Name: 검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 배우세요 세포사멸체를 높은 순도로 검출하고 분리하는 방법을 흐름 세포측정법과 차등 원심분리를 사용하여 세포생물학 연구에 활용하세요. 이 기술은 세포 내 신호전달 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.

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일이 I.K.H.P. 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (GNT1125033 및 GNT1140187) 및 호주 연구 협의회 (DP170103790)에서 교부 금에 의해 지원 되었다

1입니다. Apoptosis 유도
<ol><li>5 분 및 모든 기존의 세포 파편을 제거 하려면 삭제 상쾌한 300 x g에서 원심 분리기 셀 샘플. 참고: 부착 셀을 사용 하는 경우 사전에 셀 씨 고 apoptosis 유도 전에 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) x 1 씻어.</li>
	<li>휴대폰 번호를 확인 하 고 세포를 수집 합니다. 참고: 분석 결과 후 절연에 따라 좋습니다 적어도 1 x 10의 시작 셀 번호7 셀을.</li>
	<li>1 x 106 셀/mL의 최종 농도 대 한 완전 한 미디어 (10% (vol/vol) 태아 송아지 혈 청, 50 IU/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스 혼합물을 포함 하는 각 매체)에서 resuspend.</li>
	<li>Aliquot ~ 106 셀 6 잘 플레이트의 당 x 2.</li>
	<li>Apoptosis를 유도 하는 접시 뚜껑을 제거 하 고 150 mJ/cm2 UV irradiator를 사용 하 여 셀을 비추는. 이 약 30-60 s를 취해야 한다. 참고: 이전에 방사선,6 셀 ~0.5 x 10 'Untreated' 셀 컨트롤에 대 한 유지 됩니다 확인 합니다. 참고: Apoptosis 또한 안티 Fas 또는 혈 청 기아6등 다른 방법을 통해 유도 될 수 있다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 셀 라인에 따라 2-8 시간 동안에 품 어.</li>
	<li>벤치 가기 가벼운 현미경을 사용 하 여, 시각화 apoptotic 형태학, blebbing, apoptopodia 형성, ApoBD 형성 등의 존재를 확인 하는 세포. 참고: 40 X 확대는 충분 한</li>
	<li>P1000 피 펫을 사용 하 여, 플라스틱 및 apoptotic 샘플을 수집 합니다.</li>
	<li>1 x PBS 가진 접시를 세척 하 고 나머지 샘플 최대 수확량을 위해 결합.</li>
	<li>수집 ~1/10th '전체 Apoptotic 샘플' (WAS)를 제어 합니다.</li>
	<li>'치료' 샘플을 수집 합니다.</li>
	<li>3000 x g 6 분에 WAS 및 Untreated 샘플 원심</li>
	<li>1 x PBS의 1 mL에 resuspend 하 고 얼음에 따로.</li>
	<li>ApoBD 절연, 어느 2 또는 3 단계 나머지 apoptotic 샘플 계속.</li>
</ol>2. ApoBD FACS 통해 격리
<ol><li>3000 x g 6 분에 전체 샘플 원심</li>
	<li>펠 릿을 중단 하지 않고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다.</li>
	<li>1 x A5 바인딩 버퍼, A5 FITC의 75 µ L 당 1 x 107 셀에-프로-3의 2 µ L의 1 mL를 포함 하는 얼룩 솔루션에서 resuspend.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>1 x A5 바인딩 버퍼의 1-2 mL을 추가 하 고 원심 3000 x g 6 분 초과 얼룩 제거에서 샘플. 참고: 혼합된 셀 인구 또는 조직 샘플에 대 한 수행 단계 1 x A5 바인딩 버퍼에 셀 유형 전용 표식의 조합을 사용 하 여 얼룩이 지는 항 체와 3000 x g 6에서 원심 분리 하기 전에 (또는 제조 업체의 프로토콜에 의하여) 20 분 동안 얼음에 품 어 분입니다.</li>
	<li>FACS 버퍼의 3 ml에서 샘플 펠 릿 resuspend (1x PBS, 1 x A5 바인딩 버퍼, 10 %FSC, 2 mM EDTA) 1 x 107 셀 당.</li>
	<li>라운드-하단, 폴 리 프로필 렌 (cytometry) 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 샘플 얼음에, 어둠 속에서 계속.</li>
	<li>FACS 기계와 100 µ m 노즐을 사용 하 여 표준 설치를 수행, 드롭 지연 수행을 켜고 안정적인 흐름을 보장 합니다.</li>
	<li>샘플을 로드 하 고 ~ 1000 이벤트/s 수집 속도 설정 합니다.</li>
	<li>FSC, SSC, APC (TO-프로-3) 조정 하 고 (A5) FITC 전압 및 인구를 보장 하기 위해 FACS 플롯 내의 위치 이벤트 명확 하 게 분리 될 수 있다.</li>
	<li>20000 이벤트를 기록 합니다.</li>
	<li>제 4 부로 제어 전략을 설정 합니다.</li>
	<li>정렬 레이아웃에서 원하는 정렬 인구로 최종 ApoBD 게이트를 추가.</li>
	<li>샘플 수집 시작 되 고 ~ 250 µ L FACS 버퍼를 포함 하는 새로운 관으로 5000-10000 ApoBDs를 수집 하 여 테스트 정렬을 수행.</li>
	<li>뒤 시스템을 수행 하 고 정렬된 ApoBDs을 로드 합니다.</li>
	<li>취득 및 테스트-정렬 ApoBDs을 기록.</li>
	<li>ApoBD 순도 FSC (y 축) 대 a 5를 비교 하 여 ~ 99% 인지 확인 (x 축 이벤트). 참고: 다시 레이저 표백으로 인해 샘플을 분석 하는 경우에 약간 줄일 수 있습니다 A5 얼룩.</li>
	<li>고 순도 달성 되 면 원래 샘플을 로드 하 고 정렬 ApoBDs의 원하는 숫자를 얻을 때까지 계속. 참고: 필요한 경우 듀얼 정렬을 수행할 수 있습니다 동시에 ApoCells 및 ApoBDs를 분리. 참고: 시간의 긴 기간 동안 정렬할 때 좋습니다 잠복기 4 ° c.에 컬렉션 튜브</li>
	<li>정렬이 완료 되 면 정렬 후 ApoBDs의 작은 부분을 수집, ApoCells, Untreated, 및 WAS apoptosis의 유효성을 검사 하 여 정렬 후 순도 확인 후 정렬. 참고: 테스트 정렬 및 정렬 후 순도 크게 차이가 안 한다, 비록이 스트림 설정 및 안정성에 기반입니다.</li>
</ol>3. ApoBD 절연 차등 원심 분리를 통해
<ol><li>10 분에 대 한 300 x g에서 나머지 apoptotic 샘플 원심</li>
	<li>~ 500 µ L 셀 펠 렛을 방해 하지 않으려면 떠나 상쾌한 수집 하 고 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 추가.</li>
	<li>나머지 500 µ L을 제거 하 고 (이 'ApoCell 농축 비율'을 나타냅니다 1 x PBS의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>3000 g에서 20 분에 대 한 수집된 상쾌한 원심</li>
	<li>펠 릿에 대 한 확인 하 고 조심 스럽게 제거 상쾌한 (는 상쾌한 microvesicles 및 exosomes를 포함 하 여 작은 세포 외 소포를 포함할 수 있습니다).</li>
	<li>1 x PBS (이 대표는 ' ApoBD-농축 ' 분수)의 1 mL에 펠 릿 resuspend</li>
	<li>각 실용적, WAS, ApoCell-농축, 및 새로운 라운드-하단, 폴리스 티 렌 (cytometry) 튜브 샘플 ApoBD 농축의 100 µ L를 수집 합니다.</li>
	<li>2 x A5 바인딩 버퍼, 1: 100 A5-FITC, 및 1:1,000에-프로-3를 포함 하는 얼룩의 100 µ L를 추가</li>
	<li>어둠 속에서 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
	<li>Cytometry, apoptosis의 성공적인 유도 및 ApoBD 농축 분수의 순도 확인 하기 위해 위에서 설명한 제어 전략을 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>4. Cytometry 전략 게이팅
<ol><li>플롯을-프로-3 (y 축) FSC (x 축) 모든 다른 비-permeabilized 이벤트 (TO-프로-3낮은/중간)에서 괴 사 성 세포 (TO-프로-3높은) 분리에 대 한.</li>
	<li>모든 비 permeabilized 이벤트를 선택 하 고 a 5에 대 한 SSC 플롯. 두 개의 인구 인구 1 (P1), SSC중간/높은,낮은/중간 셀 A5 및 인구 2 (P2), 다른 모든 이벤트를 포함 하 여 게이트.</li>
	<li>P2에서 TO-프로-3 a 5에 대 한 플롯 하 고 A5중간/높 은 이벤트 모든 세포 파편을 제외를 선택 합니다.</li>
	<li>모든 A5 긍정적인 이벤트를 선택 하 고 a 5에 대 한 FSC 플롯. ApoCells (FSC중간/높은)에서 ApoBDs (FSC낮은)을 구분 합니다. 참고: ApoBDs FACS 기반 접근을 통해 ApoBD 절연을 위한 게이팅, 좋습니다 마지막 단계를 ApoBDs를 선택 하 고 비교를-프로-3 a 5에 모든 이벤트를 선택 하 여. 이렇게 마지막 정렬 게이트 형광 보다는 FSC/SSC 매개 변수를 사용 하면.</li>
	<li>실행 가능한 세포 분석에 대 한 P1을 선택 하 고 두 가지 제어 전략 중 하나를 수행 합니다. 일반 실행 가능한 세포 분석, a 5에 대 한 FSC 플롯 고 따라서 나머지 세포 파편을 제거 하는 모든 FSC중간/높 은 셀을 선택 합니다. 또는, 심층 분석에 대 한 실행 가능한 세포 분리 될 수 있다 a 5에서- 에-프로-3 금감위에 대 한 플롯에 의해 초기 ApoCells. 선택에-프로-3낮은, FSC중간/높은 실행 가능한 세포와 TO-프로-3중간, FSC중간/높 은 A5- 초기 ApoCells.</li>
</ol>

<ol><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li>
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<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이후 1950 년대에 있는 그것의 초기 설명, apoptosis의 분야 전진 했다 현저 하 게, 저명한 연구 분야를 되 고. 광범위 한 관심과 광범위 한 노력에도 불구 하 고 apoptosis, 특히 ApoBDs의 대형에에서의 하지 되었습니다 잘 공부 적절 한 방법론의 부족. 특히 추적 apoptosis 진행과 동시에 전통적인 cytometry A5/PI 분석 및 ApoBD 격리의 불순물을 사용 하 여 ApoBD 형성에 제한이 포함 됩니다. 최근 접근 방법론 이러한 단점을 해결 하기 위해 개발 했습니다.
우리의 새로운 흐름 cytometry 기반 분석 접근 ApoBDs를, 전통적인 분석 방법을 사용 하 여 감지 종종 무시 하 고20을 측정할 수 있습니다. 또한,이 흐름 cytometry 얼룩에-프로-3, 밝혀 추가 a 5의 사용 방법,- 초기 apoptotic 단계, 따라서 apoptosis 진행<sup class="...

Apoptosis, 프로그램 된 세포 죽음의 잘 공부 형태를 생리 적 항상성 유지 하 고 인체1내에서 잠재적으로 유해한 세포를 제거 해야 합니다. Apoptosis 유도 후 apoptotic 세포 (ApoCells) 일련의 형태학 적 변화를 받아야 하 고 ApoBDs 되 나 작은 막 도약 vesicles로 분해 수 있습니다. 전반적으로,이 과정 apoptotic 세포 분해로 알려져 있으며 형태2,3에 따라 3 가지 단계로 나눌 수 있습니다. 단계 1 (플라즈마 멤브레인 blebbing) 풍선 모양의 구조 blebs4,5로 알려진 세포 표면에 형성 특징 이다. 단계 2 (apoptotic 돌출 형성) apoptopodia, 파란색 apoptopodia 및 microtubule 스파이크6,,78등 긴 막 돌출의 형성을 포함합니다. 마지막으로, 3 단계 (ApoBD 형성) apoptotic 돌출 ApoBDs6,9를 생성 하는 ApoCells의 파편을 포함 한다. 이전 연구 결과 apoptotic 세포 클리어런스를 방 조 하 고 세포 통신을 중재에 ApoBDs의 역할을 제안 했다. 예를 들어 ApoBDs에는 ApoCell의 분열 식 세포2,10,11을 둘러싼에 의해 쉽게 제거 될 수 있는 작은 ' 입 크기 ' 조각 생성 수는 제안 합니다. 또한, ApoBDs DNA, RNA 및 단백질, 셀 통신12,,1314를 촉진 하기 위하여 주변 셀에는 인신 매매 수 등 생체의 일련을 항구 수 있습니다. 기능적으로이 프로세스를 조사, apoptosis 유도 및 ApoBD 형성의 유효성 검사 (i), (ii) ApoBDs, 절연 및 (iii) ApoBD 순수성의 확인을 포함 하 여 세 가지 주요 매개 변수를 확인 하는 생명 이다.
이전에, cytometry 등 전자 현미경 검사 법 방법의 수 ApoBDs15,16,,1718apoptosis를 공부 하 고 사용 되었습니다. 그러나, ApoBD 검출 및 정량화는 종종 어려운 또는 간과. 가장 일상적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 apoptosis 고용 annexin V를 시험 하는 예를 들어, (A5, 단백질은 외부화는 ' 먹고-나 ' 신호 phosphatidylserine (PtdSer))과 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물 (PI)19. 그러나,이 범용 얼룩 조합을 사용 하 여 분석 가정 샘플에서 셀 하위 (가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포)의 3 종류가 있습니다. 또한, 비록 apoptosis에 대 한 많은 연구자에 의해 "금 표준"으로 간주, cytometry 분석 실험 및 후속 데이터 분석은 종종 FSC/SSC중간-높 은 이벤트를 선택 하는 초기 제어 단계를 통해 ApoBDs을 제외. 따라서, 우리는 최근에 a 5와 TO-프로-3를 사용 하 여 새로운 흐름 cytometry 분석 결과 개발, caspase 3/7-활성화 pannexin 1 (PANX1)에 의해 선택적으로 촬영 될 수 있는 또 다른 핵 얼룩 채널7,20. Caspase 3 유도 PANX1 활성화 apoptosis의 초기 단계에서 PtdSer 노출 앞로 TO-프로-3 차동 apoptotic 및 회 저 성 세포를 얼룩. 또한, 전략 게이팅 우리의 소설과 결합 된이 접근 데이터 분석 중 모든 획득된 이벤트를 포함 하 고 그 결과, 6 셀/입자 하위 집합 식별 됩니다, 포함 하 여: (i) 가능한 셀 (FSC/SSC중간/높은, A5낮은 , TO-프로-3낮은), (ii) A5- 초기 ApoCells (FSC/SSC중간/높은, A5낮은,중간에-프로-3), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC중간/높은, A5높은 ,중간에-프로-3), (iv) 회 저 성 세포 또는 늦은 ApoCells (FSC/SSC중간/높은 A5높은,높은TO-프로-3), (v) ApoBDs (FSC/SSC낮은, A5중간, TO-프로-3낮은 중간 /), 그리고 (vi) 파편 (FSC/SSC낮은,낮은A5, TO-프로-3낮은)20. 우리의 접근 방식은 모든 셀/입자 하위 집합 및, 더 중요 한 것은, 세포와 파편20에서 ApoBDs의 분리 분석의 중요성을 강조 한다. 따라서,이 방법은 apoptosis와 ApoBD 형성의 유도 동시에 확인 하는 효율적인 기법을 보여 줍니다.
전통적으로, ApoBDs는 ApoBDs 셀 또는 밀도에 따라 다른 세포 외 소포에서 분리 될 수 있다 그것에 의하여 차별 원심 분리 방식의 다양 한 격리 되었습니다. 그러나, 이러한 원심 분리 방법은 종종 낮은 ApoBD 순수성, 샘플 순도 및 셀 형식 관련 ApoBDs17,,2122분리를 확인 정량화 단계의 부족에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리 최근 두 가지 방법, FACS 기반 및 새로운 차등 원심 분리-기반 접근 apoptosis와 샘플 순도23의 유도 확인 하기 위해 우리의 이전 설립된 흐름 cytometry 방법으로 결합 될 수 있는 개발. FACS 기반 접근을 통해 ApoBD 절연 99% 순도, 최대 ApoBDs을 풍요롭게 수 있습니다 하 고 혼합된 셀 인구, 조직 샘플 및 체액23에서 ApoBDs을 셀 유형 특정 항 체의 다양 한 결합 될 수 있다. 또한, 우리의 개정된 차등 원심 분리 방식을 보여줍니다 ApoBDs를 분리 하는 효율적인 방법 > 90% 순도23.
이 종이, 우리가 자세히 설명 apoptosis 유도, 유효성을 검사 하 고 검색 하 고 ApoBD 형성 계량 우리의 실험 절차. FACS 기반 및 차등 원심 기반 방법을 사용 하 여 ApoBD 절연 워크플로 또한 정교 하 고 비교. 대표적인 데이터 설명된 방법론 미래 ApoBD 연구에 대 한 효과적인 첨단 도구를 제공 합니다 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>세포, 예: 배양된 인간 THP-1 단핵구(클론 번호: TIB-202)</td><td>ATCC-RPMI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1640 매체</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 혼합물</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FSC</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>BD </td><td></td> Bioscience-TO-PRO-3 <td></td></tr><tr><td>요오드화물</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3는 피부, 눈 및 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 직접적인 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>10x Annexin V binding buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(15mL)</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브(1.5mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터(37 &deg; C, 5 % CO2)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>원심 분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III 유세포 분석기, FITC 및 APC 검출을위한 두 개의 레이저로 구성</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canto II 유세포 분석기, FITC 및 APC 검출을위한 두 개의 레이저로 구성</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Diva 6.1.1 소프트웨어</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 8.8.6 소프트웨어</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

검색 및 apoptotic 몸 높은 순도 절연

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Apoptotic 시체 (ApoBDs), microvesicles 및 exosomes ApoBDs 가장 큰 종류 중 하나 되 고 함께 세포 외 기 가족의 주요 회원입니다. 그것은 ApoBDs 밀매 생체 세포 통신으로 셀 정리 도움이 될 수 있습니다 제안 되었습니다. 식별 및 ApoBDs의 격리에 사용 하는 기존의 접근은 종종 정확한 정량화 및 낮은 샘플 순도의 부족에 의해 제한 됩니다. 여기, 우리는 apoptosis 유도 확인 하 고, ApoBD 형성, 검증 순도를 ApoBDs를 분리 하는 워크플로 설명 합니다. 우리 또한 약술 하 고 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 및 ApoBDs을 기반으로 하는 차등 원심 분리 접근 비교 것입니다. 또한, 고립 된 ApoBDs의 순도 확인 될 것 이다 사용 하는 이전 교류 cytometry 기반 얼룩이 지 고 분석 방법 확립. 기술된 접근을 사용 하 여 함께 찍은 THP 1 monocyte apoptosis와 apoptotic 세포 분해 했다 유도 검증, 그리고 THP 1 monocytes에서 생성 된 ApoBD 97-99%의 순수성에 고립 되었다.

여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, THP 1 monocyte apoptosis 유도 되었다 그리고 ApoBDs 탐지 되 고 고립 FACS 기반 또는 차등 원심 분리 방식 (그림 1)를 통해. 첫째, apoptosis UV 방사선에 의해 유도 되었다 및 샘플 셀 apoptotic 형태학, blebbing, apoptotic 막 돌출 형성 및 ApoBDs6의 세대를 포함 하 여 전시 하는 때 외피의 2-3 h 후 수집 된. TO-프로-3와 A5 기반 흐름 cytometry 방법은 monocyte apoptosis와 ApoBD 형성의 유도 가능한 셀, 회 저 성 세포, 초기 ApoCells, ApoCells, ApoBDs 및 파편 (그림 2)을 분리 하 여 확인을 위해 사용 되었다. 함께 찍은, 교류 cytometry 분석 ...

교류 cytometry 또는 차등 원심 분리를 사용 하 여 워크플로 검색, 계량 및 apoptotic 시체는 apoptotic 샘플 고 순도 분리 개발 된다.

검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 세포사멸체를 검출하고 고순도로 분리하는 것입니다. 세포자멸체(apoptotic body)는 혈액 유발을 돕기 위해 생성되는 세포외 소포체(extracellular vesicles)의 일종입니다. 그들은 일반적으로 직경이 1에서 5마이크로미터에 이르는 가장 큰 유형의 세포 외 물리적 가족입니다.이제 자가사멸체(apoptotic body)가 자가사멸 세포 제거(apoptotic cell clearance) 및 세포 내 통신(intracellular communication)과 같은 세포 과정을 도울 수 있다는 것이 명백해지고 있습니다. 따라서 세포사멸체를 검출, 정량화 및 분리하기 위한 정확한 방법론의 개발은 기능과 메커니즘의 개인화에 매우 중요합니다. 이 일련의 perferedments에서는 apoptotic body를 검출하고 정량화하고 apoptotic 샘플에서 분리하는 방법을 보여 드리겠습니다.파트 A, 세포사멸의 유도. THB1 단핵구와 같은 세포주에서 세포사멸을 유도하려면 먼저 세포를 채취하는 것부터 시작합니다. 세포를 계수하고 약 1,000만 개의 세포를 수집하거나 필요에 따라 수집합니다.세포사멸체 분석을 위해 1,000만 개를 권장합니다. 6개의 웰 플레이트의 웰당 200만 개의 세포를 할당합니다. UV Stratalinker 1800을 사용하여 6개의 웰 플레이트와 UV 셀에서 뚜껑을 제거합니다.제곱센티미터당 150밀리줄로 세포를 조사합니다. 이 조사에는 약 30-60초가 소요됩니다. 방사선 조사가 완료된 후 세포주에 따라 2시간에서 8시간 동안 세포를 배양합니다.이 시점에서 세포는 apoptotic blemming 및 apoptotic body formation과 같은 apoptotic 형태학을 나타내야 합니다. P1000 피펫으로 세포사멸 세포를 수집합니다. 전체 apoptotic sample control에 대해 apoptotic sample의 약 1/10을 수집합니다.또한 처리되지 않았거나 생존 가능한 샘플을 수집합니다. 3, 6 분 동안 000g에 전체적인 apoptotic 표본 그리고 처리되지 않은 표본 둘 다 분리기. PBS에 다시 매달아 얼음 위에 올려 놓습니다.자가사멸적 신체 격리의 경우 B 단계 또는 C.B, FACS를 사용한 자가사멸적 신체 격리를 계속합니다. 3, 000g에서 6분 동안 잔여 세포사멸 샘플을 원심분리한다. 남은 apoptotic 샘

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

세포 죽음의 평가에 대한 정확한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 세포 라인과 동물 모델의 광범위한 범위에서 기본 세포 40 % 허위 - 긍정적인 이벤트까지 표시 기존 Annexin V / propidium 요오드화물 (PI) 프로토콜에 따라이 향상됩니다.

세포 죽음의 정확한 평가에 대한 수정 Annexin V / Propidium 이우의 Apoptosis 분석

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

이 비디오에서는 샘플에서 세포사멸 세포의 존재를 검출하기 위해 TUNEL 분석이 수행됩니다. 이 연구는 형광 현미경으로 관찰하고 식별할 수 있는 단편화된 DNA의 3' 말단에 표지된 dUTP를 추가하는 촉매 역할을 하는 특수 DNA 중합효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하는 것과 관련이 있습니다.

Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling—TUNEL Assay: An In Situ Method to Detect DNA Fragmentation in apoptotic cells(말단 전이효소 매개 dUTP 닉 말단 라벨링—TUNEL 분석법: 세포사멸 세포에서 DNA 단편화를 검출하는 현장 방법)

이 비디오에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 세포사멸 세포의 청소를 연구하기 위한 efferocytosis assay를 시연합니다. efferocytosis는 apoptotic cell이 phagocyte에 의해 삼켜지고 efferosomes라고 하는 소포 내에서 분해되는 다단계 과정입니다. 이 프로토콜은 개별 세포사멸 세포의 내부화된 부분과 내부화되지 않은 부분을 시각화하고 efferocytosis를 정량화하는 방법을 제공합니다.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: 형광 현미경을 사용하여 대식세포에 의한 세포사멸 세포의 발포성 흡수를 연구하는 방법

멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

여기, 선물이 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 유방암 apoptotic 세포를 분리 하 고 추가 cytometry에 의해 apoptosis 반전 후 유방암 줄기 세포와 같은 세포에 유 방 비 줄기 암 세포의 전이 감지 하는 프로토콜.

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

아폽토시스는 초기 및 후기 아폽토시스 바이오마커의 유세포 분석에 의해 특성화될 수 있다. 자궁경부암 세포주인 SiHa는 벤치탑 유세포 분석기를 사용하여 Actinomycin D로 처리한 후 세포자멸사 바이오마커를 분석했습니다.

Actinomycin D-Treated SiHa 자궁경부암 세포에서 세포사멸 바이오마커의 유세포 분석

배우세요 세포사멸체를 높은 순도로 검출하고 분리하는 방법을 흐름 세포측정법과 차등 원심분리를 사용하여 세포생물학 연구에 활용하세요. 이 기술은 세포 내 신호전달 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.

검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

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