Name: 날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 학습하세요 신장 피질 세포외기질 유래 하이드로겔 제작 방법을 통해 생체재료 연구에서 세포-기질 상호작용을 분석하고 신장 특이적 세포 및 조직 재생을 지원하는 기술을 익히세요.

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저자 린 마이크가 비 이미징 연구실 줄기 세포 및 재생 의학 및 LifeCenter 북 서 연구소에서 인정 하 고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국가 학회 교부 금, UH2/UH3 TR000504 (재 혁)에 (Y.Z.)에 DP2DK102258, NIH T32 훈련 부여 DK0007467 (R.J.N.), 북 서 신장 센터를에서 제한 없는 선물의 금융 지원을 인정 하 고 싶습니다는 신장 연구소입니다.

인간의 신장 LifeCenter 북 서 윤리 지침을 장기 조달 단체의 협회에 의해 설정에 의해 고립 되었다. 이 프로토콜은 워싱턴 대학에 의해 제시 된 동물 관심과 셀 문화 지침을 따릅니다.
1입니다. 인간 신장 조직 준비
<ol><li>Decellularization 솔루션의 준비<ol>
<li>소독 5000 mL 비 커와 70 x 10 m m 저 어 바.</li>
		<li>1:1000 (무게: 볼륨) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 비 커에 압력가 이온된 수에 혼합. 약 200 rpm 24 h 또는 SDS 완전히 녹아 때까지 저 어 접시에 솔루션을 둡니다. 참고: 일반적으로 1 %SDS 솔루션의 2500 mL은 단일 인간의 신장 decellularize 충분 합니다.</li>
		<li>500 mL의 멸 균 진공 필터 솔루션을 전송 하 고 멸 균된 밀폐 가능한 용기에 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신장 조직의 처리<ol>
<li>세척 및 고압 집게, 두 개의 hemostat의 쌍 클램프, 일반 서비스 등급이 위, 두 메스 블레이드 핸들, 알루미늄 호 일, 그리고 36 x 9 mm 볶음 바 덮여 1000 mL 비 커.</li>
		<li>Underpad 조직 문화 후드 라인. 비 커, 메 마른 조직 문화 접시 (150 x 25 m m), 및 전체 신장 기관 후드에 놓습니다. 1 %SDS 솔루션의 500 mL로 비 커를 채우십시오. 참고: 인간의 신장 LifeCenter 북 서에서 얼음에 받았습니다.</li>
		<li>신장 균 조직 문화 접시 (그림 1A)에 놓습니다. 가볍게 메스 (그림 1B)로 신장 캡슐 주위 면도 모든 perirenal 지방 질을 제거 합니다.</li>
		<li>충분히 깨 신장 캡슐 신장의 우수한 끝에 걸쳐 기본 피 질 조직 손상 없이 깊은 메스와 얕은 8-10 cm 절 개를 확인 합니다. 두 hemostat 클램프 (그림 1C) 피 질 조직에서 그것을 박 리 하 여 신장 캡슐을 제거 합니다.</li>
		<li>신장 (그림 1D)의 측면을 따라 메스를 사용 하 여 코로나 평면 신장을 이등분. 메스 (그림 1E)와 medullar 지역 밖으로 조각 하 여 두 반쪽에서 피 질 조직을 분리 하 고 0.5 c m3 조각 (그림 1 층)으로 피 질 조직 주사위. 어떤 큰 보이는 혈관을 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 외 매트릭스의 절연<ol>
<li>조직 문화 후드, 1000 mL 비 커 500 mL 1 %SDS 솔루션을 채워 놓습니다. SDS 솔루션을 포함 하는 비 커로 절단된 피 조직과 저 어 바를 놓습니다. 압력가 알루미늄 호 일로 비 커를 커버 하 고 조직 문화 후드 밖에 약 400 rpm에서 저 어 접시에 놓습니다.</li>
		<li>후 피 질 조직 24 h에 대 한 저 어 접시에, 조직 문화 후드로 비 커를가지고 고 나일론 메쉬로 만든 40 µ m 살 균 셀 여과기를 추가 합니다. 백제의 200 mL와 함께 별도 1000 mL 비 커와 조직 문화 후드에.</li>
		<li>표 백제를 포함 하는 비 커에 셀 스 트레이너를 통해 SDS 솔루션 플라스틱. 플라스틱 모든 SDS 솔루션 decellularized 조직과 셀 스 트레이너는 비 커에 남아 때까지. 참고: 셀 여과기 어떤 조직 솔루션 열망 하는 동안 제거 되지 않도록 방지 해야 합니다.</li>
		<li>신선한 SDS 솔루션의 500 mL 비이 커에 채우기 셀 스 트레이너를 두고. 같은 알루미늄 호 일로 비 커를 커버 하 고 앞으로 같은 속도로 저 어 접시에 놓습니다.</li>
		<li>5 일의 총 단계 1.3.1-1.3.3 신선한 SDS 솔루션 24 시간 마다 반복 합니다.</li>
		<li>Decellularized 조직을 압력가 디 물 단계 1.3.1-1.3.3에 설명 된 기술을 다음과 같은 3 일 총 24 시간 마다 헹 구 십시오.</li>
		<li>Decellularized 조직을 세포 문화 학년 물 단계 1.3.1-1.3.3에 설명 된 기술을 다음과 같은 2 일 총 24 시간 마다 헹 구 십시오.</li>
		<li>1.3.1-1.3.2 단계를 반복 합니다. Decellularized 조직 (라고도 kECM이이 시점에서에) 30 mL 원뿔 튜브 자체 서에 전송 하 고 모든 조직 빠져들 때까지 셀 문화 학년 물으로 채우십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 하이드로 겔 재고 솔루션의 제조
<ol><li>Decellularized 조직의 기계 가공<ol>
<li>조직 문화 후드, 기계적으로 2 분 동안 조직 균질 화기와 원뿔 관 내의 kECM 균질. 참고: 무 균된 kECM ECM의 볼 수 없는 조각으로 불투명 한 솔루션을 유사 해야 합니다.</li>
		<li>이상 지속 되는 튜브를 둘러싼 끓는 때까지 액체 질소에 kECM를 포함 하는 원뿔 튜브 잠수함 하룻밤-4 ˚C에서 kECM를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동결은 냉동된 decellularized 조직의<ol>
<li>약간 가스 교환을 허용 하 고 튜브 동결은 기계를 원뿔 튜브 캡을 풉니다. Lyophilize는 kECM 3 일 동안 또는 그것은 정밀한 백색 분말을 닮을 때까지. 스토어-4 ˚C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>화학 소화와 젤의 가용 화<ol>
<li>압력솥 20 mL 섬광 유리병 및 모자, 15.9 x 7.9 m m 저 어 바 파인 팁 집게 한 쌍</li>
		<li>동결 건조 된 kECM의 무게와 HCl과 펩 신 solubilize 어디 m펩 신 펩 신의 질량은 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 3% (30 mg/mL) 솔루션 kECM 하는 데 필요한의 질량의 볼륨을 계산, m조직 의 질량은 동결 건조 된 조직, 그리고 VHCl 0.01 N HCl에의 부피는: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58314/58314eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58314/58314eq2.jpg">
</li>
		<li>조직 문화 후드, 섬광 유리병을 돼지 위 펩 신, 0.01 N HCl, 그리고 저 어 바를 추가 하 고 모든 펩 신 해산 했다 때까지 약 500 rpm에서 저 어 접시에 그것을 두고. 섬광 유리병을 동결 건조 된 kECM를 전송 하 고 3 일 동안 약 500 rpm에서 저 어 접시에 솔루션을 떠나.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 하이드로 겔 겔 화
<ol><li>신장 ECM 히드로 준비<ol>
<li>1 N NaOH, 미디어 보충 (M199), x 10과 kECM 히드로 재고 솔루션을 혼합 하 여는 히드로 젤 그리고 세포 배양. 얼음에 모든 솔루션을 유지. 참고: 최종 젤 7.5 mg/mL의 농도 세포 배양에 사용 되었다. kECM 젤의 1 mL 제시 세포 배양 실험을 위해 충분 했다.</li>
		<li>생산 가능한 kECM 젤의 볼륨 및 볼륨 V마지막 은 만든 젤의 볼륨 다음 방정식을 사용 하 여 필요한 재고 kECM 하이드로 겔의 결정, V주식 kECM 는 필요한 재고 kECM 하이드로 겔의 볼륨 C재고 kECM 주식 kECM 하이드로 겔의 농도 이며 C마지막 최종 젤의 농도: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58314/58314eq3v2.jpg">
</li>
		<li>VNaOH 는 1 N NaOH의 볼륨 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 필요 시 약을 중화의 볼륨을 결정, V10 배는 M199 볼륨 10 X 미디어 보충, 그리고 V1 X는 세포 배양의 볼륨: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58314/58314eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58314/58314eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58314/58314eq6.jpg">
</li>
		<li>조직 문화 후드에서 자체 서 원뿔 튜브 살 균 30 mL로 중화 시 약 (NaOH, M199, 및 세포 배양) 플라스틱. Microspatula는 중화 시 약 해결책 혼합.</li>
		<li>살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 중화 시 약 솔루션 주식 kECM 하이드로 겔의 적절 한 볼륨을 전송. microspatula를 사용 하 여 부드럽게 때까지 균질 색상 히드로 솔루션에서은 솔루션을 혼합. 참고: 천천히 그리고 부드럽게 교 반에 의해 기포를 소개 하지 마십시오.</li>
		<li>KECM 히드로에 셀을 통합 단계 3.1.1.3에서에서 중화 솔루션 볼륨 계산에서 세포 배양 (V1 X)의 10 µ L을 뺍니다.<ol>
<li>세포 배양의 10 µ L로 세포를 일시 중단 합니다. #셀 중단 하는 셀의 수를 의미 하는 곳을 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 셀 수를 결정 하 고 V마지막 은 만든 젤의 볼륨: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58314/58314eq7.jpg"> 참고: 300, 000 셀/mL kECM 젤에 사용 된 셀의 농도 이다.</li>
			<li>KECM 재고 솔루션 중화 시 약 솔루션으로 혼합 되어 최종 kECM 젤으로 세포 정지 솔루션의 10 µ L를 플라스틱. 셀은 고르게 분포 될 때까지 microspatula로 솔루션을 저 어.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여 kECM 히드로와 원하는 셀 문화 장치를 채우기 위해.</li>
	<li>전송 하거나 셀을 도금 하기 전에 1 h 37 ˚C에서 설정 하 젤을 허용 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

행렬 셀 동작을 제어 하는 중요 한 기계 및 화학 신호를 제공 합니다. 합성 hydrogels 복잡 한 3 차원 패턴을 지원 하지만 생리 매트릭스 microenvironments에서 다양 한 세포 외 신호를 제공 하지 못하는 수 있습니다. Hydrogels 네이티브 ECM에서 파생 된는 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구를 위한 이상적인 물자 이다. 이전 연구를 사용 하 고 decellularized ECM hydrogels 호스트 면역학 응답33,34, 줄기 세포35,,3637 을 차별화 하는 방지 하기 위해 합성 바이오 코트 , 38, 2D와 소프트 리소 그래피...

세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 복잡 한 분자 구성 조직의 구조 및 기능 속성을 조정합니다. 구조 단백질 셀 공간 인식 수 있으며 접착 및 마이그레이션1있습니다. 바운드 ligands 제어 셀 동작2세포 표면 수용 체 상호 작용. 신장 ECM 분자의 조성과 구조에 따라 해부학 적 위치, 발달 단계, 및 질병 상태3,4의 과다를 한 포함 되어 있습니다. ECM의 복잡성을 업과 신장 파생 셀 체 외공부에서 핵심 요소 이다.
ECM microenvironments 복제에 이전 시도 recellularization의 건설 기계를 만드는 decellularizing 전체 조직에 집중 했다. Decellularization 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 등 화학 세제 또는 비 이온 세제, 수행 하 고 중 전체 장기 관류 또는 침수와 교 반 방법5,6,7 활용 ,,89,10,11,,1213. 여기에 제시 된 건설 기계 구조 및 생 화 확 적인 신호 기본 조직 ECM;에 보존 또한, 기증자-특정 셀과 recellularization에 임상 관련성 재건 수술14,15,,1617,18, 그러나 19., 이러한 건설 기계 구조 유연성 부족 하 고 따라서 생체 외에서 연구를 위해 사용 하는 많은 현재 장치와 호환 되지 않습니다. 이 한계를 극복, 많은 그룹이 추가 처리 decellularized ECM hydrogels20,,2122,,2324에. 이러한 hydrogels 사출 성형 및 bioink와 호환 되며 decellularized 세포에 건설 기계 장소 마이크로미터 스케일 공간 제약을 우회. 또한, 분자 구성 및 네이티브 ECM에서 발견 비율3,25유지 됩니다. 여기 신장 피 질 ECM (kECM)에서 파생 된 하이드로 겔을 조작 하는 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 목적은 신장 피 질 영역의 microenvironment 복제 하는 하이드로 겔을 생산 하는 것입니다. 신장 피 질 조직 세포 문제를 제거 하려면 지속적인 동요에서 1 %SDS 솔루션에서 decellularized입니다. SDS 면역 세포 소재6,7,,926를 신속 하 게 제거 하는 기능 조직 decellularize에 일반적으로 사용 됩니다. kECM는 다음 기계적 균질 및 동결은5,,69,,1126. 펩 신으로 강한 산에 가용 화 최종 히드로 재고 솔루션20,27에 발생합니다. 기본 kECM 단백질 구조에 대 한 중요 한 지원 및 신호 변환3,25유지 됩니다. 또한 네이티브 인간의 신장 피 질28,,2930의 한 차수 내는 히드로에 gelled 수 있습니다. 이 매트릭스는 다른 매트릭스 단백질에서 hydrogels에 비해 신장 특정 셀의 정지를 유지 하기 위해 사용 된 생리 적 환경의 제공 합니다. 또한, 매트릭스 구성을 조작할 수 있습니다, 예를 들어 콜라겐의 추가 통해-나, 신장 섬유 증 및 다른 신장 질환31,32의 연구에 대 한 모델 질병 환경.

<table><tbody><tr><td>Preparation of Kidney Tissue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5000 mL Beaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z740589</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sterile H2O</td><td></td><td></td><td>Autoclaved DI H2O</td></tr><tr><td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td><td>Fisher Science</td><td>14-512-128</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 진공 필터</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6795420D</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 비커</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS10031L</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4642</td><td>유사한 집게를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>가위 핸들 지혈구 클램프</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168866</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265977</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들, No. 4</td><td>VWR</td><td>25859-000</td><td>유사한 메스 핸들을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Scalpel Blade, No. 20</td><td>VWR</td><td>25860-020</td><td>유사한 메스 블레이드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td><td>Fisher Science</td><td>14-513-52</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 언더패드</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (150 x 25 mm)</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백</td><td>VWR</td><td>14220-026</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 여과기 (40 um)</td><td>Fisher Science</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 등급 물</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 독립형 튜브</td><td>VWR</td><td>89012-778</td><td></td></tr><tr><td> ECM Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Homogenizer Machine</td><td>Polytron</td><td>PCU-20110</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 유리 섬광 바이알 및 캡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7130</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td><td>Fisher Science</td><td>14-513-62</td><td></td></tr><tr><td>돼지 위 점막에서 추출한 펩신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7012</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>세포 배양 물로 0.01 N HCl로 희석</td></tr><tr><td>Kidney ECM Gelation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>세포 배양 등급 물에서 1 N으로 희석</td></tr><tr><td>매체 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 배지</td><td>ThermoFisher</td><td>11330.032</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 피루브산 나트륨 용액( ITS-A) 100X</td><td>Life Technologies</td><td>51300-044</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z192325</td><td></td></tr><tr><td>마이크로스파튤라</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z193208</td><td></td></tr></tbody></table>

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 현재 합성 hydrogels 체 외에서 세포 배양 하지만 부족 필요한 단백질과 리간드 컴포지션 셀에서 생리 적 행동을 이끌어내는 강력한 기계적인 지원을 제공 합니다. 이 원고는 적절 한 기계적 견고성 및 지원 생 화 확 적인 구성으로 신장 피 질 ECM 파생 된 하이드로 겔의 제조 방법을 설명합니다. 히드로 기계적 조직 및 decellularized 인간 신장 피 질 ECM solubilizing 조작 이다. 매트릭스도 생리 적인 기계 stiffnesses 겔 화 하면서 네이티브 신장 피 질 ECM 단백질 비율을 유지 합니다. 히드로 신장에 따라 피 질에서 파생 된 세포 생리 적인 조건 하에서 유지 될 수 있다 기질 역할을 합니다. 또한, 하이드로 겔 조성 장병의 미래 연구를 가능 하 게 병 환경을 모델링을 조작할 수 있습니다.

KECM 히드로 네이티브 신장 microenvironment로 유사한 화학 성분과 신장 세포 배양에 대 한 매트릭스를 제공합니다. 조작 된 하이드로 겔, 하 신장 피 질 조직 전체 신장 기관 및 절단된 (그림 1)에서 기계적으로 격리 됩니다. 화학 세제 (그림 2A.1 A.3) 세제 입자 (그림 2A.4 A.6)를 제거 하는 물으로 린스 하 여 다음 decellularization 절연된 신장 피 질 ECM을 생성 합니다. 전형적인 기저 층 류 단백질 콜라겐 등 콜라겐 IV와 laminin의 구조 단백질 등을 확인 하는 조직학 평가-내가 유지 됩니다 유일한으로 vitronectin 주의 예외 (그림 2B</stron...

여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

이 방법은 세포 매트릭스 상호 작용이 황산염에 미치는 영향과 같은 생체 재료 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 토착 신장 피질 생화학 미생물 환경을 정확하게 반영하는 첫 번째 물질을 생성한다는 것입니다. 언더 패드와 조직 배양 후드를 라인.교반 바, 150mm 멸균 조직 배양 접시, 신장 전체를 후드에 넣습니다. 1% SDS 솔루션의 500 밀리리터로 비커를 채웁니다. 멸균 조직 배양 접시에 신장을 놓습니다.메스로 신장 캡슐 주위를 가볍게 면도하여 모든 페리신 지방을 제거합니다. 그런 다음, 신장의 우수한 끝에 걸쳐 얕은 8 ~10 센티미터 절개를, 기본 피질 조직을 손상시키지 않고 신장 캡슐을 열어 깰. 두 개의 혈우염 클램프를 사용하여 피질 조직에서 벗겨내어 신장 캡슐을 제거하십시오.신장의 측면을 따라 메스를 사용하여 관상 평면을 따라 신장을 양분하십시오. 메스와 함께 수질 부위를 조각하여 두 반쪽에서 피질 조직을 분리합니다. 그런 다음 피질 조직을 0.5 센티미터 큐브 조각으로 주사위와 크고 보이는 혈관을 제거하십시오.신장에서 세포외 매트릭스를 격리하려면, SDS 용액을 포함하는 비커에 다진 피질 조직을 배치합니다. 비커를 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮고 조직 배양 후드 바깥쪽에 있는 약 400RPM의 교반판에 놓습니다. 24 시간 의 교반 후, 조직 배양 후드에 비커를 가져.나일론 메쉬로 만든 40 마이크론 멸균 셀 스트레이너를 추가합니다. 그리고, 표백제 200 밀리리터와 별도의 1000 밀리리터 비커를 채우고, 조직 배양 후드에 놓습니다. 세포 스트레이너를 통해 SDS 용액을 표백제가 들어있는 비커에 넣습니다.남은 SDS 용액을 제거하면 세포 변형 조직과 세포 스트레이너만 비커에 남아 있을 때까지 피펫합니다. 비커에 셀 스트레이너를 두고 500 밀리리터의 신선한 SDS 솔루션을 추가합니다. 비커를 동일한 알루미늄 호일로 덮고 이전과 같은 속도로 저어줍니다.탈세포화 및 세척 후, 이 시점부터 신장 ECM이라고 불리는 탈세포화된 조직을 30밀리리터 자가형 원내 튜브로 옮킨다. 그리고 모든 조직이 물에 잠길 때까지 세포 배양 등급의 물로 채웁니다. 먼저, 조직 균질화제를 사용하여 원문 관내 신장 ECM을 2분 동안 균질화하고, 눈에 보이는 ECM 조각이 없는 불투명한 용액을 얻을 수 있다.이어서, 액체 질소에 신장 ECM을 함유하는 원내관을 침수하여 튜브를 둘러싼 끓는 것이 더 이상 지속되지 않습니다. 신장 ECM을 하룻밤 동안 영하 4도에 보관하십시오. 동결 된 탈세포 조직을 lyophilize하려면, 약간 가스 교환을 허용하기 위해 원문 튜브 캡을 느슨하게하고, lyophilization 기계에 튜브를 배치합니다.3 일 동안 신장 ECM을 lyophilize, 또는 그것은 미세, 흰색 분말을 닮은 때까지. 젤을 화학적으로 소화하고 용해시키기 위해 조심스럽게 계량된 돼지 위 펩신과 0.01 일반 염산에 교반 바를 함유한 신경에 첨가합니다. 약 500 RPM에서 저어주면 모든 펩신이 용해될 때까지 저어줍니다.이어서, 리오필화된 신장 ECM을 신설성멸으로 옮기고 약 500RPM에서 3일 동안 용액을 교반판에 남겨두고 혈중 신장 ECM 하이드로겔을 만든다. 조직 배양 후드에서, 세포 배양 매체의 필요한 볼륨, 하나의 정상적인 수산화 나트륨 및 M199 보충, 멸균 30 밀리 리터 자체 서 원뿔 튜브로 파이프. 중화 시약 용액을 마이크로 주걱과 혼합합니다.멸균 1 밀리리터 주사기를 사용하여 적절한 양의 스톡 신장 ECM 하이드로겔을 중화 시약 용액으로 이송합니다. 마이크로 주걱을 사용하여 균일한 색상, 하이드로겔 용액이 얻어질 때까지 용액을 부드럽게 혼합합니다. 천천히 부드럽게 저어서 기포를 도입하지 마십시오.신장 ECM 하이드로겔에 세포를 통합하기 위해, 각 하이드로겔에 대한 배지의 10 마이크로 리터에 삼십만 세포를 다시 중단. 최종 신장 ECM 젤로 세포 현탁액의 파이프 10 마이크로 리터. 세포가 균등하게 분포될 때까지 마이크로 주걱으로 용액을 저어줍니다.1 밀리리터 주사기를 사용하여 원하는 세포 배양 장치를 신장 ECM 하이드로겔로 채웁니다. 젤이 세포 배양 장치에서 신장 ECM에 세포를 옮기거나 도금하기 전에 1 시간 동안 섭씨 37도에서 설정되도록 하십시오. 질량 분석법에 의한 탈세포 피질 조직의 분석은, 콜라겐-IV와 콜라겐-I가 가장 높게 표현되는 바질 라미나와 관련되었던 단백질의 존재를 밝혔습니다.콜라겐-IV, A1 및 A2 체인, 모든 지하 막에 유비쿼터스 보존 되었다. 콜로메루스의 지하 막에만 존재하는 콜라겐-IV, A3 및 A5 체인도 검출되었다. 라민과 콜라겐-I의 일반적인 이소 형태도 검출되었습니다.인간 신장 관피 미생물 세포, 또는 HKMECs, 콜라겐-I, 신장 ECM 및 1:1 혼합물 젤에 배양, 표현형에 있는 다름을 보였다. 콜라겐-I에서 배양된 HKMECs는 빨간색으로 보이는 균일한 CD31 표현을 표시했습니다. HKMEC는 신장 ECM을 포함하는 2개의 젤에 배양하는 동안, 고르지 않은 분포에서 감소된 CD31 발현을 표시했습니다.매트릭스 유형은 녹색으로 표시된 VWF 식에 영향을 미치지 않았습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 완전히 탈세포 신장 피질 조직을 균질화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 중화 시약과 젤을 혼합 할 때, 기포의 도입을 피하십시오.마이크로 생리 시스템은 통제 된 실험실 환경에서 장기 기능의 연구를 허용합니다. 이러한 시스템의 생성은 세포, 행렬 및 자극의 구현이 필요합니다. 여기서 제작된 kECM 하이드로겔은 신장 마이크로 환경을 재구성하는 시스템을 연구할 수 있게 해줍니다.

fabricating-a-kidney-cortex-extracellular-matrix-derived-hydrogel

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

이 프로토콜은 혈관 구조를 통한 세제의 사전 관류에 의한 Sprague Dawley 쥐 신장의 탈세포화를 설명하며, 인간 신장 상피 세포로 재증식하기 위한 템플릿 역할을 하는 무세포 신세포 외 기질을 생성합니다. 성장을 모니터링하기 위한 재세포화 및 레사주린 관류 분석법의 사용은 특별히 설계된 관류 생물반응기 내에서 수행됩니다.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

여기에 제시된 프로토콜은 기계학 연구, 질병 모델링 및 스크리닝 애플리케이션에 적합한 이중 극이 있는 다중 우물 판에서 48개의 조직의 병렬 배양에 대한 엔지니어링 된 결합 조직을 생성하는 프로토콜입니다. 프로토콜은 다른 장기와 종에서 섬유 아세포와 호환되며 인간의 기본 심장 섬유 아세포와 함께 여기에 예시됩니다.

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

이 논문은 탈세포화된 연골 세포외 기질(DC-ECM) 하이드로겔의 합성을 위한 새로운 방법을 소개합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생체 적합성이 우수하고 세포 성장을 위한 우수한 미세환경을 제공합니다. 따라서 이상적인 세포 스캐폴드 및 생물학적 전달 시스템이 될 수 있습니다.

탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 합성

이 프로토콜은 토착 소 폐 조직에 적용되는 두 가지 뚜렷한 탈세포화 방법론을 설명하여 각각의 특성화에 대한 포괄적인 설명을 제공합니다.

탈세포화된 폐 세포외 기질 하이드로겔의 개발 및 특성 분석

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

학습하세요 신장 피질 세포외기질 유래 하이드로겔 제작 방법을 통해 생체재료 연구에서 세포-기질 상호작용을 분석하고 신장 특이적 세포 및 조직 재생을 지원하는 기술을 익히세요.

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

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