Name: 혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 산소 민감성 금속을 포함하는 단백질에서 효소 활성을 유지하는 무산소 단백질 정화 및 산소 전극을 통한 운동 분석 방법입니다. DesB 디옥시게나아제의 안정성과 활성을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 기술 지원에 대 한 웨슬리언 대학교의 박사 카밀 켈러를 감사 하 고 싶습니다. 혐 기성 단백질 정화 방법 및 O2의 사용에 관한 그들의 조언에 대 한 특별 감사 교수 린지 디 Eltis 제 나 K. Capyk 브리티시 컬럼비아의 대학에서 뿐만 아니라 오스틴에 있는 텍사스 대학에서에서 기독교 휘트먼 -민감한 전극.

저자는 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 있다.

활성, 순화 DesB 단백질을 얻기에 있는 중요 한 단계는 형성 및 효소의 감소 Fe(II) 활성 사이트의 유지 관리를 포함 한다. 따라서, 유도, 정화, 농도, 성능 수정 하 고 염 단계는 활성 효소를 성공적으로 취득에 필수적인. Fe(II)을 DesB의 활성 사이트를 올바르게 통합 보장 1 mM 철 암모늄 황산의 단백질 발현을 유도 합니다. 이 메서드는 종종 적절 한 접는 수 있도록 성장 매체에 금속 추가 및 바인딩 사이트6,41,42 금속의 전체 인을 요구 하는 amidohydrolase metalloenzymes와 같은 연구에 의해 영감을 ,43.
혐 기성 정화와 글러브 박스에서 농도 아마도이 프로토콜의 가장 중요 하 고 기술적으로 어려운 단계...

철 또는 산소를 활성화 하기 위하여 다른 금속을 사용 하는 효소 들은 정화 과정 동안 비활성화에 취약 그들의 제거 때문에 셀의 줄이는 환경에서. 따라서이 단백질, 세포 lysates로 사용 해야 외부 감소 시키는 대리인를 복종 될 또는 있도록 그들은 최적 효소 활동1,2,,34anaerobically 정화. 그 효소는 산소에 민감한 (특히 철 분 포함 된 효소), 혐 기성 상태를 유지 하면서 모든 정화 및 특성화 단계를 수행 완전히 그들을 특성화 하는 데 필요한입니다. 이 주도하 고 있다 결정학5,6,7,8 단백질 표정에서 배열 하는 연구에 대 한 혐 기성 챔버의 범위 내에서 전체 실험실 체제를 개발 하는 연구원 .
여기, 우리는 혐 기성 정화 및 효소는 산소 전극 시스템을 사용 하 여 DesB의 운동 특성에 대 한 방법을 보고 합니다. DesB은 Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 LigAB, 동일한 유기 체에서 protocatecuate dioxygenase 관련 된 박테리아에서 gallate dioxygenase입니다. 두 효소 유형 II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily 날짜9, 에어로빅 표준을 사용 하 여 정화 하는 때 비활성화에 취약 되 고이 superfamily의 효소 때문에 가능성이 광범위 하 게 공부 하지는에 속한다 단백질 정화 방법입니다. PCAD 효소의 일부 표시 기판 성행위 동안 다른 기판 전용2,10, 추가이 superfamily의 특이성 결정을 식별 하는 데 필요한입니다. 으로 여러 효소 superfamilies11,12,13,,1415에 관찰 되었습니다, 작은 분자 직접 경쟁 저해를 통해 활동 또는의 바인딩을 변경할 수 있습니다. 분자 효소 활동16감소 또는 증가 일으키는 allosteric 주머니를 분리. 속도 론 혼자는 변조기의 바인딩 위치를 차별화 수 없습니다, 하는 동안 활동 변화의 크기를 결정 하는 것이 효과 이해 중요 합니다. 기본 DesB 활동과 4-nitrocatechol (4NC), 일반적으로 특성 및 dioxygenase 효소2,17, 를 억제 하는 데 사용 하는 화합물의 존재 그것의 활동의 운동 특성, 방법 18, 표시 됩니다.
DesB는 gallate, 리그 닌 파생 향기로운 화합물, 어떤 반지 여 기판10,19의 하나로 산소를 사용 하 여 촉매는 extradiol dioxygenase (에) 반응을 통해 무 너 뜨 리 수 있다. 이 효소 반응은 식물의 세포 벽에서 발견 한 향기로운 heteropolymer 리그 닌의 붕괴의 컨텍스트 내에서 발생 합니다. 리그 닌을 depolymerized 수 있습니다, 그리고 다양 한 방향족 화합물을 저조한 세분화 될 수 있습니다 추가 중앙 대사3,20,,2122,23,24에 ,25,26,,2728,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (에) 촉매 dihydroxylated 방향족 화합물, 금속 조정 diol;에 인접 한 분열이 발생에 반응 열 반지 대조적으로, intradiol dioxygenases 쪼개 두 개의 수 산 기 그룹 (그림 1) 간의 유사한 향기로운 화합물. 다른 많은 metalloenzymes 같은 EDOs 2 히스티딘, 1-카복실산 깡패9,,3435의 구성 조정 Fe(II) divalent 금속 센터가 있다. 이 metalloenzymes 될 산화, autoxidation 또는 비활성화 메커니즘에 기초를 둔 반면 효소 비활성2,36,,3738렌더링 됩니다.
이 원고에서 설명 하는 실험 절차에 우리 DesB, 박테리아 Sphingobium sp. SYK-6, gallate (그림 2A)의 c 4-c 5 본드에 걸쳐 산소의 추가 촉매 하에서 PCAD superfamily의 구성원을 사용 합니다. 이 분열의 regiochemistry는 유사한 LigAB, protocatechuate-4, 5-dioxygenase (그림 2B). 지금까지,이 gallate dioxygenase의 조사 DesB10,,1939을 억제 하는 화합물의 보고를 포함 한다. 호 기성 정화 방법의 사용으로 DesB 전시 변수 활동, 혐 기성 방법의 사용으로 일관 되 게 재현할 수 활동 단백질을 얻을 수 있었습니다. 여기에 설명 된 운동 연구 DesB, gallate와 DesB의 반응과 4-nitrocatechol (4NC)에 의해 DesB의 억제의 운동 특성의 혐 기성 정화에 대 한 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노디즈</td><td>골드 바이오 테크놀로지</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'tetramethyl-ethylenediamine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>아밀로스 수지 고유량</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 유능한 대장균 세포</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>시그마 알드리치</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>갈산</td><td>, 시그마 알드리치</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-니트로카테콜</td><td>시그마 알드리치</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>철 황산 암모늄</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 디티 오 나이트</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>wheaton 혈청 병</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25mm Acrodisc PF 주사기 필터 (Supor Membrane</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Amicon 교반 세포 농축기</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76mm Millipore Ultracel 10kDa 컷오프 재조정 셀룰로오스 멤브레인 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 Coarse desalting gal column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2mL 크림프 탑 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus 전극 제어 장치</td><td>Hansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>산소 일렉트로드 챔버</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>전극 디스크</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m 릴</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>전극 청소 키트</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>스페이서 종이</td><td>지그재그</td><td>모든 주유소</td><td></td>에서 사용 가능</tr><tr><td>He-series Dri-Lab 글러브 박스</td><td>진공/대기 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>진공/대기 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>양면 마이크로 테이퍼 스테인리스 스틸 주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &뮤; L, 모델 701 N SYR, 시멘트 NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 고압 균질화</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자위의 리소자임</td><td>시그마 알드리치</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마 알드리치</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>나트륨피셔 사이언티픽</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>피셔 사이언티픽 P217-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>트리스 하이드로 클로라이드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>말토스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

혐 기성 단백질 정화 및 desb dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

산소에 민감한 단백질, 그 효소를 활용 한 기질으로 산소를 포함 하 여 전통적인 호 기성 정화 방법을 사용 하 여 정화 하는 때 안정성을 줄일 수 있습니다. 이 원고에서는 장갑 상자에 담 론 전에 단백질의 버퍼 및 시 약, 열 착 색 인쇄기에 대 한 방법의 준비를 포함 하 여 혐 기성 정화 과정에 관련 된 기술적인 세부 사항을 보여 줍니다. 또한 준비 하 고 산소를 이용 하는 효소의 활동적인 특성화를 수행 하는 산소 전극 사용 방법이 있습니다. 이 메서드는 DesB, Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 박테리아에서 gallate dioxygenase dioxygenase 효소를 사용 하 여 그림.

표시 된 개별 분수 정화 DesB-맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 퓨전 구문 (그림 3)에서 SDS 페이지 젤 분석이 이다. 젤 밝혀 단백질 순수 (MW = 91.22 kDa), DesB의 존재를 제외한 (MW = 49.22 kDa) MBP 단백질 도메인 (42 kDa) 서로 죽 습. 분수 E2 및 e 3은 농도 (4.2 단계)에 대 한 선정 됐다.
DesB 운동 분석 실험에서 재현성 결과 올바른 어셈블리, 교정, 및 실험 기법에 따라 달라 집니다. 그것은 정확한 온도 압력, 입력 하는 데 필요한 이러한 변수 분석 결과 (그림 4A) 동안 솔루션에 녹아 있을 것으로 예상 하는 O2 의 비율을 결정. 초기 신호 1800 및 2000 nm...

여기 우리는 혐 기성 단백질 정화, 혐 기성 단백질 농도, 그리고 산소 전극 시스템을 사용 하 여 후속 운동 특성에 대 한 프로토콜을 제시. DesB, 더 안정적이 고 적극적인 정화 하 고 혐 기성 환경에서 저장 한 dioxygenase 효소 효소를 사용 하 여 메서드를 보여 줍니다.

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

이 방법은 산소에 민감한 금속을 포함하는 단백질에서 효소 활동을 유지하는 방법에 대한 분야 무기 생화학의 주요 질문에 대답하도록 설계되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질의 금속을 감소 상태로 유지할 수 있는 방법을 시각화하는 데 도움이 된다는 것입니다. 일반적으로, 이 기술에 새로운 개별은 완전히 혐기성되기 위하여 재료 및 시약을 유지하기 어렵기 때문에 투쟁할 것입니다.단백질 발현을 유도한 후 24시간 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 1.5리터당 아밀로오스 컬럼 버퍼20밀리리터로 세균세포 펠릿을 재연한다. 세포 현탁액에 리소지메 1밀리그램을 넣고 얼음 에 20 분 동안 세포를 저어줍니다. 인큐베이션이 끝나면 약 15, 000 psi에서 3~5번의 통과로 고압 균질화를 통해 재중단된 세포 용액을 lyse시키고 단백질을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 전달한다.헤드스페이스를 질소로 1분간 플러시하고, 세포 용해를 원심분리하여 불용성 이물질을 제거합니다. 상체를 적어도 하나의 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 고무 중격으로 용액을 캡. 20 게이지 바늘을 사용하여 용액을 통해 질소 가스를 천천히 거품하여 산소를 대체합니다.그런 다음, 파라핀 필름으로 중격을 감싸고, 파라막을 구리 와이어로 고정하고, 상체를 기둥 재료로 장갑 상자에 넣습니다. 용매가 수지 침대 바로 위에 있을 때, 이전에 준비된 아밀로오스 컬럼에서 50밀리리터의 단백질 상부체를 컬럼에 적재하여 분당 약 5밀리리터에서 적당히 가압된 질소 하에서 5밀리리터 분획으로 유동을 수집한다. 모든 흐름 스루가 용출되면 열을 아밀로스 컬럼 버퍼의 또 다른 세 열 볼륨으로 세척합니다.용출 버퍼의 다섯 CV를 추가 한 다음 적당히 가압 된 질소에서 유리 테스트 튜브에서 3 밀리리터 분획을 수동으로 수집합니다. 철암모늄 황산염 및 디티오스레이톨로 산소 존재용 솔루션을 테스트합니다. 산소가 존재하는 경우 용액은 어두운 파란색 또는 검은 색으로 바뀝니다, 오른쪽에있는 튜브처럼.산소의 존재는 낮은 촉매 활성정제 단백질귀착될 것이다. 산소가 최소한의 용액은 왼쪽의 튜브와 같이 라벤더 또는 밝은 파란색 반투명 색상이 될 것입니다. 다음으로, 외부 질소 라인을 사용하여 교반 된 세포 챔버를 가압하고 단백질을 적당한 교반 속도로 2 번 50 밀리리터에 농축합니다.이어서, 단백질을 10 밀리리터에 농축하고, 0.45 마이크로미터-공공 주사기 필터를 통해 농축 단백질을 걸러내는다. Aliquot 150 마이크로리터 의 단백질은 개별 200 마이크로 리터 폴리머 라제 연쇄 반응 튜브로. 그런 다음 장갑 상자에서 덮인 알리쿼트를 제거하여 액체 질소로 즉시 플래시 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.DesB 탈염의 경우 먼저 9밀리리터 보로실리케이트 컬럼에 세 밀리리터 의 세 밀리리터를 추가하고 두 개의 열 량의 탈염 버퍼로 컬럼을 세척합니다. DesB가 해동되면 중력 제어 과정을 통해 정제된 단백질을 컬럼에 적재하고, 약 5밀리리터의 탈염 완충제와 함께 12개의 바이알에 3방울의 단백질을 희석하기 전에 흐름을 폐기한다. 산소 전극을 준비하려면 가위를 사용하여 약 1.5 인치 평방 피트의 스페이서 용지를 자르고 작은 삼각형을 사각형의 각 면에 자르고 모서리에 슬릿을 사용하여 전극의 래핑을 돕습니다.50% 칼륨 염화칼륨 용액을 전극의 실버 양극 홈에 넣고 방울을 연결하여 연속적인 용액 고리를 형성합니다. 염화물 칼륨 용액 2방울을 백금 전극 위에 넣고, 스페이서 용지를 백금 전극 위에 조심스럽게 놓고 스페이서 용지를 부드럽게 하여 기포가 없도록 합니다. 약 2인치 길이의 S4 30m PTFE 멤브레인을 자르고 스페이서 용지 위에 놓고 멤브레인의 가장자리를 제거하여 전극의 외부 링과 정렬합니다.O-링 어플리케이터를 사용하여, 전극에 스페이서 종이와 멤브레인을 고정하기 위해 전극 위에 작은 O-링을 밀어, 전극의 원형 홈에 더 큰 O-링을 배치, 아래에 멤브레인이 없다는 것을 주의. 전극의 상단 챔버를 베이스에 밀어 넣고 두 조각을 함께 나사로 연결합니다. 조립된 전극을 베이스에 놓고 전극을 모니터링 시스템에 연결합니다.효소 반응의 속도를 결정하려면 컴퓨터 통합과 함께 산소에 민감한 클라크 형 전극을 사용하여 전극 제어 장치를 통해 산소 소비를 측정하십시오. 전극 챔버에 적절한 기판 부피에 Tris 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 10 초 동안 용액을 저어줍니다. 10초 후 플런저로 챔버를 천천히 밀봉하고 상단을 아래로 나사로 연결합니다.깨끗한 조직을 사용하여 챔버에서 변위되는 과잉 액체를 흡수하고, 전극이 용액에서 산소 농도의 안정적인 측정을 생성할 수 있는 위치를 상화할 수 있도록 1분 이상. 다음으로, 가스가 단단한 10마이크로리터 주사기를 사용하여 플런저를 통해 전극 챔버에 약 1마이크로리터의 효소를 추가하고 속도 데이터를 수집한다. 주어진 기판 농도에 대한 모든 속도가 수집되면, 측면 팔 진공 플라스크에 연결된 플라스틱 튜브를 사용하여 전극 챔버를 비우고, 물로 4 ~ 6 사이클 동안 챔버를 반복적으로 헹구십시오.그런 다음, 새로운 기판 농도를 사용하여 방금 입증된 대로 전극에 용액을 설정합니다. SDS-PAGE 젤 분석은 DesB-maltose 결합 단백질 융합 구조에서 개별 분획의 분석은 서로 갈라진 DesB 및 말토세 결합 단백질 도메인 제품의 존재를 제외하고 순수한 단백질 제품의 분리를 드러낸다. 일단 모든 운동 측정이 취해지면, 갈레이트를 갖는 DesB의 활성은, 예를 들어, 다양한 갈레이트 농도에서 산소 소비속도를 측정하여 얻을 수 있다.반대로, 4니트로카테콜을 가진 DesB의 억제속도는 4니트로카테콜의 다양한 농도가 존재하여 1밀리알라갈레이트로 데스B의 산소 소비율 감소를 관찰함으로써 결정될 수 있으며, 예를 들어, 4니트트로카테콜은 산소소비를 억제하고 그에 의해 DesB 반응을 나타낸다. 이 방법은 철의존 디산소 효소를 연구하는 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 금속 로엔자임과 같은 다른 시스템에 적용 될 수 있습니다. 글러브 박스 안에서 일하는 것이 어려울 수 있으므로 이 기술을 수행하는 동안 서두르지 않도록 주의하십시오.

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