Name: Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 생식생물학 연구를 위한 부고환 단백질 합성 및 분비 분석 방법을 마우스 조직과 세포주를 활용하여. 이 기술은 정자 성숙 메커니즘 이해에 필수적인 단백질 검출 및 분리 프로토콜을 제공합니다.

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저자가이 작업의 지원에 대 한 국민 건강 및 의료 연구 위원회의 오스트레일리아 프로젝트 그랜트 APP1103176를 인정 하 고 싶습니다.

동물 조직 컬렉션을 포함 하는 모든 실험 절차는 뉴캐슬 대학 동물 관리 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 면역 형광 염색 파라핀 끼워 넣어진 Epididymal 섹션 (그림 1 및 2)의
<ol><li>CO2 흡입 (스위스 쥐, 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사, 직후에 신중 하 게 (를 사용 하 여 수술가 위, 핀셋) epididymis 해 부의 결합 조직 및 지방 overlying 자유롭고 Bouin의 정착 액에 젖어 솔루션 (> 10 배 볼륨/조직 무게) 야간 고정을 위한.</li>
	<li>2 일 동안 매일 2 × 변화 70% 에탄올과 조직을 세척 하 고 탈수 등급된 에탄올 (70%, 95% 및 100%)를 통해 침투 하 고 파라핀 블록으로 삽입에 대 한 준비.</li>
	<li>섹션 4-6 µ m 및 면역 형광 염색을 위한 준비에서 슬라이드에 한 두께에 파라핀 블록.</li>
	<li>증기 두건에서 epididymal 파라핀 섹션을 완전히 조직 섹션 (3 × 5 분 각 시간) 담가 슬라이드 항아리에 크 실 렌의 충분 한 금액을 추가 하 여 dewax.</li>
	<li>순화 된 H2O 희석 등급된 에탄올 솔루션에 침수에 의해 조직 단면도 rehydrate (100% 에탄올 5 분, 100% 에탄올 5 분, 1 분, 80% 에탄올 1 분, 70% 에탄올 90% 에탄올 1 분, 그리고 50% 에탄올 1 분).</li>
	<li>슬라이드 단지 충분 한 버퍼링 인산 염 분 완전히 몰입할 전체 조직 섹션 (PBS)와 5 분 동안 한 번에 섹션을 세척 (모든 후속 세척에 대 한 이러한 지침을 따르십시오).</li>
	<li>적절 한 항 원 검색 솔루션을 가만히 따르다 (즉., 10 mmol/L 나트륨 시트르산, 50 mmol/L 트리 스 pH 10.5 또는 다른 항 원 검색 솔루션, 검색 항 원에 따라) 슬라이드 랙 및 끓는까지 마이크로파에. 이 솔루션으로 슬라이드를 담가 그리고 열 유발 항 원 검색 조건 ( 표 1참조) 개별 항 체에 대 한 최적화 된 조직 단면도 주제. 주의: 슬라이드 antigen 검색 과정에서 항 원 검색 솔루션에 완전히 몰입 하 확인 하십시오.</li>
	<li>실내 온도에 전자 레인지와 멋진 슬라이드 컨테이너를 제거 합니다.</li>
	<li>PBS와 슬라이드를 헹 구 고 추적에 액체 방수 제 슬라이드 마커 펜을 사용 하 여 조직 섹션 주위.</li>
	<li>(컨테이너의 기지에서 moistened 조직에 의해 생성), 습도 컨테이너에 슬라이드를 놓고 차단 솔루션 적용 (3 %BSA / PBS, 이전 필터링 0.45 μ m 필터를 통해) 37 ° c.에 1 시간에 대 한</li>
	<li>PBS 한번 슬라이드 린스.</li>
	<li>필터링 된 1%에서 실험적으로 최적화 된 농도를 희석 하는 적절 한 기본 항 체와 섹션을 품 어 하룻밤에 4 ° C에서 BSA/PBS (1:60 안티-DNM1, DNM2 및 DNM3에 대 한 항 체, 안티-ATP6V1B1 항 체에 대 한 1: 100 테이블의 자료를 참조 항 체 세부 사항을 위해). 참고: 구별을 일반적인 항 체 바인딩에서 특정 그것은 엄격한 네거티브를 포함 하는 데 필요한 (즉., 이차 항 체만, 1 차 항 체 펩 티 드 면역에 대 한 preabsorbed)와 긍정적인 컨트롤24.</li>
	<li>30 분 동안 실내 온도에 배치 하 여 슬라이드를 rewarm.</li>
	<li>씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.</li>
	<li>1%에 희석 적절 한 이차 항 체와 섹션을 품 어 BSA/PBS (0.45 μ m 필터를 통해 필터링) 1 시간 동안 37 ° C에서 (1:400 희석 모든 이차 항 체에 대 한 항 체 세부 정보에 대 한 재료의 표 참조). 주의:이 단계 이후부터 어둠 속에서 슬라이드 컨테이너를 유지. 듀얼 라벨에 대 한 2 차 항 체의 호환 조합을 선택 (즉., 2 차 항 체 종에서 제기 되었습니다 해야 합니다).</li>
	<li>씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.</li>
	<li>Propidium 요오드 화물 (PI, 7.48 μmol/L) 또는 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) 세포 핵을 실 온에서 2 분에 대 한 섹션 counterstain</li>
	<li>5 분 동안 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 두 번 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>10 %4-88 Mowiol 0.2 mol/L 트리 (pH 8.5)에 30% 글리세롤의 솔루션에 준비 섹션을 탑재 및 2.5 %1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-옥 탄.</li>
	<li>손톱 광택 coverslip 봉인 하 고 미래 관측을 위해 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다. 주의: 그것은 이미징 슬라이드의 즉시 실용적인 형광의 과도 한 손실을 방지 하기 위해 준비 후 수행 하 고 좋습니다.</li>
</ol>2 절연 마우스 Caput Epididymis (그림 3)에서 Epididymosomes의
<ol><li>CO2 흡입 (스위스 쥐 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사 후 즉시 (미리 예 열 37 ° C에) epididymal 조직의 혈액 오염을 최소화 하기 위해 PBS를 가진 그들의 맥 관 구조를 perfuse. 주의: 혈장 epididymosomes25비슷한 크기의 exosomes의 다양 한 인구를 포함 합니다. Epididymal 조직에서 혈액 클리어런스의 효능을 액세스할 수 있는 초기 세그먼트의 검사를 통해 매우 vascularized epididymal 세그먼트 caput 세그먼트에 인접 위치 (즉,., 그림 1A에서 1 영역)</li>
	<li>조심 스럽게 표면에 대 한 가능성을 줄이기 위해 overlying 및 결합 조직, 지방과 린스 수정 Biggers, Whitten, 및 Whittingham 매체 (BWW; pH 7.4, 300 mmol/kg 물26,27의 osmolality) 무료로 epididymis 해 부 혈액 오염입니다.</li>
	<li>오 점 제거 초과 미디어, 해 부 caput epididymis epididymal 조직 (즉., 2-5에서 그림 1A지역) BWW 매체를 포함 하는 신선한 페 트리 접시 (35 × 10 m m)에 전송. 매체의 양은 최종 복구에 대 한 충분 한 인지 확인 합니다. 참고: 6 caput epididymides, 그것 것이 좋습니다 ~ 900 µ L 넣고 균일 하 게 분할 (단계 2.9 참조) 2 미리 준비 된 기온 변화도의 위에 적용의 복구에 대 한 허용 하는 매체의 1.1 mL를 사용 하.</li>
	<li>면도날으로 caput 조직으로 작은 incisions의 번호를 확인 합니다. 조직 말하다 하지 고 따라서 과도 한 cytosolic 내용으로 샘플을 오염 하지 마십시오. Luminal 내용을 공개 30 분 동안 37 ° C에서 온화한 동요와 조직을 포함 하는 접시를 품 어.</li>
	<li>세포질 파편을 제거 하려면 70 µ m 세포 막을 통해 결과 정지를 필터링 합니다.</li>
	<li>filtrate 수집 및 세포질 파편을 제거 하기 위하여 속도 증가 함께 4 ° C에서 연속 원심 분리 단계에이 대상 (즉,., 500 × g, 2000 × g, 4000 × g, 8000 × g, 5 분 각; 17000 × g 20 분, 그리고 마지막으로 17000 × g 추가로 10 분 또는 아무 펠 릿은 원심 분리 후 형성 될 때까지). 주의: 그것은 최소한의 혈액 오염 존재가 되도록 초기 500 × g 원심 분리 단계 후 펠 릿의 색상을 평가 하는 것이 중요. 이 펠 릿 핑크 채색을 표시 하는 모든 샘플을 삭제 합니다.</li>
	<li>0.25 mol/L 자당 및 10 mmol/L 트리 (pH 7.5)의 솔루션 (60% (w/v) 수성 iodixanol 함유) 밀도 그라데이션 매체를 diluting 하 여 불연속 iodixanol 그라데이션 (구성 된 40%, 20%, 10%, 5% 레이어)를 준비 합니다.</li>
	<li>450 µ L (그림 3)의 각 일부와 ultracentrifuge 튜브 (11 × 35 m m), 그라디언트를 준비 합니다. 시각 인터페이스는 성공적으로 epididymal 액체 샘플을 로드 하기 전에 각 계층 사이 형성 되도록 각 분수의 신청 후 그라디언트를 검사 합니다. 그러나 각 그라데이션 신선한 사용, 당일 준비, epididymal luminal 액체 샘플 로드 전에 최대 2 h 4 ° C에서 보존 될 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 epididymal luminal 유체 (3 epididymides caput에서 수집 된 자료에 해당) 꼭대기의 중단 한 그라데이션의 450 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Ultracentrifuge 18 h 4 ° C에서 160000 × g 에서 그라디언트. 주의:이 원심 분리는 매우 높은 속도에서 실시 하 고, 이후 모든 ultracentrifuge 튜브 한 쌍이 고 정확 하 게 균형 있습니다. 그들은 그들의 무결성을 손상 시킬 수 있는 어떤 보이는 손상을 무료 수 있도록 튜브를 확인 하십시오.</li>
	<li>(각각 185 µ L의 구성 된) 12 동등한 분수 제거 최상위 계층에서 시작 하 고 그라데이션의 하단 쪽으로 진행. 등가 분수는 해당 하는 경우 각 그라데이션에서 복구 (최대 2 개의 그라디언트) 수영장. 주: epididymosomes는 가장 높은 분수 9-1122, 농축 마우스 그림 4 와 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>복구 및 분수 9-11의 풀링 후 PBS, 그리고 ultracentrifuge의 2 개 mL로 희석 100000 × g h 3 4 ° C에서 (13 × 56 m m 튜브)를 작은 공의 epididymosomes에서 샘플. 주의: epididymosome 펠 릿 볼 하기가 어려울 수 있습니다, 이후 그들은 회전자에 배치 하 고 튜브를 epididymosome 펠 릿의 기대 위치를 나타내는 표시는 튜브의 방향을 지적 했다 확인 하십시오. 각 튜브에 충분 한 볼륨 포함 되어 있는지 확인 (즉., 전체 용량의 50% 초과) 배제 관 붕괴의 위험에.</li>
	<li>신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 epididymosome 펠 렛을 방해 하지 않고 무시.</li>
	<li>Epididymosome 순도 (그림 4)를 평가 합니다.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에 따라 원하는 매체로 epididymosome 펠 릿을 resuspend. 예를 들어, BWW 매체 공동 보육 정 충 또는 양자 택일로 SDS-PAGE를 통해 epididymal 프로테옴의 해상도 대 한 준비에 적절 한 세포의 용 해 버퍼와 관련 된 실험에 대 한 일반적으로 사용 됩니다.</li>
</ol>3. 면역 형광 mECap18 세포의 얼룩
<ol><li>(셀 문화 후드에서 실시)을 살 균 coverslips의 준비<ol>
<li>에탄올 램프 위의 높은 온도에서 건조 하 여 소독와 10 분 동안 70% 에탄올에 coverslips (12 × 12 mm)을 담근 다.</li>
		<li>10 coverslip 쿨 s 12 잘 접시에 전송 하기 전에.</li>
		<li>하는 coverslip 커버 하 고 실 온에서 10 분 동안 정착 멸 균 폴 리-L-리 신 솔루션을 적용 합니다.</li>
		<li>폴 리-L-리 신 솔루션을 삭제 하 고 살 균 H2O coverslip 린스 또는 적절 한 매체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비 mECap18 셀<ol>
<li>포함 하는 coverslips 12 잘 플레이트의 각 음에 2 × 105 mECap18 셀의 aliquots 통로</li>
		<li>MECap18 셀 중간 (DMEM와 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 pyruvate, 1% 페니실린/스, 50l μmol 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 보충) 포함 10% 태아 종 아리 혈 청 (FBS) 분위기 5%에서 37 ° C 배양 기에서 셀 문화 CO2 하룻밤입니다.</li>
		<li>일단 세포는 coverslip 준수, 매체를 삭제 하 고 PBS로 두 번 셀 린스.</li>
		<li>충분 한 양의 4 %paraformaldehyde (PFA) 전체 coverslip 담가 15 분 동안 실 온에서 셀을 수정 하는 PBS에 희석을 추가 합니다.</li>
		<li>PFA 솔루션을 삭제 하 고 두 번 PBS에에서는 coverslips를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면역 형광 염색<ol>
<li>0.1%에 침수에 의해 mECap18 세포를 permeabilize 10 분에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>PBS 가진 coverslips 린스.</li>
		<li>3 %BSA mECap18 세포를 차단 하 고 immunolabeling epididymal 조직 섹션에 대 한 설명에 해당 프로토콜을 이용 하 여 세포의 진행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 조절된 세포 배양 매체에서 단백질의 격리
<ol><li>배양 조건된 셀의 컬렉션<ol>
<li>6의 각 음에 4 × 105 mECap18 셀의 통로 aliquots mECap18 셀 중간 10% 보충 잘 접시 FBS 24 h에 대 한.</li>
		<li>잔여 FBS 및 모든 관련 제거 하 mECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비)와 mECap18 셀 세 번 씻어 단백질 오염 물질.</li>
		<li>MECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비 하는)의 1.5 mL 각 잘 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5%에서 12 h에 대 한 mECap18 셀으로 품 어 CO2. 참고:이 단계에서 mECap18 셀 실험적인 디자인에 따라 다른 대상 항 원에 대 한 평가 될 수 있다.</li>
		<li>12 h 배양 후 셀 매체와 모든 세포 파편을 제거 하려면 10 분 2000 × g 에서 원심 분리기를 수집 합니다. 참고: 외피의 기간 및 적용된 여야 하 셀의 허용 오차를 고려 하 여 실험 디자인/끝점 평가 따라 변경 될 수 있다. 최적의 결과 달성을 보장 하기 위해 특정 실험적인 regimens에 따라 보육의 타이밍을 조정 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>표준 trypan 블루 제외 분석 결과28의 응용 프로그램을 통해 mECap18 세포 생존 능력을 평가 합니다. 세포 생존 능력 90% 죽 었 거 나 죽어가는 셀에서 발표 하는 단백질에 의해 소개 하는 바이어스를 제거 하기 위해 거절 했습니다 모든 자료를 삭제 합니다.</li>
		<li>다음과 같이 셀 중간에서 단백질을 분리 또는-80 ° c.에 매체를 보존</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 절연 (증기 두건에서 실시)<ol>
<li>80% 볼륨 조절된 세포 매체 교양된 mECap18 세포에서 발표 하는 단백질을 침전의 냉장된 100 %trichloroacetic 산 양의 20%를 추가 합니다. 지속적인 혼합으로 하룻밤 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>부 화 후 원심 분리 하 여 침전 된 단백질을 펠 렛 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C). 주: 매체에 분 비 될 것으로 예상 하는 단백질의 제한 된 수량에 따라 가능 하다는 펠 릿은 하지 쉽게 시각 수 원심 분리 후. 따라서 올바르게 이전에 원심 분리 관을 찾으시는 기대 펠 릿 위치는 상쾌한의 제거 하는 동안 방해을 않도록 주의 하는 것이 필수적 이다.</li>
		<li>상쾌한 무시 하 고 두 번 다시 원심 분리 전에 냉장된 아세톤으로 펠 릿을 세척 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C).</li>
		<li>조심 스럽게 제거 하 고 어떤 잔여 아세톤 증기 두건 내 공기 전에 상쾌한 삭제.</li>
		<li>끝점 분석 완전 분 비 단백질 프로 파일 및/또는 개별 대상 단백질을 검출 하기 위한 준비에 적절 한 추출 버퍼에 단백질 펠 릿 resuspend (예., immunoblotting SDS 페이지).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이러한 연구는 Bouin의 고정된 epididymal 조직 파라핀 포함 및 표준 단면 프로토콜을 받게 되었습니다 했다를 사용 하 여 통합. Bouin의 통 솔루션 각 구성 요소는 특정 하 고 상호 보완적인 기능을가지고 picric 산, 포 름 알 데히드, 초 산의 혼합물을 함유 한다. 따라서, 단백질 상호 링크를 기본 아민과 반응 하는 포름알데히드, picric 산 천천히 소금 형성 조직 침투 하 고 따라서 기본 단백질과 반대로, 초 산의 응고 빠르게 조직을 관통의 응고를 발생 핵 산입니다. 이러한 결합 된 속성 형태학 세부의 보존에 대 한 선택의 정착 액으로 Bouin의 engendered 있다 그리고 그것의 사용은 epididymal 문학에서 넓게 보고. 그러나, Bouin의 솔루션 수 있습니다 마스크 대상 항 통 유발된 형광 및 유발 하는 포름알데히드 cross-linking 성향 등의 제한 없이 하지 않습니다.
배경 형광에 대 한 잠재적인 필요로 엄격한 부정적인 컨트롤 사...

모든 포유류 종의 정 충 취득 표시 앞으로 진보적인 운동 잠재력 epididymis 수 남성 외 고환 덕트 시스템의 전문된 영역을 통해 그들의 장기 하강 동안 한 ovum를 기름 지 게 (종)에 따라 이동 7-14 일1. 아버지 chromatin의 극단적인 응축 및 testes에서 정 충의 cytodifferentiation와 함께 제공 되는 세포질의 대부분의 흘리기, 그들의 후속 기능 성숙의 상호 작용에 의해 독점적으로 구동 됩니다. 와 함께 epididymal microenvironment. 이 환경, 차례 차례로, 라이닝 epididymal 소마의 분 비 및 흡수 활동에 의해 만들어지고 세그먼트 세그먼트 변형1의 뛰어난 수준을 표시. 따라서, 단백질 합성 및 분 비 활동적인 세그먼트 epididymis (즉, 증 류 및 코 퍼스)2의 근 위 부분에 있는 있습니다. 이 활동 거울 기능 능력의 표시 셀 첫 처음으로 정 충의 기능 프로 파일 (즉,., 진보적인 운동 및 산 solubilized zona glycoproteins 바인딩할 수) 다음 그들의 caput epididymis3통로입니다. 이러한 기능적인 특성 정자 도달 원심 epididymal 세그먼트 (cauda), 어떤 점에서 그들은 사정에 대 한 준비에는 무부하 상태에 저장 됩니다로 서 최적의 수준에 도달 하기 전에 개발을 계속 합니다. 형성 및이 정자 저장 저수지의 유지 보수는 라이닝 상피는 cauda에서 강한 흡수 활동4,5에 의해 지배 되는에 또한 밀접 하 게 연관 됩니다. 비록 해부학 적 차이 보고6,7,8, 이러한 지역적인된 분업이 나타납니다 포유류 종의 대부분 공유 되 epididymis의 특성 날짜, 우리 자신의9,10를 포함 하 여 공부 했다. 실제로, 임상의 관점에서 그것은 알려져 그 epididymal 부전 남성 요인 불 임11, 따라서이 전문된 조직의 규칙을 이해의 중요성을 강조 표시의 병 인에 중요 한 기여를 하 게.
그것은 그러므로 유감 epididymal 생리학의 우리의 이해 및 정자 성숙 및이 조직 내에서 스토리지의 순차적 단계를 조절 하는 메커니즘 완전 해결 될 남아 있다. 기여 요인 들 중 epididymal 연구에서 제한 발전이 조직의 전반적인 복잡성과 규제 제어할 자사의 luminal microenvironment 메커니즘의 지식이 있습니다. 해부학, 우리는 caput, 코 퍼스 및 cauda 세그먼트의 구별을 넘어는 epididymis 여러 영역 (그림 1A)로 더 세분화 될 수 있습니다, 알고 각 septa12 으로 구분 하 고 개별 프로필 유전자/단백질의 특징 식13,14,15,,1617,18. 실제로, 상세한 transcriptional 프로 파일링에 epididymis 단편 유전자 발현의 기준으로 6 하 고 9 가지 epididymal 영역 각각19,20마우스와 쥐 모델에서 보고 되었습니다. 이러한 복잡성은 아마도 epididymal 소마, 수많은 다른 세포 유형; 구성 pseudostratified 상피의 구성 반영 각 관의 길이 따라 그들의 풍부, 유통 및 분 비 흡수 성 활동에 대해 서로 다른. 따라서, 주 세포는 지금까지 가장 풍부한 epididymal 셀 유형 구성 모든 상피 세포의 80% 이상. 따라서, 주 셀 epididymal 단백질 생 합성 및 분 비5의 대량에 대 한 책임이 있습니다. 대조적으로, epididymal 소마 내에서 두 번째로 가장 풍부한 셀 형식으로 순위, 명확한 세포 인구는 주로 luminal 구성 요소의 선택적 흡수와이 microenvironment5의 산성화에 참여. 복잡성의 또 다른 계층을 추가, androgens 및 다른 lumicrine 요인 고환 근원의 이러한 epididymal 종류의 세포는 따라 그들의 위치에 따라 각 차동 제어를 발휘 한다.
이러한 복잡성에 의해 부과 된 한계에도 불구 하 고 뜻깊은 침해 epididymal 함수의 기계적으로 해결로 만들 수 계속. 이러한 연구를 키 고급 질량 분석 전략의 응용 프로그램 이러한 초기 설문 조사 중에서 선택 하는 개별 단백질의 상세한 분석에 epididymal 프로테옴의 대규모 재고 설정 되었습니다. 이 방법의 그림은 마우스 모델21에 mechanoenzymes의 DNM 가족의 우리의 최근 특성화. DNM에 우리의 초기 관심 및 endocytotic 프로세스의 결합에서의 듀얼 액션에 의해 연료 했다. 이러한 관측에 건물, 우리 DNM (DNM1-DNM3)의 세 정식 isoforms 높은 마우스 epididymis 표현 되며 단백질 분 비 및 흡수21에서 규제 역할을 수행 하기 위해 적절 하 게 위치를 보여줄 수 있었다 . 또한, 우리 수 있었다 명확 하 게 그들의 세포질 부 세포 현지화 기준 각 DNM isoform를 차별화 하는 따라서 그들은 보완, epididymal 상피21내 중복 활동 반대로 소유 제안.
우리가 희망이 정보 대체 epididymal 단백질의 특성에서 광범위 한 응용 프로그램을 찾을 것입니다 및 따라서 기여할 마우스 epididymis DNM 식의 연구에 대 한 고용 실험 방법론을 설명 하는 여기, 우리의 남성 생식 관의이 중요 한 요소의 기능의 이해. 특히, 우리는 면역 형광 라벨 파라핀 끼워 넣어진 epididymal 섹션에서 대상 단백질과 면역 형광 검사를 통해 이러한 단백질의 공간 배급의 후속 검색에 대 한 강력한 방법론의 개발을 설명 현미경 검사 법입니다. 우리는 더 격리 및 epididymosomes;의 특성화에 대 한 우리의 최근 최적화 된 프로토콜22 문서 epididymal 분 비 프로필의 핵심 요소를 구성 하 고 정자 성숙23홍보에 저명한 역할을 표시 하는 작은 exosome 같은 소포 상호 보완적인 접근, 우리 또한 설명 하는 불멸 하 게 마우스 caput epididymal 상피 (mECap18) 셀 라인에서 대상 단백질의 면역 형광 탐지 및 epididymal의 규정을 탐험 하는 모델로이 리소스를 사용 하 여 분 비 활동 체 외

<table><tbody><tr><td>Dynamin 1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 2 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 3 항체</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>ATP6V1B1 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: 다클론</td></tr><tr><td>CD9 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td>Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal</td></tr><tr><td>Flotillin-1 항체</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: 다클론</td></tr><tr><td>ALOX15 항체</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>TUBB 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: 단클론</td></tr><tr><td>PSMD7 항체</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td>Host species: 당나귀, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>Host species: 당나귀, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td>Host species: 염소, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td>Host species: 염소, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Mouse HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>온도</td><td>조절기 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>온도</td><td>조절기 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&alpha;-androstan-17&beta;-ol-3-oneC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>온도</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 산 (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>아스트랄</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-디아자비시클로-(2.2.2)-옥탄</td><td>시그마</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-자이신</td><td>시그마</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>시그마</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>시그마</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (비닐 알코올)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 밀도 구배 중간</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>초소형 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>대형 오비탈 쉐이커</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>실험실 pH 측정기</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>발수 슬라이드 마커</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m 필터</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 먼지가 없는 종이</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 (2.2 ml, 11 &times; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 (3.2 ml, 13 &times; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &micro; m 나일론</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 35 &times; 10 mm 캠</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 항아리</td><td>TRAJAN</td> <td># 23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

포유류 epididymis 후 고환 성숙과 정 충의 저장소를 지원 하기 위해 모든 내 분 비 동맥의 가장 복잡 한 intraluminal 체액 중 하나를 생성 합니다. 이러한 복잡성 라이닝 상피 세포의 결합된 분 비 및 흡수 성 활동으로 인해 발생합니다. 여기, 우리 dynamin (DNM) mechanoenzymes;의 모델 단백질 가족에 초점을 맞춤 으로써 epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석을 위한 기법을 설명 양방향 멤브레인 밀매 이벤트 규제 가능성이 있는 큰 GTPases Epididymal 조직에서 단백질 식의 연구를 위해 우리는 면역 형광 라벨 파라핀 포함 섹션에서 대상 단백질과 통해이 단백질의 공간 배급의 후속 검색에 대 한 강력한 방법론을 설명 면역 형광 검사 현미경 검사 법입니다. 우리는 또한 격리 및 소포, 정자 세포를 성숙 세포 통신에 참여할 수 epididymal 루멘으로 은닉 되는 epididymosomes로 알려진 같은 exosome의 특성화에 대 한 최적화 된 방법론을 설명 합니다. 상호 보완적인 접근, 우리 또한 SV40 불후 마우스 caput epididymal 상피 (mECap18) 셀 라인에서 대상 단백질의 면역 형광 탐지 설명. 또한, 우리는 모델을 적합 한 생체 외에서 epididymal 분 비 활동의 규칙을 탐구 하는 mECap18 셀 라인의 유틸리티 설명. 이 목적을 위해 우리는 mECap18 세포 선 및 그들의 분 비 단백질 프로 파일에 영향을 미치는 수 있는 선택적 약리 억제 요법의 사용의 유지 보수에 대 한 자란 요구 사항을 설명 합니다. 후자는 쉽게 수확 바른된 문화 매체, trichloroacetic 산/아세톤 강 수를 통해 분 비 단백질의 농도 및 SDS 페이지 및 immunoblotting 통해 그들의 후속 분석을 통해 평가 합니다. 우리는이 결합 된 메서드는 정자 성숙 및 저장에서 그들의 기능적인 역할을 결정 하는 전주곡으로 대체 epididymal 단백질 목표의 분석에 적합 다 투 다.

그림 1 그리고 그림 2 마우스 caput epididymis DNM의 면역 형광 지역화의 대표적인 결과 보여줍니다. 각각 3 DNM isoforms의 디스플레이 별개 지역화 프로필 조사. 따라서, DNM1 (그림 2A) 초기 세그먼트 및 caput epididymis 걸쳐 epididymal 셀의 상대적으로 겸손 한 확산 라벨 특징 이다. 대조적으로, DNM2 isoform 처음 발견 되었다 초기 세그먼트에서 셀의 반대 기저와 꼭대기 테두리 주변 인접 한 다운스트림 caput 세그먼트 내의 셀에 supranuclear 도메인에 재배치 되 고 전에 (즉,., 지역 2-5) (그림 1B, C</stro...

여기, 우리 보고 dynamin 파라핀 끼워 넣어진 마우스 epididymal 섹션에 있는 단백질의 검출 및 불멸 하 게 epididymal 셀 라인 (mECap18)의 프로토콜을 설명 하기 위해의 면역 형광 지역화 합니다. 우리는 또한 epididymal 액체 및 조건된 셀 미디어에서 분 비 단백질의 격리에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

이 결합된 마스터는 정자 성숙 및 저장 조절에 관여하는 단백질 표적과 같은 부고환 연구 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 부고환 분리 기술의 주요 장점은 다른 종 사이의 표피의 다른 영역에서 유사한 개체군을 격리하는 데에도 적용 가능하다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 부고환 파라핀 절편을 흄 후드로 옮기십시오.조직 부분이 완전히 잠길 수 있도록 슬라이드 용기에 충분한 자일렌을 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제수에 희석된 등급이 매겨진 에티놀 용액에 조직 절편을 담궈 재수화합니다. 전체 조직 섹션이 완전히 잠길 수 있도록 충분한 PBS로 슬라이드 용기에 있는 섹션을 5분 동안 세척합니다.다음으로, 적절한 항원 회수 용액을 슬라이드 랙에 디캔팅합니다. 용액이 끓을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 슬라이드를 용액에 완전히 담그고 조직 절편에 열 유도 항원 회수 용액을 적용합니다.그런 다음 전자레인지에서 슬라이드 용기를 제거하고 실온으로 식히십시오. PBS가 들어 있는 병에 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다. 발수 슬라이드 마커 펜을 사용하여 조직 부분을 추적합니다.슬라이드를 가습 용기로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 차단 용액을 바릅니다. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 한 번 헹굽니다.실험적으로 최적화된 농도로 희석된 적절한 1차 항체를 섭씨 4도에서 여과된 1%BSA PBS로 하룻밤 동안 배양합니다. 슬라이드를 실온으로 다시 데운 후 60RPM의 진탕 플랫폼에서 PBS로 슬라이드를 10분 동안 세척합니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.여과된 1%BSA PBS에 희석된 적절한 2차 항체로 섭씨 37도에서 1시간 동안 절편을 배양합니다. 여기서부터는 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오. 60RPM의 진탕 플랫폼에서 PBS로 슬라이드를 세척당 10분 동안 세 번 세척합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 염색, 장착 및 밀봉합니다. 성체 쥐를 안락사시킨 직후, 부고환 조직의 혈액 오염을 최소화하기 위해 섭씨 37도로 예열된 PBS로 혈관 구조를 풍부하게 합니다. 부고환을 겹쳐서 지방과 결합 조직이 없는 상태로 조심스럽게 해부하고 변형된 BWW 배지로 헹구어 표면 혈액 오염 가능성을 줄입니다.부고환 조직을 블롯핑하여 과도한 배지를 제거하고 caput 부고환을 절개합니다. 그런 다음 절개된 caput 부고환을 BWW 배지가 포함된 새로운 페트리 접시로 옮기고 배지의 양이 최종 회수에 충분한지 확인합니다. 면도날을 사용하여 카푸트 조직을 여러 번 작게 절개합니다.티슈를 다지지 마십시오. 섭씨 37도에서 30분 동안 약한 교반으로 배양하여 발광 내용물을 방출합니다. 70마이크로미터 멤브레인을 사용하여 생성된 현탁액을 여과하고 세포 파편을 제거합니다.현탁액을 수집하여 섭씨 4도에서 연속적인 원심분리 단계를 거쳐 세포 파편을 제거하기 위해 속도를 높입니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 불연속적인 요오딕산올 그래디언트를 준비합니다. 450마이크로리터의 각 분획을 사용하여 초원심분리기 튜브에서 그래디언트를 준비합니다.각 분획이 적용된 후 그래디언트를 육안으로 검사하여 각 레이어 사이에 계면이 성공적으로 형성되었는지 확인합니다. 단일 구배 위에 450마이크로리터의 부고환 루미날 유체 현탁액을 조심스럽게 추가합니다. 18 시간 동안 160, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에서 구배를 초원심 분리합니다.원심분리된 그래디언트에서 가장 위쪽 레이어에서 시작하여 그래디언트의 맨 아래로 진행하면서 12개의 동일한 분수를 부드럽게 제거합니다. 해당되는 경우 각 그래디언트에서 복구된 등가 분수를 풀링합니다. 분획 9에서 11까지 회수되어 풀링된 후 2ml의 PBS로 희석합니다.초원심분리기 100, 000배 g 및 3시간 동안 섭씨 4도에서 부고환을 펠릿화합니다. 그런 다음 조심스럽게 흡인하고 상등액을 버리고 부고환 펠릿을 방해하지 않도록 하십시오. 다운스트림 적용 전에 부고환의 순도를 평가하는 것이 중요합니다.멸균 커버슬립을 준비한 후, 커버슬립을 포함하는 12개의 웰 플레이트의 각 웰에 200, 000 mEcap 18개의 세포의 통로 분취액을 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 배양합니다. 세포가 커버슬립에 부착되면 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.커버슬립 전체를 잠글 수 있도록 충분한 양의 파라포름알데히드를 넣고 셀을 실온에서 15분 동안 고정합니다. 그런 다음 파라포름알데히드 용액을 버리고 PBS에서 커버슬립을 두 번 헹굽니다. 헹궈낸 커버슬립을 PBS의 0.1 Triton X-100에 10분 동안 담궈 세포를 투과화합니다.헹굼, 차단 및 면역 라벨을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 합니다. 먼저, mEcap 18 세포의 계대 분취액을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 6웰 플레이트로 이동합니다. 일단 부착되면 FBS가 없는 mEcap 18 세포 배지로 세포를 세 번 세척하여 잔류 FBS 및 관련 단백질 오염 물질을 제거합니다.그런 다음 1.5ml의 FBS가 없는 mEcap 18 세포 배지를 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%CO2의 분위기에서 12시간 동안 배양합니다. 그 후, 세포 배지를 수집하고 2, 000 회 g에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용하여 모든 세포 파편을 제거합니다.표준 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 mEcap 세포 생존율을 평가합니다. 80% 부피의 컨디션 세포 배지에 20% 부피의 냉각된 100% 트리클로로아세트산을 추가하여 배양된 mEcap 18 세포에서 방출된 단백질을 침전시킵니다. 섭씨 4도에서 밤새 지속적으로 혼합하여 배양합니다.다음으로, 17, 000 번 g과 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리기. 상등액을 버리고 단백질 펠릿을 식힌 아세톤으로 두 번 씻습니다. 그런 다음 17, 000 회 g 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 다시 원심 분리기를 사용하십시오.상등액을 조심스럽게 제거하고 다시 한 번 버립니다. 그런 다음 흄 후드의 샘플을 자연 건조하여 잔류 아세톤을 제거합니다. 조사된 각 DNMI 동형은 뚜렷한 면역형광 국소화 프로파일을 나타냅니다.DNMI는 초기 분절 및 caput 부고환 전체에 걸쳐 부고환 세포의 상대적으로 완만한 확산 표지가 특징입니다. DNM2 동형은 인접한 다운스트림 caput 분절 내의 세포에서 초핵 도메인으로 재배치되기 전에 초기 분절에서 세포의 반대쪽 기저 및 정점 경계 부근에서 먼저 검출됩니다. 이 표지의 강도는 caput 부고환의 2구역과 5구역 사이에서 점차 감소하며, 이는 본질적으로 이러한 부고환 분절의 분비 활동을 반영합니다.DNM2의 초핵 표지는 이후에 caput 주요 세포 내 골지체의 분포와 일치하는 것으로 보입니다. DNM3 동형은 주로 소수의 caput 상피 세포의 정점 도메인에서 검출되며, 이는 인식된 투명 세포 마커 ATP6V1B1와 공동 표지하여 투명 세포 하위 집단에 해당하는 것으로 보입니다. 다음으로, 불멸화된 mEcap 18 세포주를 부고환 세포의 분비 활성을 연구하기 위한 체외 모델로 활용됩니다.분포 패턴은 mEcap 18 세포의 세포질 전체에서 DNM1이 검출되고, DNM2는 이러한 세포의 핵상 내에 집중되며, DNM3는 작은 하위 집단 수 내에서 막 염색의 개별 초점이 특징인 caput 부고환 조직 절편에서 볼 수 있는 것과 일치하는 것으로 보입니다. 면역형광 검출을 시도하는 동안 각 항원의 조건을 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 부고환 영역 집단의 분리는 파일링 분석에 따라 정자 및 ocalgo와의 공동 배양을 포함한 다운스트림 응용 분야에서 쉽게 사용할 수 있으며, 둘 다 부고환 정자 성숙을 조절하는 부고환의 역할에 대한 이해를 향상시키는 강력한 접근 방식입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

모든 세포 유형에 대한 단백질체 분석은 액체 크로마토그래피 질량 분석법(MS) 전에 시료의 복잡성을 줄이기 위해 출발 물질의 순도와 사전 분획에 크게 의존합니다. 역 세척 기술을 사용하면 설치류에서 순수한 정자를 얻을 수 있습니다. 분해 후 인산펩티드는 TiO2를 사용하여 농축할 수 있습니다.

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

이 비디오 프로토콜은 자웅동체 민물 달팽이 Lymnaea stagnalis를 사용하여 복족류에서 정액의 영향을 연구하는 방법을 보여줍니다.

복족류 연체 동물의 달걀 누워에 남성 액​​세서리 글 랜드 제품의 효과

단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

이 프로토콜은 결합된 리보솜의 수를 기준으로 식물 조직에서 전사체를 추출하고 분획하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이를 통해 translation activity의 전반적인 추정치와 특정 mRNA의 translational status 결정을 수행할 수 있습니다.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

높은 척수액 단백질 수준은 변경된 혈액 뇌 장벽 또는 신분 합성을 통해 혈장 단백질의 확산의 결과일 수 있습니다. 최적화된 테스트 프로토콜은 두 경우를 모두 구별하는 데 도움이 되며 합성된 단백질의 정량적 측정을 제공하는 이 문서에 제시되어 있습니다.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

여기서는 쥐의 초기 구간(간질성 주사)과 꼬리부고(혈관 내 주사)에서 염증 자극을 유도하는 두 가지 뚜렷한 외과적 주사 모델을 설명한다. 이 방법들은 부고고의 다양한 부위에서 특정 부위 반응을 연구할 수 있게 합니다.

병원체 관련 분자 패턴에 의해 유발된 부고고환염의 마우스 모델

배우세요 생식생물학 연구를 위한 부고환 단백질 합성 및 분비 분석 방법을 마우스 조직과 세포주를 활용하여. 이 기술은 정자 성숙 메커니즘 이해에 필수적인 단백질 검출 및 분리 프로토콜을 제공합니다.

Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

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