 PGCLCs의 유사를 지원합니다.
연구의 마우스 배아 PGCs, 마우스 PGCLCs, 및 인간 PGCLCs (하지만 유일한 인간 PGCs에 대 한 매우 제한 된 액세스) PGC의 분자 메커니즘 마우스와 인간1,6, 사이 크게 차이가 밝혀 7,8,9,10,11,12,13,,1415,16 ,17. 예를 들어 마우스 배아에서 PGC 사양에 중요 한 역할을 담당 하는 Prdm14 보이지만 인간의 PGC 사양에서의 역할 제한1,15. 대조적으로, SOX17 EOMESODERMIN에 의해 유도이 녹음 방송 요인 것 마우스 PGC 사양15불가결 반면 PGC 사양6,,1114, 필수적 이다. 연구 강하게 hPGCLCs를 사용 하 여 이러한 초기 성과 인간의 배아 PGCs의 대리로 서이 세포 문화 모델의 중요성을 지원 합니다.
최근에 출판 된, genomic DNA 복사 번호 분석, 실험실의 깊은 시퀀싱 평가 관련 연구 순진한 pluripotency 상태에 Psc의 장기 유지 보수 크게 염색체 불안정성의 위험을 증가 하 고 구조상 변칙입니다. 이 현상은 마우스18 와 인간의19 Psc 관찰 되었다. 한 나/Surani에 의해 보고 된 원래 hPGCLC 생산 프로토콜 2 주64i 순진한 pluripotency 매체에 유지 하는 인간의 Psc에 대 한 개발 되었다. 인간의 PSCs 및 PGCLCs의 정상적인 2 중 karyotype를 유지 하려면 우리는 인간의 PSCs 72 시간10,이 문서에 표시 됩니다에 대 한 4i 매체에 노출 되는 수정 된 프로토콜을 개발 했다. 인간의 Ipsc (hiPSCs)는 끝났다 pluripotency 상태 유지 됩니다. EB 형성 직전 세포는 인 큐베이 팅 4i 순진한 재활 매체 (수정된 NHSM 매체)에서 48 시간 동안. 셀 해리 그리고 4i 매체에 추가 24 시간 형태로 EBs microwells에 포장 됩니다. EBs는 hPGCLCs의 최대 수확량을 얻기 위해 최대 8 일 동안 아니 첨부 문화에 대 한 락 조건 하에서 재조합 인간 BMP4의 높은 농도 포함 하는 hPGCLC 유도 매체에 유지 됩니다. 8 일 EB 문화, 후 hPGCLCs 수 FACS에 의해 해리 EB 셀에서 절연 CD38 + 최대 40%까지 셀 FACS 정렬 가능한 단일 셀에 항복. 반면 다른 출판 방법7,,89, 우리의 수정6, 전에 원래 프로토콜을 포함 하 여 일반적으로 생성 hPGCLCs 관련 없이 자발적으로 형성 된 셀 집계 지역화, 우리의 프로토콜에 의해 생산 하는 hPGCLC embryoid 몸 (EBs)의 표면에서 관찰 된다.

<table><tbody><tr><td>Primed pluripotency hiPSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Aliquot Matrigel을 제조업체가 지정한 부피(약 200 &mu; L). 콜드 튜브를 사용하십시오. -80 &deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21041-025</td><td>4°C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td>은 <td>기초 배지에 5X 보충제를 추가하여 재구성합니다. 재구성된 매체는 4°C에 저장할 수 있습니다. C는 세포 배양 성능에 영향을 주지 않고 최대 4주 동안 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon</td><td>1683</td><td>묽게 5 mg Y27632 (MW 320.26) 312.2 &mu; L 50mM Y27632 원액을 준비하기 위한 물. 여과에 의한 살균 (0.22 &mu; m). 부분 표본 20 &mu; L/tube x 15 튜브 및 -20 °C에서 보관.</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07930</td><td>4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell technologies</td><td>AT104-500</td><td>세포 해리 효소; 분취량 40 mL/튜브 x 12 튜브 및 -20°C에서 보관.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4i hiPSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286101</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>부분 표본 40mL/튜브 x 튜브 12개를 추출하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882-100MG</td><td>물 10 mL에 빙초산 0.1 mL를 첨가합니다. 여과 (0.22 um)에 의하여 살균하십시오. 100mg 인슐린 동결건조 분말을 산성수 10mL를 찬물로 희석하여 10mg/mL 원액을 만듭니다. 부분 표본 650 &mu; L/tube x 15 튜브 및 -80°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>인간 LIF</td><td>PeproTech</td><td>300-05</td><td>재구성 250 &mu; g 인간 LIF, 250 &mu; L 물. 750 추가 &mu; 250 &mu를 만들기 위해 PBS (-)에서 0.1 % 소 혈청 알부민의 L; g/mL 인간 LIF 원액. 이 제품의 특정 활성도는 >10,000 단위/&mu;g입니다. 부분 표본 40 ul/tube x 25 tubes, -80 °C에서 보관</td></tr><tr><td>인간 FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>4114-TC</td><td>1mg 인간 FGF2를 5mL PBS(-)로 재구성하여 200 &mu를 만듭니다. g/mL 인간 FGF2 원액. 부분 표본 100 &mu; L/tube x 50 튜브 및 -80°C에서 보관.</td></tr><tr><td>인간 TGF-&베타; 1</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>재구성 50 &mu; g와 50 &mu; 10mM 구연산(pH 3.0)의 L. 150 추가 &mu; 250 &mu를 만들기 위해 PBS (-)에서 0.1 % 소 혈청 알부민의 L; g/mL 인간 TGF-&베타; 1 재고 솔루션. 부분 표본 4 &mu; L/tube x 50 튜브 및 -80°C에서 보관.</td></tr><tr><td>4i 기초 배지</td><td></td><td></td><td>다음 시약을 혼합하여 4i 기초 배지를 만듭니다. 500mL의 KnockOut DMEM 100mL의 KnockOut 혈청 대체품 6mL의 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100x) 6mL의 MEM 비필수 아미노산 용액(100x) 650 &micro; 소 췌장에서 추출한 10mg/mL 인슐린 L 40 &micro; 250 &마이크로의 L; g/mL 인간 LIF 20 &마이크로; 200 &micro의 l; g/ml 인간 FGF2 4 &마이크로; 250 &마이크로의 l; g/ml 인간 TGF-&베타; 1 부분 표본 40 ml/tube 및 -80 &deg;C.에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td>는 <td>1791년 &mu를 가진 25 mg CHIR99021 (MW 465.34)를 재구성한다; 30mM CHIR99021 원액을 만드는 L DMSO. 부분 표본 50 &mu; L/tube x 35 튜브 및 -20°C에서 보관.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td>은 <td>1037 &mu로 5 mg PD0325901 (MW 482.19)를 재구성합니다. 10 mM PD0325901 원액을 만들기 위한 L DMSO. 부분 표본 50 &mu; L/tube x 20 튜브 및 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>축삭</td><td>1358</td><td>재구성 10 mg BIRB796 (MW 527.66) 948 &mu; 20mM BIRB796 스톡 용액을 만드는 L DMSO입니다. 부분 표본 50 &mu; L/tube x 18 튜브 및 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>SP600125</td><td>Tocris</td><td>1496</td><td>재구성 10 mg SP600125 (MW220.23) 908 &mu; L DMSO는 50mM SP600125 원액을 만듭니다. 부분 표본 50 &mu; L/tube x 18 튜브 및 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27845</td><td>마이크로웰 플레이트</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>100mL 물에 5g Pluronic F-127을 재구성하여 5%(w/v) Pluronic F127 원액을 만듭니다. 여과 (0.22 um)에 의하여 살균하십시오. Aliqout 50mL/튜브 x 튜브 2개 및 RT에 보관</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>hPGCLC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow' s MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>hPGCLC 기초 배지</td><td></td><td></td><td>다음 시약을 혼합하여 hPGCLC 기초 배지를 만듭니다. 500 mL of Glasgow' s MEM 녹아웃 혈청 대체품 75mL MEM 비필수 아미노산 용액 6mL(100x) 100mM 피루베이트나트륨 6mL 페니실린-스트렙토마이신(x100) 부분 표본 6mL/튜브 40mL를 보관하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td>묽게 350 &mu; L 2-메르캅토에탄올(14.3m)을 9.65mL PBS(-)에 넣어 500mM 2-메르캅토에탄올 원액을 만듭니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4544</td><td>400mg의 L-아스코르브산을 20mL의 물로 재구성하여 20mg/mL의 L-아스코르브산 원액을 만듭니다. 여과 (0.22 um)에 의하여 살균하십시오. 부분 표본 500 &mu; L/tube x 40 튜브 및 -20 °C에서 보관.</td></tr><tr><td>재조합 인간 BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>10mL의 4mM HCl aq.로 1mg 재조합 인간 BMP4를 재구성하여 100 &mu를 만듭니다. g/mL 재조합 인간 BMP4 원액. 부분 표본 250 &mu; L/tube x 40 튜브 및 -80°C에서 보관</td></tr><tr><td>인간 SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>재구성 250 &mu; g 500 &mu를 가진 인간 SCF; 500 &mu를 만들기 위해 PBS (-)에서 0.1 % 소 혈청 알부민의 L; g/mL 인간 SCF 원액. 부분 표본 35 &mu; L/tube x 14 튜브 및 -80°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>인간 EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>1 mg 인간 EGF를 PBS(-)에 0.1% 소 혈청 알부민 1 mL로 재구성하여 1 mg/mL 인간 EGF 원액을 만듭니다. 알리콧 100 &mu; L/튜브 x 10개의 튜브. 100 &mu를 희석하십시오. 300 &mu를 가진 1 mg/ml 인간적인 EGF 재고 해결책의 L; 250 &mu를 만들기 위해 PBS (-)에서 0.1 % 소 혈청 알부민의 L; g/mL humanEGF 원액. 부분 표본 20 &mu; L/튜브 x 20 튜브. -80 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>셀 스트레이너</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>기공 크기 = 40 &m.</td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>낮은 부착 플레이트</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Vari-Mix 플랫폼 로커</td><td>Thermofisher</td><td>M79735Q</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunohistochemical staining </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLOXALL 차단 솔루션</td><td>VECTOR</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse serum ImmPRESS 시약 Anti-Goat IgG</td><td>Vector</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>OCT-3/4 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8629</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>VECTOR</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermofisher</td><td>SP15-100</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolating hPGCLC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryoid Body Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-348</td><td></td></tr><tr>APC <td>abcam</td><td>ab134399</td><td></td><td>에 접합된 항-CD38 항체</td></tr></tbody></table>

액 pluripotency에서 embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

원시 생식 세포 (PGCs)는 모든 생식 세포의 일반적인 선구자. 마우스 배아에서 40 ~ PGCs의 창립 인구는 만능 epiblast 세포에서 cytokines, 뼈 morphogenetic 단백질 4 (Bmp4)를 포함 하 여 조율 된 노출에 의해 유발 됩니다. 인간 배아, 초기 PGCs 임신, 3rd 주 말께 른 골목의 endodermal 벽에 확인 되었습니다 하지만 작은 인간의 PGC 사양 및 그들의 초기 발달의 과정에 대 한 알려져 있다. 인간의 배아 PGCs의 기술 및 윤리적인 장벽을 우회 하 대리 셀 문화 모델 최근 pluripotent 줄기 세포에서 생성 된 것. 여기, 우리 인간의 PGC-Like 셀 (hPGCLCs)의 강력한 생산에 대 한 일 프로토콜을 설명합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 끝났다 pluripotency 상태에서 유지 재프로그래밍 매체 48 시간에 대 한 4i 순진한에 인 큐베이 팅, 단일 셀에 해리 있으며 microwells로 포장. 순진한 pluripotency 상태에서 hiPSCs의 장시간된 유지 보수 중요 한 염색체 착오 원인과 피해 야 한다. hiPSCs는 microwells에 추가 4i 매체 형태 embryoid 시체 (EBs), 그는에 있는 24 시간 배양 낮은 준수 plasticware의 높은 농도 포함 하는 hPGCLC 유도 매체에 락 조건에 대 한 유지 됩니다. 재조합 인간 BMP4입니다. HPGCLCs의 최대 수율을 얻기 위해 락, 비 부착 상태에서 최대 8 일 동안 EBs 교양 추가. Immunohistochemistry로 hPGCLCs 그들의 표면에 독점적으로 거의 모든 EBs에서 OCT4를 강하게 표현 하는 세포로 쉽게 검색 됩니다. HPGCLCs CD38 + 셀 최대 40-45%으로 수집 될 수 있습니다 때 EBs는 효소 해리 FACS 농축을 복종, 항복.

여기에 사용 된 microwell 격판덮개 24 잘 형식에 있으며 각각 최대 1, 200의 형성을 지 원하는 microwell 시트를 들고 8 우물 EBs. 4i 순진한 pluripotency 셀의 약 24 백만에서이 microwell 격판덮개는 일반적으로 ~ 8000 생성 EBs EB 당 3000 ~ 셀으로 구성 된. 비 점착의 문화 EBs 정 락, 동안 그대로 EBs의 수는 점차적으로 자발적인 자기 해체와 ~ 3000 감소 EBs 프로토콜의 하루 13까지 살아남을. EBs를 살아남은 이들 중 대부분이 50-200 hPGCLCs 그들의 표면에 (OCT4 + EBs의 직렬 섹션에서 셀의 immunohistochemical 탐지에 의해 추정, 그림 8참조), ~ 100000 OCT4 + hPGCLCs 총에서 떨어졌다. 단일 세포로 EBs의 효소 소화는 9000-47000 셀에 FACS 농축 CD38 + hPGCLCs의 수확량 감소 상대적으로 비효율적인 프로세스입니다. 우리 손에 실험의 6 개의 독립적인 하지만 연속 배치의 평균이 14,038 ± 5,731 (± sem의 의미) 이었다. CD38-음성 EB 셀 셀 OCT4 mRNA (정량) 또는 단백질 (Immunohistochemistry) 매우 약하게만 표현 하지 않을 경우 완전히 결 석, 모든 EB 셀 강하게 때문에 OCT4 단백질 표현는 사실상 CD38 + hPGCLCs의 전체 인구.
이 프로토콜의 중요 한 매개 변수 셀 밀도 포함합니다. 셀에 대 한 20-30%를 도달할 것 이다 105 인간의 Ipsc x 2.0는 세포 외 기질 단백질 코팅 잘 판의 6 잘 셀 문화 (잘 당 9.60 cm2 성장 지역) 2 mL Y27632 보충 매체 (2.2.9)에 주사는 때 24 confluency (그림 1) 접종 후 시간. Y7632, 셀 집계 및 식민지를 형성의 부재에서 mTeSR1 매체에 추가 24 시간 문화, 후 성장 지역 (그림 2)의 ~ 30%를 점유. 셀 다음 4i 재활 매체 (2.3.2)에 교양. 후에 문화 4i 중간, 세포가 합칠 (그림 3)에서 24 시간. 4i 매체에 추가 24 시간 문화 세포를 밀도가 포장 (그림 4)를 만듭니다. 중간 변경 (4 시간 + 매 24 시간) 및 셀 밀도의 정확한 타이밍은 EBs와 hPGCLCs의 성공적인 형성을 위한 중요 합니다.
48 시간 4i 매체에서 문화, 후 셀 해리 하 고 우물 400 µ m 크기 (2.4)에 microwell 접시에 주사. 비록이 상용 microwell 플레이트 코팅에 대 한 낮은 접착 표면 제조 업체, 신선한 다시 세제 (2.4.3)로 코팅 하 여 원치 않는 세포 접착의 위험을 줄일 수 것이 좋습니다. 800 µ m microwells EB 크기 제대로 감독 차별화의 중요성을 제안 하는 hPGCLCs의 감소 된 수확량 귀착되는. 셀 4i 매체에 주사에서 24-30 시간, 표준, 거꾸로 단계 대조 현미경 (그림 5)를 사용 하 여 관찰 될 수 있는 microwells에 EBs를 형성할 것 이다. EBs의 원형 윤곽에서 및 24 시간의 외피 후에 명확 하 게 표시 된다. (예를 들어, 접종 후 16 시간) 이전 시점에 EBs를 수확 그들의 원형 컨투어 명확 하 게 표시 되기 전에 같은 EBs 기계적 손상에 매우 취약 하 고 쉽게 분해 하기 때문에 권장 하지 않습니다. 상당한 양의 순 hiPSCs 되지 않은 참고 통합 EBs, 정상입니다. 이 비법 인된 셀 락 낮은 부착 표면 (2.5.2)에 EBs의 문화의 개시 전에 멀리 세척 될 것 이다. 또한 note, 우리의 프로토콜에서 EBs 4i 순진한 pluripotency 매체-hPGCLC 매체에에 형성 된다. HPGCLC 매체에 노출 하기 전에 4i 매체에 고체 EBs의 전 형성은 EBs의 표면에 hPGCLCs의 배포에 대 한 중요 합니다.
EBs 락, 아래 hPGCLC 매체에 유지 비 점착 문화 상태 집계 또는 융합 (그림 6 및 그림 7) 없이 그들의 둥근 모양을 유지할 것 이다. 너무 약한 상태를 락 EB 집계 및 퓨전, 이지만 너무 가혹한 조건이 EBs 해체 됩니다. 인간의 PGCLCs 8 일 문화 (그림 8)까지 이르면 5 일 문화 hPGCLC 매체에 그들의 숫자가 증가 후 EBs의 표면에 세포 OCT4 표현으로 등장. EBs의 더 인큐베이션 EBs 및 hPGCLCs의 손실의 해체 될 수 있습니다. 인간의 PGCLCs 수 농축 효소 천연된 EB 세포에서 hPGCLC 매체에 있는 문화의 5-8 일 후 FACS에 의해 CD38 + 셀 (그림 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> 그림 1: 인간의 iPSC 세포 배양 매체 Y27632 보충 접종 후 24 시간에에서. 셀 밀도 약 20-30 %confluent. 바위 억제제 Y27632, 존재 셀 잘 긴, 스파이크와 같은 신장으로 확산 하는 경향이. 눈금 막대 100 μ m =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> 그림 2: 인간의 iPSC 세포 배양 접종 후 48 시간. 셀 성장 지역의 ~ 30%를 점령, 식민지를 형성 하는 집계입니다. 눈금 막대 100 μ m =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> 그림 3: 인간의 iPSC 세포 배양 4i 재활 매체에 24 시간 동안 incubated. 셀은 confluency에 도달. 눈금 막대 100 μ m =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> 그림 4: 인간의 iPSC 세포 배양 48 시간에 대 한 4i 재활 매체에서 incubated. Confluent 세포 밀도가 포장 된다. 눈금 막대 100 μ m =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> 그림 5: EBs는 4i 매체 프로그래밍의 24 시간 보육 후 microwells에서 형성 하는 인간의 iPSC. EBs의 원형 컨투어 접종 후 24 ~ 30 시간에 표시 된다. 단계 대조 현미경 윤곽을 확인 하는 때 EBs 락 문화 조건에 대 한 준비가 되었습니다. 눈금 막대 = 500 μ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> 그림 6: EBs hPGCLC 매체에 24 시간 동안 incubated 인간의 iPSC. EBs는 크게 그들의 둥근 모양을 유지 합니다. 눈금 막대 = 500 μ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> 그림 7: EBs hPGCLC 매체에서 192 시간 동안 incubated 인간의 iPSC. EBs가 24 시간 문화에서 그들의 모습에 비해 확대 하지만 그들은 여전히 크게 집계 또는 퓨전 둥근 모양을 유지. 눈금 막대 = 500 μ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> 그림 8: OCT4 표현 하는 인간의 PGCLCs hiPSC hPGCLC 매체에서 192 시간 동안 incubated EBs의 표면에 지역화 됩니다. EBs는 세포 외 기질 단백질에 포함 되었고 FFPE 슬라이드 immunohistochemical OCT4의 얼룩에 대 한 처리 (DAB 기판). 눈금 막대 = 1 m m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> 그림 9: 인간 PGCLCs는 농축 효소 천연된 EB 셀에서 FACS CD38로+ 셀. 5-8 일에 대 한 hPGCLC 매체에 부 화, 후 EBs 단일 세포 현 탁 액을 준비 하는 효소 소화에 의해 해리 했다 수 있습니다. hPGCLCs CD38 농축 될 수 있다+ FACS (빨간 점)에 의해 세포. EB 셀 CD38 표현 하지 않는 (파란색 점) 또한 부정적인 제어로 수집 한다. FACS 게이츠 CD38-포지티브 / 네거티브 CD38 셀의 셀의 각 종류의 오염을 피하기 위하여 넓은 여백 (녹색 점)으로 분리 되어야 한다. 상위 및 하위 패널 없이 또는 얼룩, 각각 안티 CD38 항 체와 FACS 프로필 표시. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

원시 생식 세포 (PGCs)는 정자와 모두의 일반적인 선구자. 인간의 배아 PGCs cytokines의 상호 작용을 통해 만능 epiblast 셀에서 지정 됩니다. 여기, 우리가 유도 액 pluripotency 유도 만능 줄기 세포에서 embryoid 몸 표면에 PGCs을 닮은 인간의 세포 transcriptomally의 13 일 프로토콜을 설명 합니다.

액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

이 방법은 인간 원시 생식 세포의 게놈에 있는 손상이 생성되거나 복구되는 방법과 같은 인간 생식선 독성학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 원시 생식 세포가 임신 한 유전자 배경을 품고있는 원시 적 iPS 세포로부터 2 주 안에 생성 될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 인간 생식선 세포에 있는 게놈 손상의 예방을 향해 확장합니다, 우리의 세포 배양 모형은 치료 약의 생식선 독성을 감소시키는 것을 도울 수 있기 때문에.인간 원시 세균 세포 와 같은 세포의 생성으로 시작하려면, 또는 인간 PGCLCs, 텍스트 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 세포 외 매트릭스 단백질 코팅 플레이트 및 인간 iPSC의 세포 현탁액을 준비. Y-27632 Rho 키나아제 억제제가 함유된 mTeSR1 배지에서 프라이밍 된 인간 iPSC의 단일 세포 현탁액을 준비한다. 셀 밀도를 밀리리터당 100, 000 세포로 신중하게 조정합니다.세포외 매트릭스 단백질의 각 우물에서 프라이밍 된 인간 iPSC의 세포 현탁액 의 2 밀리리터를 접종하여 6 웰 플레이트를 코팅하여 세포가 수직 및 수평으로 플레이트를 흔들어 고르게 분포되도록합니다. 섭씨 37도에서 삼가스 CO2 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에서 정확히 200, 000 세포를 접종하는 것이 매우 중요합니다.셀의 정확한 계수는 매우 중요합니다. 순진한 자성화로 의 일시적인 변환의 완료 후, 세포는 정상, 지나치게 혼잡을 봐야한다. 중간 변화의 정확한 타이밍은 높은 인간 PGCLC 및 실험 재현성을 달성하는 것이 중요합니다.4i hiPSC 배양물의 밀도는 이러한 조건하에서 높으며, 접종 후 48~72시간 동안 세포가 응수될 것으로 예상된다. 접종 후 24시간, Y27632 없이 mTeSR1 배지의 웰당 2밀리리터로 배지를 변경한다. 15분 동안 섭씨 37도의 수조에서 완전한 배지 의 50 밀리리터를 15분 동안 섭씨 37도의 완전한 배지로 따뜻하게 하여 4i 순진한 만능 줄기 세포로 발포된 자성수 상태의 인간 iPSC를 4i 순진한 만능 줄기 세포로 전환하기 시작합니다.접종 후 48 및 72시간 에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 4i 의 웰당 2 밀리리터로 배지를 변경합니다. 실온에서 5분 동안 1, 000g의 세제 코팅 마이크로웰 플레이트를 원심분리합니다. 거품의 부재를 보장하기 위해 반전 현미경으로 우물을 검사합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 우물을 헹구고 원심 분리를 반복합니다. 헹구는 우물에 4i 전체 매체를 추가합니다. 상온에서 5분 동안 1, 000g의 플레이트원심분리기를 하고 우물을 다시 검사합니다.마이크로웰 플레이트에 4i 인간 iPSCs를 접종하려면 프로토콜에 설명된 바와 같이 인간 iPSC 세포 현탁액을 준비한다. 40 마이크로미터 모공 크기의 세포 여과기를 통해 이 세포 현탁액을 필터링하여 세포 응집체를 제거합니다. 전동4i의 1밀리리터로 여과기를 3회 세척하여 스트레이너로부터 모든 세포를 수집하고 배양 카운터로 세포를 세어보세요.이어서, 4i 순진한 인간 iPSC의 이 단세포 현탁액을 9밀리리터에서 27~3,240만 세포로 희석하여 Y27632를 함유한 4i 완전 배지를 사전 따뜻하게 하였다. 트라이 가스 인큐베이터에서 웰당 4i 의 1 밀리리터를 포함하는 이전에 준비된 마이크로웰 플레이트를 제거하십시오. 4i 순진한 인간 iPSC 현탁액의 1 밀리리터를 각각 잘 접종하여 웰당 3.0 ~360만 개의 세포농도를 달성한다.부드럽게 파이펫을 사용하여 셀을 고르게 분배합니다. 상온에서 3 분 동안 100g의 플레이트원심분리기. 접시를 트라이 가스 CO2 인큐베이터에 놓고 마이크로웰에서 펠렛 세포를 방해하지 않도록 하고, 하룻밤 잠복이 단단한 배아 체 또는 EB의 형성에 충분하지 않기 때문에 24~30시간 동안 배양합니다.인간 PGCLC 기저형 배지의 5 밀리리터와 20 밀리리터의 인간 PGCLC는 섭씨 37도의 수조에서 최소 5분 동안 완벽한 배지를 50밀리리터 폴리프로필렌 원내 튜브 위에 40마이크로미터 모공 크기의 셀 스트레이너를 조심스럽게 거꾸로 놓습니다. 마이크로웰에서 EB를 분리하려면 플레이트의 각 우물을 부드럽게 피펫합니다. EB에 통합되지 않은 세포를 제거하려면 셀 스트레이너를 통해 모든 우물의 내용을 필터링합니다.전침이 좋은 인간 PGCLC 기저질의 1밀리리터로 세포 스트레이너의 막에 보관된 EB를 부드럽게 세척하고 5회 세척을 반복합니다. 셀 스트레이너에 신선한 50 밀리리터 원뉴컬 튜브를 배치하여 세포 스트레이너가 이제 새로운 튜브에 오른쪽으로 배치되도록 합니다. 세포 스트레이너를 새로운 튜브로 신속하게 반전하여 EB를 세포 스트레이너의 막 아래에 배치합니다.원적 튜브에서 EB를 수집하기 위해 세포 스트레이너의 멤브레인에 미리 따뜻워진 인간 PGCLC 의 18 밀리리터를 세포 스트레이너의 막에 추가합니다. 그런 다음, 낮은 부착 6 웰 플레이트의 우물에 EBs의 현탁액의 우물당 플레이트 3 밀리리터. 시소 이동 로커에 플레이트를 트라이 가스 인큐베이터에 놓고 분당 약 20 회전으로 흔들 속도를 신중하게 설정합니다.실험 7일째에서 13일째에 매일 20밀리리터의 인간 PGCLC 를 준비합니다. 로커에서 접시를 제거하여 EB가 우물 바닥으로 가라앉게 합니다. 기존 배지의 약 0.2 밀리리터가 각 우물에 남아 있도록 EB를 건조하지 않고 오래된 매체를 제거합니다.매일 오래된 매체를 제거 한 후 신선한 인간 PGCLC 완성 매체의 웰 당 3 밀리리터를 추가합니다. 인간 PGCLC를 OCT4 양성 세포로 식별하려면 1.5 밀리리터 저결합 미세 원심분리기 튜브로 EB를 수확하십시오. EB가 실온에서 바닥으로 가라앉고 매체를 폐기하십시오.얼음 차가운 1X PBS로 EB를 헹구는 다. PBS를 제거한 후 PBS의 부피 아지드에 의해 얼음 냉기 1mm 무게의 1 밀리리터로 5분 간 얼음에 있는 EB를 배양합니다. 실온에서 EB가 바닥으로 가라앉도록 하십시오.상체를 폐기한 후, 얼음 차가운 PBS로 EB를 헹구십시오. 얼음에 세포 외 매트릭스 단백질의 200 마이크로 리터를 해동. EB를 함유한 튜브에 단백질을 추가합니다.젤이 고화되고 EB가 내장될 때까지 튜브를 실온에서 약 10분 동안 둡니다. EB를 고치려면 PBS에 4%포름알데히드1밀리리터를 넣고 실온에서 15분간 부드러운 흔들림으로 배양합니다. 그 후, 포름알데히드를 버리고 얼음 차가운 PBS로 한 번 EB를 헹구십시오.70%에탄올1밀리리터를 넣으세요. 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 70%에탄올을 보관하거나 표준 FFPE 프로토콜로 처리하십시오. 각 우물에 세포의 세포 밀도 및 균등 한 분포는 매우 중요합니다.Y27632의 2 밀리리터의 인간 IPSC는 6웰 플레이트의 웰당 중간을 보충하여 24시간 후에 20~30%의 합류에 도달합니다. mTeSR1 배지에서 24시간 배양후, Y27632가 없는 경우, 세포가 집합화되고 형성된 식민지를 형성하여 성장 영역의 약 30%를 차지하였다. 4i 리프로그래밍 배지에서 24시간의 배양 후, 세포는 합류에 도달했습니다.4i 배지에서 24시간의 배양후 세포가 더 조밀하게 포장되었습니다. 4i 리프로그래밍 배지에서 마이크로웰에서 24시간 배양한 후, 세포는 접종 후 24~30시간 후에 원형 윤곽을 보이면서 EB를 형성했습니다. EB는 인간 PGCLC 배지에 보관, 흔들리는 비 준수 조건하에서, 24 시간 후에 응집없이 그들의 구형 모양을 유지했습니다.192시간 이후에는 동일한 형태를 유지하면서 EB가 더 커졌습니다. 5 일 후, 세포는 8 일 후에 그들의 수를 증가시키는 EB의 표면에 세포를 표현하는 OCT4로 나타났습니다. 인간 PGCLCs의 단일 세포 현탁액으로부터의 세포는 FACS에 의해 CD38 양성 세포로 농축되었다.CD38을 발현하지 않는 세포는 음의 대조군이었다. 오염을 방지하기 위해 FACS 게이트 CD38 양성 및 CD38 음수 세포는 넓은 마진으로 분리되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 정확한 셀 계산 및 중간 변화의 타이밍을 따르는 것이 중요합니다.하루라도 중간 변화를 생략하거나, 어떤 단계에서든 그 매체의 부피를 감소시키는 것은 대규모 세포 사망을 초래할 수 있다. 배아 체의 흔들리는 문화의 속도는 신중하게 최적화되어야합니다.

generation-human-primordial-germ-cell-like-cells-at-surface-embryoid

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 비디오는 배아체(EB)를 신경 상피 응집체로 분화하고 이후 신경 세포와 신경교세포로 분열하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 in vitro에서 신경 세포 및 신경교세포를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이는 독성 테스트를 위한 테스트 시스템 역할을 할 뿐만 아니라 신경 독성과 관련된 다양한 경로를 평가할 수 있습니다.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포(hPSC)가 구형 뇌 오가노이드로 변형되는 과정을 보여줍니다. 특정 억제제를 사용함으로써 hPSC는 신경 계통으로 분화하도록 유도되어 신경 외배엽 군체를 형성합니다. 그런 다음 특수 성장 인자를 도입하여 군체의 자기 조직화와 증식을 촉진하여 궁극적으로 구형 뇌 오가노이드의 형성으로 이어집니다.

인간 만능 줄기 세포에서 스페로이드 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

배우세요 13일 프로토콜로 iPSC에서 인간 원시 생식세포유사세포(PGCLCs)를 생성하는 방법을. 배아체 형성과 배양 기술을 활용하여 생식계 독성 연구와 게놈 무결성 분석에 활용할 수 있습니다.

액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

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