검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

이 프로토콜의 전반적인 목표는 세포사멸체를 검출하고 고순도로 분리하는 것입니다. 세포자멸체(apoptotic body)는 혈액 유발을 돕기 위해 생성되는 세포외 소포체(extracellular vesicles)의 일종입니다. 그들은 일반적으로 직경이 1에서 5마이크로미터에 이르는 가장 큰 유형의 세포 외 물리적 가족입니다.

이제 자가사멸체(apoptotic body)가 자가사멸 세포 제거(apoptotic cell clearance) 및 세포 내 통신(intracellular communication)과 같은 세포 과정을 도울 수 있다는 것이 명백해지고 있습니다. 따라서 세포사멸체를 검출, 정량화 및 분리하기 위한 정확한 방법론의 개발은 기능과 메커니즘의 개인화에 매우 중요합니다. 이 일련의 perferedments에서는 apoptotic body를 검출하고 정량화하고 apoptotic 샘플에서 분리하는 방법을 보여 드리겠습니다.

파트 A, 세포사멸의 유도. THB1 단핵구와 같은 세포주에서 세포사멸을 유도하려면 먼저 세포를 채취하는 것부터 시작합니다. 세포를 계수하고 약 1,000만 개의 세포를 수집하거나 필요에 따라 수집합니다.

세포사멸체 분석을 위해 1,000만 개를 권장합니다. 6개의 웰 플레이트의 웰당 200만 개의 세포를 할당합니다. UV Stratalinker 1800을 사용하여 6개의 웰 플레이트와 UV 셀에서 뚜껑을 제거합니다.

제곱센티미터당 150밀리줄로 세포를 조사합니다. 이 조사에는 약 30-60초가 소요됩니다. 방사선 조사가 완료된 후 세포주에 따라 2시간에서 8시간 동안 세포를 배양합니다.

이 시점에서 세포는 apoptotic blemming 및 apoptotic body formation과 같은 apoptotic 형태학을 나타내야 합니다. P1000 피펫으로 세포사멸 세포를 수집합니다. 전체 apoptotic sample control에 대해 apoptotic sample의 약 1/10을 수집합니다.

또한 처리되지 않았거나 생존 가능한 샘플을 수집합니다. 3, 6 분 동안 000g에 전체적인 apoptotic 표본 그리고 처리되지 않은 표본 둘 다 분리기. PBS에 다시 매달아 얼음 위에 올려 놓습니다.

자가사멸적 신체 격리의 경우 B 단계 또는 C.B, FACS를 사용한 자가사멸적 신체 격리를 계속합니다. 3, 000g에서 6분 동안 잔여 세포사멸 샘플을 원심분리한다. 남은 apoptotic 샘플에서 상등액을 제거합니다.

남은 세포사멸 시료를 nexum 550 및 topo 3 staining이 포함된 염색 용액에 실온에서 어두운 곳에서 10분 동안 현탁합니다. 원심분리 후 FACS 버퍼에 다시 현탁한 다음 70미크론 셀 스트레이너를 통해 필터링하여 세포가 효율적으로 분리되도록 합니다. FACS 시스템의 표준 설정을 수행합니다.

전체 apoptotic 샘플을 획득하고 전압 설정을 변경하여 모든 이벤트가 FACS 봇 내에 있고 집단을 쉽게 분리할 수 있도록 합니다. 나중에 flow cytometry gating strategy 섹션에 설명된 대로 게이팅 전략을 설정합니다. gated apoptotic body population과 collected for collection을 위한 apoptotic body의 원하는 수를 선택합니다.

초기 정렬을 수행하여 정렬 설정과 apoptotic body purity를 확인합니다. 정렬을 수행한 후 시스템 블랙 플러시를 수행하고 정렬된 샘플을 다시 분석합니다. 높은 순도에 도달하면 원하는 수의 apoptotic body를 계속 분류합니다.

분류가 완료되면 프로 분류 apoptotic body 샘플의 작은 부분을 채취하여 다시 분석하여 순도를 확인합니다. 파트 C, 차등 원심분리를 통한 세포사멸 신체 분리. 남은 세포사멸 샘플을 300g에서 10분 동안 원심분리합니다.

이 원심분리 단계는 상층액에 남아 있는 작은 세포외 소포체에서 세포사멸세포, 생존 세포 및 괴사 세포를 포함한 세포를 분리합니다. 새로운 매 튜브에서 세포 외 소포를 포함하는 상층액을 수집합니다. PBS에서 apoptotic 농축 파벌을 다시 매달고 처리되지 않은 전체 apoptotic 샘플과 함께 얼음 위에 따로 보관합니다.

수집된 상등액을 세포사멸체를 포함하는 3, 000g에서 20분 동안 원심분리한다. 더 작은 세포외 소포를 포함하는 상등액을 제거하고, 자가사멸체를 포함할 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. PBS에 apoptotic body를 다시 현탁시키고 처리되지 않은 전체 apoptotic 샘플, 농축된 apoptotic cells 및 apoptotic bodies 농축 샘플과 nexum five 및 topo 3 staining solution으로 염색된 각 100마이크로리터를 수집합니다.

유세포 분석을 수행하기 전에 실온에서 10분 동안 어둠 속에 서 있습니다. 배치된 게이팅 전략에 설명된 대로 분석합니다. 파트 D, 유세포 분석 게이팅 전략.

유세포 분석을 시작하려면 topo 3과 4를 함께 비교하여 topo three 고괴사 세포를 다른 모든 이벤트와 분리합니다. 비투과성 이벤트에서 다음 게이트를 수행합니다. 비투과성 이벤트를 선택하고 측면 산란과 넥섬 5를 비교합니다.

side scatter middle in high, nexum five low to intermediate cell을 포함한 2개의 모집단을 선택합니다. 이 모집단은 P1입니다. 또한 다른 모든 이벤트를 포함하는 두 번째 모집단을 만듭니다. 이 모집단은 P2입니다. P1은 생존 가능한 세포와 초기 세포사멸 세포를 포함합니다.

P2에는 모든 자가사멸 이벤트와 파편이 포함됩니다. 추가 게이팅을 위해 P2를 선택합니다. P2에서 topo 3 verse a nexum five를 비교하여 모든 파편을 제거합니다.

넥섬 5개 중급 및 상위 이벤트를 모두 선택합니다. 이 집단에는 이제 모든 자가사멸체와 자가사멸 세포가 포함됩니다. 이 모집단을 선택합니다.

세포사멸체(apoptotic body)와 세포사멸체(apoptotic body)를 분리하려면 완전 산란(full scatter)을 넥섬 5(nexum five)와 비교하십시오. apoptotic bodies를 선택하려면 full scatter low를 선택합니다. apoptotic cells를 선택하려면 full scatter intermediate to high events를 선택합니다.

FACS에 의한 apoptotic body isolation을 수행할 때 apoptotic body fraction을 선택하고 topo three verse a nexum five로 확인하여 최종 게이팅 전략을 수행하는 것이 좋습니다. 모든 이벤트를 선택합니다. 이는 전체 산란 및 측면 산란 속성이 아닌 형광을 기반으로 게이트 전략을 선택하여 정렬 정확도를 높이는 데 사용됩니다.

생존 가능한 세포를 식별하려면 P1 집단으로 돌아가십시오. 일반적인 생존 세포 분석의 경우 P1을 선택하고 전체 산란을 nexum five와 비교합니다. 중간에서 상위 셀까지의 모든 전체 산란 셀을 선택합니다.

여기에는 모든 생존 가능한 세포가 포함되어 남아 있는 파편을 제거합니다. 또는 보다 심층적인 세포사멸 분석을 위해 생존 가능한 세포와 초기 세포사멸 세포를 분리할 수 있습니다. 이를 위해 topo three verse full scatter를 비교하십시오.

생존 가능한 세포는 topo 3 낮고 전체 산란 중간에서 높음입니다. 초기 세포사멸 세포는 중간 topo 3 염색을 포함합니다. 그런 다음 이 전체 게이팅 전략을 분석 중인 모든 샘플에 적용할 수 있습니다.

예를 들어, FACS 후에 분리된 세포사멸체의 경우. 모든 샘플에 게이팅 전략을 적용합니다. 그런 다음 Apoptotic body purity를 준비할 수 있습니다.

예를 들어, 넥섬 5개의 양성 모집단만 선택하여 완전 산란과 넥섬 5를 비교합니다. 따라서 이것은 격리 후 세포사멸체를 보여줍니다. 대표적인 결과.

세포사멸(apoptosis) 유도를 확인하기 위해 유세포 분석 분석을 수행했습니다. 이 게이팅 전략을 통해 UV 조사 샘플에서 생존 가능한 세포, 초기 세포사멸 세포, 후기 세포사멸 세포 및 괴사 세포를 식별할 수 있습니다. 이 방법론은 두 가지 접근 방식으로 apoptotic body의 격리를 보여주었습니다.

첫째, FACS 기반 접근법은 apoptotic body가 99% 순도로 농축된 것이고, apoptotic body는 97% 순도로 분리되는 차등 원심분리 접근법입니다. 이는 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 확인되었으며, 여기서 세포사멸체(apoptotic body)는 생존 세포(viable cells), 세포사멸세포(apoptotic cells) 및 괴사(necrotic)를 포함한 세포로 분리되었습니다. 결론. 우리의 접근 방식은 세포사멸 및 자가사멸체 연구를 위한 새로운 도구를 제공할 수 있습니다.

따라서 이러한 메커니즘의 개인화에 대한 발전에 기여하고 이러한 프로세스를 대상으로 하는 새로운 개발을 생성하는 데 도움이 됩니다.