Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

이 결합된 마스터는 정자 성숙 및 저장 조절에 관여하는 단백질 표적과 같은 부고환 연구 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 부고환 분리 기술의 주요 장점은 다른 종 사이의 표피의 다른 영역에서 유사한 개체군을 격리하는 데에도 적용 가능하다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 부고환 파라핀 절편을 흄 후드로 옮기십시오.

조직 부분이 완전히 잠길 수 있도록 슬라이드 용기에 충분한 자일렌을 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제수에 희석된 등급이 매겨진 에티놀 용액에 조직 절편을 담궈 재수화합니다. 전체 조직 섹션이 완전히 잠길 수 있도록 충분한 PBS로 슬라이드 용기에 있는 섹션을 5분 동안 세척합니다.

다음으로, 적절한 항원 회수 용액을 슬라이드 랙에 디캔팅합니다. 용액이 끓을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 슬라이드를 용액에 완전히 담그고 조직 절편에 열 유도 항원 회수 용액을 적용합니다.

그런 다음 전자레인지에서 슬라이드 용기를 제거하고 실온으로 식히십시오. PBS가 들어 있는 병에 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다. 발수 슬라이드 마커 펜을 사용하여 조직 부분을 추적합니다.

슬라이드를 가습 용기로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 차단 용액을 바릅니다. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 한 번 헹굽니다.

적으로 최적화된 농도로 희석된 적절한 1차 항체를 섭씨 4도에서 여과된 1%BSA PBS로 하룻밤 동안 배양합니다. 슬라이드를 실온으로 다시 데운 후 60RPM의 진탕 플랫폼에서 PBS로 슬라이드를 10분 동안 세척합니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.

여과된 1%BSA PBS에 희석된 적절한 2차 항체로 섭씨 37도에서 1시간 동안 절편을 배양합니다. 여기서부터는 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오. 60RPM의 진탕 플랫폼에서 PBS로 슬라이드를 세척당 10분 동안 세 번 세척합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 염색, 장착 및 밀봉합니다. 성체 쥐를 안락사시킨 직후, 부고환 조직의 혈액 오염을 최소화하기 위해 섭씨 37도로 예열된 PBS로 혈관 구조를 풍부하게 합니다. 부고환을 겹쳐서 지방과 결합 조직이 없는 상태로 조심스럽게 해부하고 변형된 BWW 배지로 헹구어 표면 혈액 오염 가능성을 줄입니다.

부고환 조직을 블롯핑하여 과도한 배지를 제거하고 caput 부고환을 절개합니다. 그런 다음 절개된 caput 부고환을 BWW 배지가 포함된 새로운 페트리 접시로 옮기고 배지의 양이 최종 회수에 충분한지 확인합니다. 면도날을 사용하여 카푸트 조직을 여러 번 작게 절개합니다.

티슈를 다지지 마십시오. 섭씨 37도에서 30분 동안 약한 교반으로 배양하여 발광 내용물을 방출합니다. 70마이크로미터 멤브레인을 사용하여 생성된 현탁액을 여과하고 세포 파편을 제거합니다.

현탁액을 수집하여 섭씨 4도에서 연속적인 원심분리 단계를 거쳐 세포 파편을 제거하기 위해 속도를 높입니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 불연속적인 요오딕산올 그래디언트를 준비합니다. 450마이크로리터의 각 분획을 사용하여 초원심분리기 튜브에서 그래디언트를 준비합니다.

각 분획이 적용된 후 그래디언트를 육안으로 검사하여 각 레이어 사이에 계면이 성공적으로 형성되었는지 확인합니다. 단일 구배 위에 450마이크로리터의 부고환 루미날 유체 현탁액을 조심스럽게 추가합니다. 18 시간 동안 160, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에서 구배를 초원심 분리합니다.

원심분리된 그래디언트에서 가장 위쪽 레이어에서 시작하여 그래디언트의 맨 아래로 진행하면서 12개의 동일한 분수를 부드럽게 제거합니다. 해당되는 경우 각 그래디언트에서 복구된 등가 분수를 풀링합니다. 분획 9에서 11까지 회수되어 풀링된 후 2ml의 PBS로 희석합니다.

초원심분리기 100, 000배 g 및 3시간 동안 섭씨 4도에서 부고환을 펠릿화합니다. 그런 다음 조심스럽게 흡인하고 상등액을 버리고 부고환 펠릿을 방해하지 않도록 하십시오. 다운스트림 적용 전에 부고환의 순도를 평가하는 것이 중요합니다.

멸균 커버슬립을 준비한 후, 커버슬립을 포함하는 12개의 웰 플레이트의 각 웰에 200, 000 mEcap 18개의 세포의 통로 분취액을 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 배양합니다. 세포가 커버슬립에 부착되면 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.

커버슬립 전체를 잠글 수 있도록 충분한 양의 파라포름알데히드를 넣고 셀을 실온에서 15분 동안 고정합니다. 그런 다음 파라포름알데히드 용액을 버리고 PBS에서 커버슬립을 두 번 헹굽니다. 헹궈낸 커버슬립을 PBS의 0.1 Triton X-100에 10분 동안 담궈 세포를 투과화합니다.

헹굼, 차단 및 면역 라벨을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 합니다. 먼저, mEcap 18 세포의 계대 분취액을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 6웰 플레이트로 이동합니다. 일단 부착되면 FBS가 없는 mEcap 18 세포 배지로 세포를 세 번 세척하여 잔류 FBS 및 관련 단백질 오염 물질을 제거합니다.

그런 다음 1.5ml의 FBS가 없는 mEcap 18 세포 배지를 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%CO2의 분위기에서 12시간 동안 배양합니다. 그 후, 세포 배지를 수집하고 2, 000 회 g에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용하여 모든 세포 파편을 제거합니다.

표준 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 mEcap 세포 생존율을 평가합니다. 80% 부피의 컨디션 세포 배지에 20% 부피의 냉각된 100% 트리클로로아세트산을 추가하여 배양된 mEcap 18 세포에서 방출된 단백질을 침전시킵니다. 섭씨 4도에서 밤새 지속적으로 혼합하여 배양합니다.

다음으로, 17, 000 번 g과 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리기. 상등액을 버리고 단백질 펠릿을 식힌 아세톤으로 두 번 씻습니다. 그런 다음 17, 000 회 g 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 다시 원심 분리기를 사용하십시오.

상등액을 조심스럽게 제거하고 다시 한 번 버립니다. 그런 다음 흄 후드의 샘플을 자연 건조하여 잔류 아세톤을 제거합니다. 조사된 각 DNMI 동형은 뚜렷한 면역형광 국소화 프로파일을 나타냅니다.

DNMI는 초기 분절 및 caput 부고환 전체에 걸쳐 부고환 세포의 상대적으로 완만한 확산 표지가 특징입니다. DNM2 동형은 인접한 다운스트림 caput 분절 내의 세포에서 초핵 도메인으로 재배치되기 전에 초기 분절에서 세포의 반대쪽 기저 및 정점 경계 부근에서 먼저 검출됩니다. 이 표지의 강도는 caput 부고환의 2구역과 5구역 사이에서 점차 감소하며, 이는 본질적으로 이러한 부고환 분절의 분비 활동을 반영합니다.

DNM2의 초핵 표지는 이후에 caput 주요 세포 내 골지체의 분포와 일치하는 것으로 보입니다. DNM3 동형은 주로 소수의 caput 상피 세포의 정점 도메인에서 검출되며, 이는 인식된 투명 세포 마커 ATP6V1B1와 공동 표지하여 투명 세포 하위 집단에 해당하는 것으로 보입니다. 다음으로, 불멸화된 mEcap 18 세포주를 부고환 세포의 분비 활성을 연구하기 위한 체외 모델로 활용됩니다.

분포 패턴은 mEcap 18 세포의 세포질 전체에서 DNM1이 검출되고, DNM2는 이러한 세포의 핵상 내에 집중되며, DNM3는 작은 하위 집단 수 내에서 막 염색의 개별 초점이 특징인 caput 부고환 조직 절편에서 볼 수 있는 것과 일치하는 것으로 보입니다. 면역형광 검출을 시도하는 동안 각 항원의 조건을 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 부고환 영역 집단의 분리는 파일링 분석에 따라 정자 및 ocalgo와의 공동 배양을 포함한 다운스트림 응용 분야에서 쉽게 사용할 수 있으며, 둘 다 부고환 정자 성숙을 조절하는 부고환의 역할에 대한 이해를 향상시키는 강력한 접근 방식입니다.