Name: 비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 비방사성 L-azidohomoalanine 라벨링을 활용한 일차 마우스 간세포 분리 및 신생 단백질 합성 분석 방법을. 이 기술은 비만, 비알코올성 지방간 및 제2형 당뇨병의 간 대사 질환 연구에 활용됩니다.

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우리가 그들의 과학적인 입력 및 토론에 대 한 박사 Joonbae 서 장 훈과 비비 안 화 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) (R01DK107530)에 의해 지원 되었다. T.N. 일본 과학과 기술 기관에서 프레스 토에 의해 지원 되었다. 이 연구의 일부는 소화 질병 연구 핵심 센터 신시내티에 대 한 NIH (P30DK078392)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에는 실험실 쥐를 사용 하 여를 포함 되어 있습니다. 동물 관리 및 실험 절차는 신시내티 아동 병원 의료 센터의 동물 보호 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1입니다. 기본 마우스 Hepatocytes의 격리
<ol><li>사전 격리 준비<ol>
<li>표 1 및 4 ° C (15 mL/마우스)에서 계속에 설명 된 대로 40% 밀도 그라데이션 버퍼의 450 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>표 1 에 설명 된 대로 윌리엄스 매체의 500 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 계속</li>
		<li>표 1 에 설명 된 대로 DMEM의 500 mL를 준비 하 고 얼음 (30 mL/마우스)에 계속.</li>
		<li>표 1 과 물 탕 (40 mL/마우스)에서 42 ° C에서 유지에 설명 된 대로 HBSS (-) 버퍼의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>물 목욕에서 42 ° C에서 30 분 외피와 함께 표 1 에 설명 된 대로 HBSS (+) 0.3 mg/mL와 버퍼의 500 mL 콜라 유형 X 준비 (40 mL/마우스).</li>
		<li>래칭 발 페달에 걸쳐 정 맥 (테타) 관리 튜브를 배치 하 여 및 기포 없이 솔루션을 내 뿜 기의 흐름을 확인 하 여 재 관류 펌프를 설정 합니다.</li>
		<li>워밍업-42에서 튜브 히터° c.</li>
		<li>진정 4 ° c 원심 분리기 기계</li>
	</ol>
</li>
	<li>마 취와 관류<ol>
<li>작업 영역 및 펌프 청소.</li>
		<li>철저 하 게 10 분 동안 70% 에탄올을 실행 하 여 펌프 연결 IV 관을 씻어.</li>
		<li>10 분 동안 완전히 DDW와 rinsing 하 여 펌프 연결 4 관에서 잔여 에탄올을 제거 합니다.</li>
		<li>70% 에탄올과 집게와가 위를 닦아냅니다.</li>
		<li>플라스틱 용기와 직접 접촉을 피하기 위해 메쉬 밑 2 mL isoflurane 젖은 거 즈 메쉬 바닥에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>엉덩이 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 의해 마 취의 깊이.</li>
		<li>마 취의 원하는 깊이 도달 하면 마우스를 제거 합니다. 참고: 마 취 유도 시간의 1 분 이상 수 없습니다.</li>
		<li>코 콘 1 mL isoflurane 젖은 패드는 튜브의 끝에 15 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여 구성 합니다.</li>
		<li>가까이 또는 마우스 콧구멍에서 코 콘을 이동 하 여 마 취의 깊이 제어 합니다.</li>
		<li>복 부 면이 위로 향하도록 작업 플랫폼에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>마우스의 복 부 지역에 70% 에탄올을 스프레이 한 다음 이빨된 집게 날카로운가 위를 사용 하 여 진 피와 복 막의 큰 가로 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다.</li>
		<li>모든 복 부 장기는 날카로운가 위 이빨된 집게를 사용 하 여 완전히 노출 될 때까지 다음, 복 층의 수직 컷을 확인 합니다.</li>
		<li>작은 이동 및 압력가 면 팁까지 간, 문맥, 그리고 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 마우스의 왼쪽을 향해 큰 창 자 명확 하 게 노출 됩니다.</li>
		<li>24 G 카 테 터에 삽입 IVC 오른쪽 신장 정 맥을 분기에 신중 하 게 IVC 및 출혈의 부상을 피하기 위해 악수 하지 않고. 참고: 경우 출혈 IVC로 카 테 터를 삽입 하는 동안, 그럼 당신은 하려고 한다 포털 정 맥에 새로운 카 테 터를 삽입.</li>
		<li>카 테 터의 바늘을 제거 하 고 IVC, 아웃 되지 않도록 정 맥의 위치 제어 다음 24 G 정 관류 튜브 커넥터를 사용 하 여 연결. 참고:은 재 관류를 시작 하기 전에 공기 방울의 존재를 피하십시오.</li>
		<li>4 mL/min의 유량에 따뜻한 HBSS (-)와 함께 간의 관류를 시작 하 고 신속 하 게가 위를 사용 하 여 내부 혈액 밖으로 배출 하는 비장 정 맥을 잘라. 참고:는 cannulation 성공적 이면 간 간 맥 IVC에서 버퍼의 혈 류 분포 때문에 희게 시작 됩니다. 포털 정 맥 비장 하 고 우수한 mesenteric 정 맥;의 조합에 의해 형성 된다 따라서, 그것은 이후 큰 간에서 원심 비장 정 맥을 잘라 꽤 안전입니다.</li>
		<li>계속 따뜻한 HBSS (-)의 35 mL를 관류 한다. 참고: 간이이 단계에서 경우는 관류, 적절 한 색상과 마우스 마 취에서 아직 살아 창백 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 및 추출<ol>
<li>HBSS (+)의 따뜻한 35 mL와 4 mL/min의 유량에 콜라 유형 X를 포함 한 마우스 간 perfuse</li>
		<li>몇 분 마다 10 ~ 집게를 사용 하 여 비장 정 맥을 클램프 HBSS 간 모든 해 부 부분으로 확산 (+)의 전체 볼륨을 허용 하는 s. 참고: 간 버퍼 정체로 인해 비장 정 맥을 클램핑 후 팽창 하기 시작 합니다.</li>
		<li>100 mm 페 트리 접시 관류 프로세스의 끝에에 콜라 종류 x 준비 따뜻한 HBSS (+)의 5 mL를 붓으십시오.</li>
		<li>간으로 혈액의 역류를 방지, 집게, 여 쓸 개를 제거 하 고 혈액을 제거 하려면 종이 타월로 부드럽게 간 다음 닦아 펌프를 중지 하기 전에 시체의 나머지 부분에서 perfused 간 차단.</li>
		<li>준비 된 따뜻한 HBSS (+)의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 간 전송 하 고 똑바로 밀고 집게를 사용 하 여 부드럽게 간 캡슐을 제거 합니다. 참고: 간 캡슐 그 간 둘러싼 결합 조직의 얇은 층 이다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여이 신중 하 게 분산 parenchymal 조직. 15 mL을 추가 찬 DMEM 배양 접시에. 참고: 매체가 바뀝니다 흐린 parenchymal 세포 인 간 잘 소화 하는 경우.</li>
		<li>찢어진된 간 매체에 잔여 parenchymal 세포를 추가 하는 또 다른 15 mL를 부드럽게 흔들어 세포의 나머지를 페 트리 접시에 차가운 DMEM.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브로 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 녹은 간 DMEM 전송 및 얼음에 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정화<ol>
<li>60 x g 4 ° C에서 2 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 신중 하 게는 상쾌한 진공 포부에 의해 제거 하 고 10 ml DMEM 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>40% 밀도 그라데이션 버퍼, 위에 얇은 층으로 resuspended 펠 릿을 추가 하 고 4에서 800 g x 브레이크 없이 10 분에 원심° c.</li>
		<li>하위 레이어의 하지 하지만 상쾌한 상위 레이어 (DMEM) 등 중간 레이어 (죽은 또는 비 parenchymal 세포)를 조심 스럽게 제거 (펠 렛: 기본 parenchymal hepatocytes).</li>
		<li>2-3 mL 윌리엄의 중간 e, 1 차 셀을 resuspend 하 고 튜브의 벽에서 죽은 세포의 오염을 피하기 위하여 새로운 50 mL 튜브에 전송.</li>
		<li>7-8 mL 윌리엄의 매체 E를 추가 하 고 부드럽게, 혼합 하 고, 4 ° c.에 1 분 동안 800 x g에서 원심</li>
		<li>진공 포부에 의해 상쾌한을 조심 스럽게 제거 하 고 다시 윌리엄의 매체 E (에 따라 펠 릿의 크기)의 10, 20 또는 30 mL와 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산.</li>
		<li>윌리엄의 매체 E와 종자, 37에서 인큐베이터에 접시를 계속° C 2-3 h는 다음 매체 with10% FBS DMEM 매체 대체 방지 죽 었 거 나 부착 되지 않은 세포를 제거 하 고 37 ° c.에 야간 보육에 대 한</li>
		<li>다음 날, 주 마우스 hepatocytes 실험적인 사용을 위해 준비 되어 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 분석 결과 초기 단백질 합성의 검출에 대 한
<ol><li>신진 대사 라벨<ol>
<li>(전처리) 37 ° C 따뜻한 PBS 가진 기본 hepatocytes를 두번 세척 하 고 세포질 메티오닌 고갈 30 분 메티오닌 무료 DMEM 매체 보유 추가. 참고: L-Azidohomoalanine, 아미노산은 메티오닌을 아날로그, 통합 될 수 있는 단백질으로 세포 단백질의 생 합성 중 세포질 메티오닌의 고갈 먹이 향상 시킬 것입니다 그렇게 azido moiety 및 법인 포함 L-Azidohomoalanine 교양된 기본 hepatocytes의 새로 합성된 단백질으로.</li>
		<li>(치료) 37 ° c 워시 기본 hepatocytes PBS를 두 번 따뜻하게 하 고 4-6 h 25 μ M AHA (L-Azidohomoalanine)와 메티오닌 무료 DMEM 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>초기 단백질 표정 수준에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 아 하의 존재에 4-6 h에 대 한 매체에서 어떤 특정 화학 물질 (즉, 10 μ M로 테 논) 추가 합니다.</li>
		<li>부 화, 후 진공 포부에 의해 매체를 제거 하 고 씻어 차가운 PBS 가진 기본 hepatocytes 세 번.</li>
		<li>접시 200 μ 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 얼음에 15-30 분 동안 품 어 다음 접시를 기울기 하시고 전체 세포 lysate 1.7 mL 튜브에 하십시오. 참고: 당신은 그 세포 lysate 셀 수확 하는 동안 매우 끈 적는 관찰 해야 한다.</li>
		<li>5 얼음에 세포 lysate를 sonicate 세 번 프로브 sonicator solubilize 단백질 및 DNA 분산 사용 하 여 s.</li>
		<li>소용돌이 5 분, lysate 셀 세포 lysate에서 21,130 x g 4 oC에서 10 분 원심 하 고 맑은 상쾌한 새로운 튜브로 전송. 두 번 단백질 농도 측정 합니다. 참고:이 단계에서 단백질 견본 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 2 주 동안 그들은 즉시 사용 하지 않는 경우.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아 지 드 수정 초기 단백질 라벨<ol>
<li>60 μ의 구성 요소 (A) (B)를 추가 하 여 구성 요소 (A + B)를 준비 합니다. 참고: 솔루션 (A)를 (B) 구성 요소를 추가한 후 색상에서 밝은 분홍색으로 변합니다.</li>
		<li>버퍼 (D)와 (E)에 따라 준비 하는 프로토콜.</li>
		<li>20-40 μ g 세포 lysate 고 추가 반응 버퍼 x 50 μ 2 (구성 요소 A + B), 다음 DDW 5 소용돌이 추가 하 여 80 μ에 볼륨 조정 s.</li>
		<li>추가 5 μ CuSO4 (구성 요소 C), 그리고 5와 동 s.</li>
		<li>5 μ 반응 버퍼 첨가제 1 (갓된 구성 D), 그리고 5 s 소용돌이 3 분 대기를 추가 합니다.</li>
		<li>10 μ 재구성 반응 버퍼 첨가제 2 (전자 부품), 5 s에 대 한 다음 소용돌이 및 다중 회전 기계를 사용 하 여 4 ° C에서 20 분에 대 한 회전 예제를 추가 합니다. 참고: 솔루션 구성 요소 (E)를 추가한 후 밝은 오렌지 컬러로 바뀝니다. 샘플은 회전 하는 동안 빛 으로부터 보호 되어야 한다.</li>
		<li>추가 300 μ 메탄올과 소용돌이 5 s, 75 μ 클로 프롬 및 5 소용돌이 추가 s, 다음 200 μ DDW와 5 소용돌이 추가 s.</li>
		<li>21,130 g x 4에서 샘플 원심° C 5 분, 다음 수성 상쾌한 삭제 하 고 펠 릿을 유지.</li>
		<li>250 μ 메탄올 튜브, 소용돌이, 그리고 21,130 x g. 에서 5 분 동안 다시 스핀에 추가
</li>
		<li>상쾌한, 삭제 후 보풀 조직으로 샘플을 커버 하 고 실 온에서 15 분 동안 건조를 펠 릿을 허용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>페이지 분석 및 서 부 럽<ol>
<li>10 분 동안 열 블록을 사용 하 여 버퍼 없이 β-mercaptoethanol, 10 분 동안 소용돌이, 70 ° C에서 열 로드의 20 μ에 펠 릿 solubilize 그런 다음 Tetramethylrhodamine (TAMRA) 탐지에 대 한 10 %SDS 젤 (1.5 m m)로 샘플을 로드.</li>
		<li>초기 단백질의 정확한 정량에 대 한 가변 모드 레이저 스캐너를 사용 하 여 AHA 신호를 감지 합니다.</li>
		<li>15 분 동안 DDW와 젤을 씻어.</li>
		<li>그런 다음 컨트롤으로 총 단백질을 검출 하기 위하여 15-60 분에 대 한 빠르고 민감한 coomassie 염료 시 약 10 %SDS 젤 얼룩.</li>
		<li>제 1-2 h DDW와 젤 얼룩 하 고 UV 형광 영상 장치를 사용 하 여 이미지를 획득.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자 들은 관심의 없습니다 충돌을 나타냅니다.

비록 여러 불멸 하 게 간 셀 라인 제안 되 고 간 기능49,50,,5152를 조사 하는 데 사용, 이러한 세포 일반적으로 중요 하 고 근본적인 부족 알 부 민 (그림 3)의 식 등 정상적인 hepatocytes의 기능. 그것은 널리 인식, 따라서 기본 hepatocytes 활용 하는 것이 간 생리학, 문화, 경작 하 고 이러한 세포의 유지의 전에 불구 하 고 신진 대사 검사를 위한 중요 한 옵션입니다. 여기, 우리의 연구는 상대적으로 편리 하 고 효율적인 방식으로 2 단계 콜라 메서드를 수행 하 여 기본 마우스 hepatocytes의 성공적인 절연을 자세히 설명 합니다. 이러한 절차를 통해 문화 안에 고립 된 기본 hepatocytes의 대부분 그...

단백질 중요 한 영양 요소 이며 인체의 건조 중량의 약 50%는 여러 생물 학적 특성과 기능1단백질으로 구성 되어 있습니다. 따라서, 단백질 합성은 대부분 에너지 소모 이벤트 중 하나 이며 단백질 대사에 변경 매우 개발과 관련 된 대사 질환2,,34를 포함 하 여 질병의. 총 에너지 소비5,6의 약 20-30%는 간 단백질 생 합성을 차지 하 고. 또한, 단백질 기능 뿐만 아니라 수동 또는 빌딩 블록 또한 활성 신호를 중재 요인 하지만 간 침으로 또는 extracellularly7조직 물질 대사 조절 한다. 혈 청 알 부 민, 합성 고 간 및 플라즈마8에서 가장 풍부한 단백질 분 비의 감소 된 수준 2 형 당뇨병 개발9,10, 의 위험을 증가 하는 예를 들어, 11, 높은 혈 청 알 부 민 농도 변화 증후군12개발에 대 한 보호. 또한, 방해 또는 분 비 또는 막 도약 간장 단백질, 지 단백질, LDLR, 및 LRP1를 포함 하 여 콜레스테롤 항상성 조절의 인슐린 저항, 고 지 혈 증, 또는 동맥 경화 증의 발전으로 이어질 수 있습니다. 13. 따라서, 간 및 그것의 관련된 대사 합병증에 단백질 대사 장애에 관련 된 분자 pathophysiological 메커니즘의 식별에 유용할 수 있습니다 소설 약리 발견 발병 지체 또는 인슐린 저항, 당뇨병, 비알코올 지방 간 등 대사 질환 치료에 접근 한다.
단백질 합성 세포 에너지 상태에 밀접 하 게 연결 (예를들면, 단백질 합성의 신장 단계 동안 한 펩 티 드 결합의 형성 필요 4 phosphodiester 채권14) 분자 경로 감지 하 여 규제 인테르-와 intra-cellular 양분 가용성15,16. AMP 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (AMPK) 에너지 항상성17유지 세포내 에너지 센서 중 하나입니다. AMPK는 세포 에너지 레벨 낮은 될 때 활성화 됩니다, 일단 AMPK 및 그 타겟된 기판 catabolic 경로 자극 하 여 단백질 합성18,19를 포함 하 여 동화 작용 과정을 억제 기능. 단백질 합성의 규칙은 여러 번역 요인과 ribosomal 단백질20의 인 산화에 의해 중재 됩니다. 메모의 포유류의 대상이 rapamycin 복잡 한 1 (mTORC1), 단백질 합성의 주요 드라이버 AMPK21의 주요 목표 중 하나입니다. MTORC1 통로의 활성화는 자극 단백질 번역과 autophagy20,21여 세포 성장과 확산을 향상 시킵니다. 따라서, AMPK의 활성화가 중재 하는 mTORC1 단백질 합성22를 억제할 수 있는 논리적 이다. 사실, AMPK의 활성화 중화 하 고 직접 트레오닌 잔류물 2446 (Thr2446)의 비활성화23 및 단백질 생 합성24의 억제에 mTORC1 phosphorylates. 또한, AMPK 수 직접 억제 하지 인 산화 그리고 활성화의 결 절 경화 증 복합 2 (TSC2)25 mTORC1 신호 폭포의 상류 레 귤 레이 터는 mTORC1 기능. 즉, 이러한 경로에 dysregulation 종종 대사 질환의 발전에 연결 되어, 따라서 에너지의 규정에 이러한 통로의 역할을 조사 하기 위해 효과적인 실험 도구를 설치 하는 중요 한 필요 하 고 hepatocytes에 단백질 대사입니다.
고립 된 기본 hepatocytes의 기능적 속성과 vivo에서 hepatocytes 보다 생체 외에서 간 파생 셀 라인26,,2728와 사이 강한 유사성이 있다. 그것은 보였다 주 인간의 hepatocytes 간 biopsies의 77% 유사성을 공유 HepG2 세포를 잘 분화 된 간 암 세포는 간 기능을 조사 하기 위해 널리 사용 되의 맥락에서 48% 미만 표시 하는 반면 유전자 발현29프로필. 따라서, 불멸 하 게 문화 셀, 보다는 오히려 기본 hepatocytes, 활용의 중요 간 기능과 생리학, 조사 이며 여러 프로토콜 분리와 기본 hepatocytes의 문화에 대 한 사용할 수 있습니다. 특히 쥐30,31에서 쥐 hepatocytes 셀의 상대적으로 높은 수익률으로 유용한 동안, 마우스 hepatocytes 유전자 변조 된 쥐의 넓은 가용성 때문에 많은 과학적 측면에서 큰 잠재력을 있다. 그러나, 세포 및 분자 기반 평가 대 한 마우스에서 건강 하 고 풍부한 기본 hepatocytes 격리에 여러 기술 도전이 있다: 첫째, 버퍼 시 약으로 간 perfuse에 캐 뉼 러 삽입은 매우 처리 하기 어려운 작고 얇은 마우스 문맥 또는 열 등 한 베 나 정 맥; 둘째, 격리 하는 동안 세포의 더 긴 조작 시간을 일으킬 수 있습니다 감소 셀 수량 및 품질; 셋째, 효소 비 기계적 분리 방법 심각한 손상 하 고 가능한 격리 기본 hepatocytes32,33의 낮은 수익률을 생산할 수 있습니다. 1980 년대, 콜라 관류 기술 hepatocytes 동물34의 간은에서 격리 하기 위한 도입 되었습니다. 이 메서드는 간35,,3637, 칼슘 chelator 솔루션38,39, 효소 소화와 간 주입의 콜라 관류에 기반 하 고 간 실질35의 기계적 분리. 첫 번째 단계에서 마우스 간은 칼슘 [Ca2 +] 무료 버퍼를 포함 하는 [캘리포니아2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic 산, EDTA) 끼얹는다. 두 번째 단계에서 마우스 간 세포-기질 상호 작용은 하 콜라 포함 된 버퍼와 함께 끼얹는다는. 1 단계에서 사용 되는 버퍼와는 달리 [캘리포니아2 +] 두 번째 단계의 버퍼에서 이온의 존재는 효과적인 콜라 활동, 후 소화 간 더 부드럽게 그리고 기계적으로 분리 될 사이 집게를 사용 하는 필요는 간장 캡슐 그리고 parenchymatous 조직입니다. 마지막으로, 결합 조직, 필터링 하 여 제거 되 고 후속 원심 분리 가능한 hepatocytes에서 모두 비 parenchymal 세포 및 비-생활 hepatocyte 밀도 그라데이션 버퍼40,41 사용 42. 현재 연구에서 우리는 기본 hepatocytes에서 단백질 합성의 분석에 대 한 마우스 간 격리 수정된 2 단계 콜라 관류 기술을 보여줍니다.
단백질의 radiolabeling 널리 이용 된다 계량 식 레벨, 이직 률, 방사능44의 탐지의 높은 감도 때문에 단백질43 의 생물 분포 결정 하. 그러나, 방사성 동위 원소를 사용 하 여 매우 제어 연구 상황 및 절차45를 요구 한다. 다른 비 방사능 방법 개발 되었습니다 하 고 점점 더 인기를 얻고 있다. Tetramethylrhodamine (TAMRA) 단백질 검출 방법으로 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 그들 중 하나 이며 사이 아 지 드와 alkyne 그룹46와 같은 휴대 전화 이벤트를 분석 하는 이용 될 수 있는 선택적 항 암 치료 반응에 따라 초기 단백질 합성 및 glycoproteins 수정 아 지 드 그룹의 하위 클래스를 감지 합니다. 초기 단백질 합성에 대 한 L-Azidohomoalanine (L-아 하, 아 지 드 수정 아미노산) 수 metabolically 단백질에 통합 되며 TAMRA 단백질 검출 방법47를 사용 하 여 감지. 기본 마우스 hepatocytes에서이 분석 결과 사용 하 여 우리 초기 단백질 합성 속도 미토 콘 드리 아에서 ATP의 가용성에 밀접 하 게 연결 되어 표시 및 AMPK 활성화 (그림 1).
요약 하자면, 기본 마우스 hepatocytes의 활용 조사 단백질 및 에너지 대사에 중요 한 이며 초기 단백질 합성 측정 경로 개발에 관련 된 생리 적 역할에 대 한 통찰력을 확보 하는 데 유용 하 고 hepatocyte 관련 된 질병의 치료입니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES 완충액</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (&beta; - 아미노 에틸 에테르) -테트라 아세트산</td><td>AmericanBio</td><td>AB00505-00025</td><td></td></tr><tr><td>항생제 - 항진균제 (100x)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x) 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드</td><td>Gibco 없음</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물(CaCl2.2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>밀도 구배 완충액</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 저포도당, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>1897141</td><td></td></tr><tr><td>Williams 매체 E, 글루타민 없음</td><td>Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 X</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>Industries 039-17864</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S</td><td>장비</td></tr><tr><td>IV 관리 세트</td><td>EXELINT</td><td>29081</td><td>장비</td></tr><tr><td>A 수조</td><td>REVSCI</td><td>RS-PB-200</td><td>장비</td></tr><tr><td>튜브 히터</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td>장비</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Lab, Inc</td><td>0-39613</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>PHOENIX</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 코튼 팁</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>커넥터 (남성 Luer Lock Ring)</td><td>Cole-Parmer 기기</td><td>EW-4551807</td><td></td></tr><tr><td>24G 카테터</td><td>TERUMO</td><td>Surflo 24Gx3/4'100</td><td></td></tr> <tr><td>&mu; m 필터 (셀 스트레이너)</td><td>VWR</td><td>10199-658</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 바닥 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 바닥 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>화학선택적 결찰 반응 단백질 분석 검출 키트, TAMRA ALKYNE</td><td>Invitrogen</td><td>C33370</td><td></td></tr><tr><td>AHA (L-azidohomoalanine)</td><td>Invitrogen</td><td>C10102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (methionine free)</td><td>Gibco</td><td>21013024</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystine Dihydrochloride</td><td>SIGMA</td><td>C2526</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli sample buffer</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>SIGMA</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (20%)</td><td>BioRad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (1M)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB14044-01000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>SIGMA</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>단백질 농도 측정 키트(Bovin Serum Albumin-BSA)</td><td>BioRad</td><td>500-0207</td><td></td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 플레이트</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>디지털 히트블록</td><td>VWR</td><td>12621-092</td><td>장비</td></tr><tr><td>다중 회전 장치</td><td>Grant-bio</td><td>PTR-60</td><td>장비</td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>Cole-Parmer</td><td>GE130PB</td><td>장비</td></tr><tr><td>표준 헤비 듀티 볼텍스 믹서</td><td>VWR</td><td>97043-566</td><td>장비</td></tr><tr><td>가변 모드 레이저 스캐너</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>FLA 9500</td><td>장비</td></tr><tr><td>Coomassie-dye 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>24594</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>장비</td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅 장치</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td>장비</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>장비</td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>BioRad</td><td>TC20</td><td>장비</td></tr><tr><td>FluorChem R 시스템</td><td>proteinsimple</td><td>-</td><td>장비</td></tr><tr><td>p-Ampka (T172) 항체</td><td>세포 신호 전달</td><td>2535</td><td></td></tr><tr><td>Total-AMPK 항체</td><td>세포 신호</td><td>5832</td><td></td></tr><tr><td>알부민 항체</td><td>세포 신호</td><td>4929</td><td></td></tr><tr><td>beta actin 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-130656</td><td></td></tr><tr><td>가는 가위와 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비 방사성 l-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 hepatocytes의 절연

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes 간 parenchymal 세포 고 합성 및 조직의 에너지 항상성에 필수적인 단백질의 분 비를 포함 한 여러 대사 기능을 갖습니다. 기본 hepatocytes murine 간에서 고립 된 간에서 발생 하는 변경 또는 기능 속성을 이해 하는 귀중 한 생물 도구를 구성 합니다. 여기 우리는 2 단계 콜라 관류 기법을 수행 하 여 기본 마우스 hepatocytes의 문화와 격리 하는 방법을 설명 하 고 단백질 대사 조사에 대 한 그들의 사용을 토론. 성인 마우스의 간은 순차적으로 에틸렌 글리콜-두번째 tetraacetic 산 (EGTA)와 콜라, hepatocytes 밀도 그라데이션 버퍼의 다음 끼얹는다. 이러한 격리 hepatocytes 문화 접시에 가능한 고 hepatocytes의 부여 특성의 대부분을 유지 한다. 이러한 hepatocytes 단백질 대사 비 방사성 시 약으로 초기 단백질 합성 등의 평가 대 한 사용할 수 있습니다. 우리는 격리 hepatocytes 쉽게 제어 하 고 구성 하는 단백질 합성 Tetramethylrhodamine (TAMRA) 단백질으로 항 암 치료-선택적 결 찰 반응을 이용 하 여 에너지 대사에 연결의 높은 품질과 볼륨 안정성을 보여 탐지 방법 그리고 서쪽 더 럽 히 분석입니다. 따라서,이 방법은 간 초기 단백질 합성에 에너지 항상성 연결을 조사 하는 데 유용 합니다. 다음 프로토콜 재료와 높은-품질 기본 마우스 hepatocytes의 격리 및 초기 단백질 합성의 검출을 위한 방법을 설명합니다.

기본 마우스 hepatocytes 격리 약 20 x 106 총 셀/마우스의 수율에서 결과. 조직학, 라이브 및 연결 된 기본 hepatocytes 표시 다각형 또는 전형적인 육각형 모양에 명확 하 게 설명 막 경계 후에 24 시간 보육 (그림 2).
고립 된 세포 주 hepatocytes 인지를 확인 하려면 우리는 고립 된 기본 마우스 hepatocytes (PMHs), 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), 마우스는 셀 라인 (Hepa 1-6), 및 마우스 간은 알 부 민 단백질의 표현 수준 비교. 알 부 민 단백질 식 기본 마우스 hepatocytes에 마우스 간을 검색 되었습니다 하지만 MEFs 또는 Hepa에 감지 했다 1-6 셀 (그림 3<...

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

이 방법은 비만, 무알코올 지방 간 및 타입-2 당뇨병에 있는 간 에너지 및 단백질 생합성의 분자 변경에 관하여 각종 신진 대사 질병 연구 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기능성 1 차 마우스 간세포및 검출 간 초기 단백질의 분리를 비방사성 라벨기판을 통해 용이하게 한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 크고 얇은 마우스 혈관 때문에 관류 단계가 배우기 어렵기 때문에 중요합니다.간 관류의 경우, 오른쪽 신장 정맥으로 분기시 열등한 베나 카바 또는 IVC에 24 게이지 카테터를 조심스럽게 삽입하십시오. IVC 내의 캐뉼라 위치를 유지하는 카테터 바늘을 제거하고 커넥터를 사용하여 24 게이지 캐뉼라를 관류 튜브와 연결합니다. 4 밀리 리터 영구 유량에서 마이너스 따뜻한 HBSS와 간 을 perfusing 시작 신속 하 게 내부 혈액을 배출 하는 비장 정맥을 절단.10분 후, 마우스 간을 HBSS 35밀리리터와 콜라게나제 타입 X로 분당 4밀리리터의 유속으로 보충하여 몇 분마다 약 10초 간간 에서 배반물의 분포를 용이하게 합니다. 콜라게나아제의 모든 perfused 되었습니다 때, 간 간으로 혈액 역류를 피하기 위해 펌프를 중지 하기 전에 실험실 조직에 간 전송. 집게를 사용하여 담낭을 제거하고 신선한 실험실 조직으로 간을 부드럽게 닦아 혈액을 제거하십시오.간을 신선한 따뜻한 HBSS 5밀리리터와 콜라게나아제로 보충한 100mm 페트리 접시에 간을 넣고 길 잃은 포셉을 사용하여 간 캡슐을 부드럽게 제거합니다. 집게를 사용하여 빈약한 조직을 조심스럽게 분산시키고 페트리 접시에 15 밀리리터 콜드 DMEM을 추가하십시오. 찢어진 간을 부드럽게 흔들어 잔류 완두엽 세포를 배지에 방출하고 나머지 세포를 획득하기 위해 접시에 차가운 DMEM의 또 다른 15 밀리리터를 추가하십시오.그런 다음 100 미크론 세포 여과기를 통해 얼음에 50 밀리리터 원문 튜브로 조직 슬러리를 필터링합니다. 1차 마우스 간세포를 분리하려면 원심분리로 세포를 수집하고 신선한 DMEM의 10 밀리리터에서 펠릿을 재보종한다. 밀도 그라데이션 분리를 위해 40% 밀도 그라데이션 버퍼 위에 세포를 조심스럽게 레이어링하여 원심 분리 후 상부 및 중간 층에서 셀을 폐기합니다.관의 벽에서 죽은 세포를 수집하는 것을 피하고 새로운 50 밀리리터 튜브로 세포를 전송하기 위해 윌리엄의 중간 E의 2 ~ 3 밀리리터와 기본 parenchymal cyte 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리 전에 윌리엄의 E 매체의 7~8밀리리터와 세포를 섞고 펠릿크기에 따라 10, 20 또는 30밀리리터의 신선한 윌리엄 미디엄 E에서 펠릿을 재보페치한다. 계산 후, 씨앗 은 섭씨 37도에서 2 ~ 3 시간 배양에 대한 6 웰 플레이트의 각 우물에 다섯 번째 세포에 10 번.인큐베이션의 끝에서, 배지를 10%의 태아 소 혈청과 항반대로 보충한 DMEM으로 대체하여 죽은 세포와 부착되지 않은 세포를 제거하고 세포를 하룻밤 동안 인큐베이터로 되돌려 보도록 한다. 아지드 변형 초기 단백질 라벨링을 위해 20~40마이크로그램의 세포 용액을 2X 반응 버퍼 50마이크로리터에 추가하십시오. 증류된 탈이온수로 80마이크로리터에 볼륨을 가져와 단백질 용액을 5초 동안 소용돌이시세요.또 다른 5 초 소용돌이에 대한 세포에 구리 황산염의 5 마이크로 리터를 추가, 소용돌이의 5 초 와 반응 완충 제 첨가제 의 다섯 마이크로 리터 다음. 3분 간 인큐베이션 을 한 후, 5초 의 소용돌이에 대해 셀에 재구성된 반응 완충 첨가제 2개 10마이크로리터를 추가하고 빛으로부터 보호되는 다중 회전기 기계에서 섭씨 4도에서 20분 동안 샘플을 회전시킵니다. 회전이 끝나면 300 마이크로리터의 메탄올을 리사테에 넣고, 그 다음으로 75마이크로리터의 클로로폼과 200마이크로리터의 이중 증류수를 첨가한다.표기 된 단백질을 원심분리에 의해 수집하고 펠릿에 신선한 메탄올 250 마이크로 리터를 추가하십시오. 소용돌이 후, 원심분리는 다시 lysate을 하고 실온에서 15 분 동안 보풀이없는 조직으로 맨살 펠릿을 덮습니다. PAGE 분석을 위해, 베타-메르카토에탄올 없이 20 마이크로리터의 적재 버퍼에서 말린 펠릿을 용해시키고 펠릿을 10분 동안 소용돌이시킵니다.다음으로, 단백질을 섭씨 70도의 열 블록에서 10분 동안 가열하고 테트라메틸뢰다민 검출을 위해 10% 나트륨 도데실 황산염 젤에 샘플을 적재한다. 그런 다음 AHA 표지된 초기 단백질의 정확한 양을 위해 가변 모드 레이저 스캐너를 사용합니다. 조직학적으로, 살아있는 및 부착된 1차 간세포는 24시간의 문화 후에 명확하게 설명된 음근 경계와 모양으로 일반적으로 다각형 또는 육각형을 나타납니다.고립 된 세포가 1 차적인 간세포인지 확인하기 위해, 이 실험에서 알부민 단백질 발현 수준은 마우스 배아 섬유아세포, 마우스 간종 세포주, 분리된 1차 마우스 간세포 및 마우스 간에서 비교되었다. 알부민 단백질 발현은 1차 마우스 간세포 및 마우스 간에서 검출되었지만 마우스 배아 섬유아세포 또는 간종 세포 세포에서 검출할 수 없었다. 10 마이크로몰러 로테논을 4~6시간 동안 1차 간세포 치료는 생체내에서 관찰된 것과 유사한 간 AMP 활성화 단백질 키나아제 T172에 대한 인산화 수치가 증가함에 따라 간 AMP 활성화 단백질 키나아제의 강력한 유도를 밝혀냈습니다.실제로, 5시간 동안 10개의 미세몰러 로테논 치료제는 화학선택적 결찰 반응에 의해 입증된 바와 같이 치료되지 않은 대조군 세포에 비해 처리된 1차 간세포에서 초기 단백질 합성에 대한 심오한 억제 효과가 있었다. 이 절차를 시도하는 동안 필요한 모든 시약과 매체를 미리 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 간 대사 병리학 의 분야에서 연구원을위한 길을 포장하여 고립 된 1 차 마우스 간세포에서 비만 및 유형 2 당뇨병의 에너지 단백질 조절분자 메커니즘을 탐구했습니다.

isolation-primary-mouse-hepatocytes-for-nascent-protein-synthesis

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

드 노보 지방 생성 및 β - 지방산 산화는 간세포의 주요 대사 경로, 지방간 질환 등 여러 가지 대사 장애에 교란되는 경로를 구성한다. 여기에서 우리는 마우스 차 간세포의 분리를 보여와 β-지방산 산화 및 지방 생성의 정량화를 설명합니다.

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

여기에서는 간 지방증의 생체 내 및 체외 모델을 생성하고 지방질 표현형 및 관련 생리학적 매개변수를 분석하기 위한 최적화된 방법에 대해 설명합니다.

의 최적화 분석<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 간 지방증

이 프로토콜의 목표는 간에서 높은 생존 능력 및 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포의 높은 수익률을 얻을 것입니다. 이 유형 IV 콜라 솔루션 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포 차등 원심 분리 뒤 문맥을 통해 간 perfusing에 의해 수행 됩니다.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

지방산 β산화는 간세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 에너지를 생성하는 데 필수적인 대사 경로입니다. 여기에서, 우리는 14C표지된 팔미트산을 사용하여 갓 분리된 원발성 간세포에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 설명한다.

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

배우세요 비방사성 L-azidohomoalanine 라벨링을 활용한 일차 마우스 간세포 분리 및 신생 단백질 합성 분석 방법을. 이 기술은 비만, 비알코올성 지방간 및 제2형 당뇨병의 간 대사 질환 연구에 활용됩니다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

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