Name: 수은 카드뮴의 검출에 대 한 혐 기성 바이오 센서 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 학습하세요 무산소 환경에서 수은과 카드뮴의 생물학적 이용 가능성을 평가하는 미생물 바이오센서 기법을 통해. 이 방법은 실시간 데이터 제공과 세포 생존성 유지로 환경 미생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 혐 기성 바이오 센서의 개발에 통찰력이 토론 Poulain 실험실의 잘 멤버로 두 익명 검토자의 의견을 감사 하 고 싶습니다. 온타리오 주 및 검색 부여에서 초기 연구원 수상 및 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다에서 A.J.P.는 가속기 보충이이 연구 자금.

저자는 공개 없다.

미생물 바이오 센서는 금속 미생물와 상호 작용 하는 메커니즘을 식별 하기 위해 유용한 도구입니다. 여기, 우리 anaerobically Hg를 계량 수 있습니다 방법을 설명II 및 CdII bioavailability 그람 음성 호스트 셀 (대장균) 하 게 같지는 결과 몇 시간. 이 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 강력한 바인딩 ligands 또는 금속 강수량으로 이어질 수 있습니다 구성 요소를 피 함으로써 금속 종 형성의 한 광범위 한 제어 노출 매체에 수는입니다. 그러나 금속 종 형성 모델 되었고 PHREEQC17를 사용 하 여이 노출 매체에 테스트 다른 금속 종 형성 소프트웨어를 배포할 수 있습니다. 아니 추가 ligands, Hg speciation 97% Hg(OH)2 와 3 %Hg (NH3)22 +, 있을 것으로 예상 된다 경우 Cd speciation 됩니다 59 %Cd-β-Glycerophosphate, 25 %Cd2 +및 16% CdSO4로 제시. 단순한 열역학적 모델링 소프트웨어를 사용 하 여 사용자 수 노출 미디어 디자인과 관심의 금속의 생체 이용률에 대 한 테스트. 또한, 바이오 센서 호스트 셀 (대장균 NEB5α) 끝났습니다 가능한 다양 한 pH (5-8.5)와 NaCl 농도 (0-0.55 M)17.
Hg 메 틸은 혐 기성 과정, 그리고이 연구에 제시 된 프로토콜 산소, 금속 bioavailability에 혐 기성 물질 대사의 더 정확한 설명에 대 한 허용에 대 한 요구 사항이 적용 되지 않습니다. 이것은 중요 하기 때문에 산소의 존재 유전자 식 프로필48,49 를 따라서, 잠재적인 전송 경로; 따라서이 메서드는 현재 exising 에어로빅 대안 이점을 선물 한다. 여기에 제시 된 바이오 센 싱 구조 수은 메 틸 화 (예를 들어, Geobacter, Desulfovibrio), 하지만 아마도 더 많은 관련이 있을 수 있습니다 다른 혐 기성 호스트와 함께 사용 될 대장균보다 적게 온순한. 여기에 제시 된 접근의 한 현재 한계는 탐지의 우리의 한계는 하지 아직 수준에 도달 오후, 기존의 에어로빅 시스템4,,1937반대입니다. 그러나 그것은이 낮은 검출 한계를 달성 하는 중요 한 몇 가지 단계를 수행 해야44: 나) 리간드 추가 Hg 솔루션에 남아 (Hg 돌이킬 수 없는 바인딩 될 것입니다 미생물 세포 벽에 흡착 되지 않습니다 있도록 필요 세포 표면 thiols의 bioavailability25,27; 방지를 그림 3A에서 Hg에 대 한 임계값 응답 참조) ii) 셀 밀도, 또는 iii에 대 한 수정) 메 르의 수송 단백질을 포함 하도록 유전자 구조를 수정-오 페론 (즉 merT 와 merP), 증가 Hg 플럭스 셀50,51내부. 이러한 수정, Hg의 낮은 농도 검출에 유용 하지만 반드시 이상적인 환경 관련 상황을 평가할 때 것. 반면 이전 카드뮴 바이오 센서는 주로 원리의 "증거"로 존재, 그들은 speciation bioavailability41,42, 의 역할을 평가 하기 위해 조사를 허용 하지 않는 복잡 한 미디어에서 설계 되었다 43 , 44.
바이오 센서는 금속 종은 bioavailable 메커니즘을 결정 한 매우 유용한 도구입니다. 때문에 호스트 유기 체 Hg methylator 아니다는 어떻게 Hg 입력할 수 있습니다 그램 음성 박테리아와 확실 한 근거 하지 Hg methylators Hg를 취득 하는 방법에 대 한 모델을 개발 하는 것만 사용할 수 있습니다. 다른 방법 존재 이해의 결과 또는는 질량 균형 접근10,15,20,,4546의 사용으로 메 틸 화, 같은 Hg bioavailability를 결정 합니다. 그 말했다 하 고, 여기에 제시 하는 방법 가능한 셀에 준 실시간으로 bioavailability 데이터의 이점을 제공 합니다. 우리는 환경 매트릭스에서 총 Hg 또는 Cd 수준의 척도를이 메서드를 사용 권장 하지 않습니다. 36환경 금속 농도 결정 하기 위해 바이오 센서의 제안 된 사용에도 불구 하 고 많은 더 쉽게 사용할 수 있는 표준 방법을 ICP-MS, FAAS (Cd 분석)에 대 한 등 냉 증기 원자 흡수 분광학 (Hg에 대 한 사용할 수 있습니다. 분석)입니다. 그러나 바이오 센서는 수 있는 주어진된 환경 매트릭스에 강화 하거나 bioavailability; 방해 가능성이 있는지 확인 하는 데 사용 이것은 표준 추가 수행 하 여 달성.
노출 매체의 pH 변경 될 수 있습니다를 어디서 나 5와 8.5의 범위 내에서 적절 한 pKa와 버퍼의 대체 무료 산 MOPS 자유로운 산 (버퍼) 교환 제공 (목록을 참조 하십시오 적절 한 버퍼 (페 레이 외. (2015) 47) 노출 매체를 만들 때 적절 한 pH에 코와 함께 조정. 또한, 메서드 Hg, Cd에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 전사 레 귤 레이 터를 사용 하 여 다른 금속을 확장할 수 있습니다.
Hg 또는 Cd bioavailability에 O2 와 포 등 다른 전자 수락자의 영향을 탐구 하는 노출 분석 결과 수정할 수 있습니다. 전자 수락자로 O2 와 포를 활용 하는 방법에 대 한 사소한 수정 요청 시 사용할 수 있습니다.
요약 우리가 다음 포인트를 강조 하 고 싶습니다: 나) 는 바이오 센서를 보정 하는 데 사용할 것입니다 이러한 Cd 또는 Hg 주식의 농도 2 단계에서 알려져 있습니다 필수적입니다. II) 노출 하루에 셀의 성장 0.6 (± 0.1)의 OD600 에서 중지 해야 합니다 하 고 그는 주의이 셀 밀도 보정은 셀 문화는 바이오 센서로 서 resuspending 때. III) 마지막으로, 그것은 중요 한 노출 매체 노출 날에 꼼꼼하게 만든. 프로토콜의 성공을 위해 동시에 (우회 하 성장 실패의 가능성) 여러 문화를 성장 하 고 성장 매체 (미디어 및 가능한 오염 metastability 우회)를 매주 만들어 해야 합니다. 또한 생물 복제 (여러 셀 문화)에 가변성 표현 신호 생산에 관해서 주목 한다. 형광 응답 문화에서 문화에 다를 수 있습니다, 비록 주어진 변수에 응답 형광 동향 수많은 생물 복제에 걸쳐 동일한 있어야 합니다.

수은 (Hg) 글로벌 오염 물질 이며 Hg 미생물 methylating에 그것의 bioavailability 음식 거미줄 인간에서 가능한 신경 효과 및 야생 동물1통해 자사의 biomagnification 향한 첫 번째 단계입니다. 그것은 현재 그 미생물 Hg 메 틸 화는 요구 하는 세포내 과정 생각: i) Hg bioavailable2,3,,45,6,7 수의 종 ii) Hg8,,910methylating의 순수 수 셀. 하지만 유기 체, 카드뮴 (Cd) bioaccumulates foodwebs에 biomagnifies 하지 않으며 사람과 환경11일반적으로 급성 노출 시키는 산업 및 상업 공정에 널리 사용 됩니다. 미생물 핵심 역활을 여러 환경에서 Hg의 운명에, 비록 Cd 지구 화학 및 ecotoxicology에 대부분의 연구는 미생물 진핵생물12에 초점. 농업 작물 (예를 들어, 쌀)의 소비는 카드뮴;에 직접 노출의 주요 소스 이 경우에 rhizosphere의 미생물을 Cd의 bioavailability 직접 금액을 영향 식물13누적 될 수 있습니다.
Hg 전송 경로 복잡 하 고 가능 하 게 활성 전송 단계14를 포함 한다. 전송 관련 최근 작품 HgII 는 Zn을 사용 하 여 제안II 또는 미네소타II 전송7,15,,1617. 반면 CdII 실수로 수송 가설 (특히 미네소타II 또는 ZnII) divalent 금속 전송 경로 통해 cytosol로 CdII 의 메커니즘 셀 유지 하는 내부 전송 투기, 그리고 더 Cd 전용 전송 경로 확인 된13,18되었습니다. 관련 된 전송기의 자연에 3 개의 기계적 요인 궁극적으로 셀 입력 금속 수 결정: 솔루션2,6,15, i) 금속 종 형성 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii)는 세포 막17,,2425,26,27,28,29의 biophysiochemical 속성 ,,3031및 iii) 전송 사이트7,32액세스할 수 금속에 대 한 능력. Cd 및 Hg 또는 되지 않습니다 때문에 그들의 높은 선호도 대 한 해산 유기 물질 (DOM), 미생물 생리학 관련 조건 하에서 자유로운 이온으로 존재 하는 것 (예를 들어, EDTA), 오염 물질을 킬레이트 화 황 moieties33, 감소 34,35 (CdII 는 무료 이온 또는 양식 이온-쌍이이 ligands의 휴무에서 존재할 수 있습니다). 어떻게 이러한 금속 종은 환경에 그들의 운명에 관련 된 조건 bioavailable 결정에 효율적인 방법의 부족이 이다. 예를 들어, Hg 혐 기성 조건14, 아래 갠 고 카드뮴과 Hg는 부드러운 금속 (또는 클래스 B 양이온), 감소 된 유황 그룹의 무결성을 유지 하는 조건 하에서 그들의 종 분화를 조사 요구.
미생물 바이오 센서는 금속,이 경우 Hg 또는 Cd의 세포내 농도에 대응 가능한 신호를 방출 하는 세균성 세포 이다. 이와 같이, 그들은 이상적인 도구 노출 조건에 대 한 신중 하 게 제어 됩니다 어떻게 금속 입력 셀36를 이해 하. Hg 바이오 센서는 일반적으로 메 르의 규제 회로 사이 유전자 융해를 포함-오 페론 (연산자 및 발기인으로는 오 페론의 전사 레 귤 레이 터 MerRas에 대 한 인코딩을 포함 하 여 유전자), 및 유전자 보고 (예: 럭 스, gfp, 락 유전자). 수은 세포질에 존재 하는 때 그것 MerR, 후속 신호 생산19,37고 보고 유전자의 녹음 방송에 있는 결과에 바인딩합니다. 특정 Cd 바이오 센서는 일반적으로 cadC를 사용 하 여 설계 cadAC, zntA 또는 zntR 인코딩 전사 레 귤 레이 터38, 하지만 MerR Cd5, 아직 같지는 선호도 지적 가치가 있다. 대부분의 에어로빅 제한 일반적으로 사용 또는 형광 발광 기자 단백질, 최근 미생물 바이오 센서는 생물학적 무산 소 조건 하에서 금속에 대 한 통찰력을 제공 하 없는 남아 때까지. 이것은 금속 bioavailability의 혐 기성 검출 매우 어려운 조건의 범위에 걸쳐 redox 민감한 ligands (예를 들어, 황화와 thiols)4, 의 특히 환경 그들의 운명에 관련 5 , 39.
완화의 방법론 장애물 라이브 이미징 Drepper 외. 산소의 부재에 (2007) 플 라빈 기반 형광 단백질 (FbFp)를 개발, P. putida에서 SB2 단백질의 가벼운 산소 전압 도메인에 따라. 이 단백질 가족은 산소40의 부재에서 형광을 수 있다. Drepper 외의 일에 건물, 연구소 설계 Hg bioavailability oxic 무산 소 조건 하에서 및 넓은 범위의 염 분 17의 연구에 대 한 허용 하는 혐 기성 바이오 센서. 현재 신문에서 우리 준비는 바이오 센서를 사용 하 여 환경 변수 Hg 또는 Cd bioavailability에 영향을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 우리가 HgII는 바이오 센서 개발, 우리는 바이오 센서는 또한 공동 환경에서 발생 하는 여러 스트레스 응답할 사실에 독자의 관심을 끌기 위해 수단으로 CdII 와 실험을 수행 하기로 행렬; 이 경우 CdII MerR5transcriptional 레 귤 레이 터에 바인딩할 알려져 있기 때문에 조사 되었다. 여기, 우리 대표 교정 및 중 금속 기준 기능 선형 범위를 보여줍니다. 우리는 또한 줄 예를 들어 바이오 센서의 결과 결정적인 (MgII 와II Hg bioavailability에 Mn) 및 불확실 (ZnII Hg bioavailability에).

<table><tbody><tr><td>7ml 표준 바이알, 둥근 내부</td><td>Delta Scientific</td><td>200-007-20</td><td>34</td></tr><tr><td>권장 바이알 트레이, 21mm 개구부</td><td>Delta Scientific</td><td>730-2001</td><td>4 for (4 x 8 grid)</td></tr><tr><td>24 mm 클로저</td><td>Delta Scientific</td><td>600-024-01</td><td>32 권장</td></tr><tr><td>뚜껑 코너 노치 BLK STR CS/50</td><td>Corning</td><td>Corning 3931</td><td></td></tr><tr><td>코닝 96- 우물 투명 바닥 비 바인딩 표면 마이크로 플레이트</td><td>코닝</td><td>코닝 3651</td><td></td></tr><tr><td>혐기성 챔버 (글로브 박스)</td><td></td><td></td> <td>혐기성 챔버의 공기는 (97 % N2 &plusmn; 2 % 및 3 % H 2 &plusmn; 2 %)</td></tr> <tr><td>팔라듐 촉매</td><td></td><td></td><td>이어야합니다.혐기성 챔버에서 O2 를 H2O로 변환합니다. 필수는 아니지만 권장됩니다.</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 (&plusmn; 10) 마이크로플레이트 리더</td><td></td><td></td><td></td>(500)용 nM 필터</tr><tr><td>(&plusmn; 10) 마이크로플레이트 리더</td><td></td><td></td><td></td>용 nM 필터</tr>: <tr><td>혐기성 배양 바이알(발치 튜브) + 고무 마개</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td></td><td></td>: <td>혐기성 배양 튜브용으로 수정</td></tr>됨, <tr><td>MA-3000(수은 분석기),</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pH 프로브</td><td></td><td></td><td>, 모든 pH 프로브는</td></tr><tr><td>50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리 튜브</td>로 작동합니다.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 & 마이크로; m 폴리 에테르 설폰 주사기 필터 + 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 / 세척 유리 병</td><td></td><td></td><td>성장 배지 및 표준</td></tr><tr><td>멸균 / 세척 플라스틱 또는 PTFE 병</td><td></td><td></td><td>알칼리 용액 (NaOH / KOH)</td></tr> <tr><td>용 시약 분말 : Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, 암피실린 나트륨 염, Difco M9 최소 염, 포도당, MgSO4, 티아민 HCl, NaNO3, l-류신, l-이소류신 발린, EDTA 나트륨 염, FeSO4, 나트륨 베타 - 길세로 인산염, 걸레 유리 산, (NH4) 2SO4, Hg (NO3) 2, CdCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 Milli-Q 물</td><td></td><td></td><td>오토 클레이브 또는 필터 멸균은 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>용원 육수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석 등급 H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

수은 카드뮴의 검출에 대 한 혐 기성 바이오 센서 분석 결과

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

미생물을 수은 (Hg) bioavailability 식품 웹에서 독성 Hg biomagnification에 중요 한 단계 이다. 카드뮴 (Cd) 변환 및 박테리아 bioavailability 주식 작물에 축적 됩니다 금액을 제어 합니다. 이러한 금속의 bioavailability 솔루션, 하지만 Hg 독성 monomethylmercury (MeHg)에 갠 및 Cd는 rhizosphere에서 지속 무산 소 조건에서 특히 그들의 종 형성에 따라 달라 집니다. 전체 셀 미생물 바이오 센서는 금속은 cytosol 들어가고 따라서 유용한 도구 금속 bioavailability를 평가 하는 때 같지는 신호를 줄. 불행히도, 대부분 바이오 센 싱 노력 까지는 산소가 없을 경우에는 함수에 기존 기자 단백질의 제한 된 능력으로 인해 oxic 환경 제한 되어 있다. 이 연구에서 우리는 우리의 노력을 개발 하 고 전체 셀 바이오 센서 분석 결과 작동 수 있는 최적화 anaerobically 준 진짜 시간에서 및 시간 무산 소 조건 하에서 금속을 감지할 수를 제시. 우리는 어떻게는 바이오 센서 평가 어떻게 화학 변수 관련 금속 영향의 환경 자전거 그들의 bioavailability을 도울 수 설명 합니다. (1) Hg를 준비 하는 방법을 포함 하는 다음 프로토콜 및 무산 소 조건, (2) Cd 표준 산소, (3) 디자인의 부재에 바이오 센서를 준비 하 고 Hg 또는 Cd bioavailability, 및 (4)에 미치는 일련의 변수를 확인 하는 실험을 실행 계량 하려면 바이오 센서 데이터를 해석. 우리는 바이오 센서의 선형 범위를 표시 하 고 금속을 유도할 수 있는 및 제정 종자를 이용 하 여 금속 bioavailability와 독성 사이 구별 하는 메서드의 기능을 보여 주는 예제를 제공 합니다.

형광 봉우리 단계 5.3에 따라 계량 되어 있다, 일단 그 변수 Hg 또는 Cd의 상대 생체 이용률에 미치는 영향을 보여주는 변수 농도 따라 형광 봉우리의 결과 그래프로 수 있습니다. 예를 들어 그림 2 에서 [HgII] 이상 형광의 보정 곡선은 그림 3A에서 제시 하는 유도할 수 있는 데이터를 얻을 것입니다. HgII 에 대 한 보정, 커브는 항상 Hg를 유도할 수 있는 스트레인;에 대 한 3 요소를 포함 약의 임계값 응답 형광 신호 생산 하기 전에 1-2 nM HgII 는 선형 비례 [HgII], 하 선형 범위 어디 5 nM Hg2 항상 안정적으로 그 범위와 고원의 중심에 있을 것입니다 어디 [HgII] 증가 하는 것은 더 이상 형광 신호를 증가 합니다. 제정 스트레인에 신호 생산에서 변화 [HgII]에서 독성 신호 생산에는 영향을 미치지 않습니다 보여줍니다. 그림 3B에서II Cd, 거기는 항상 유도할 수 있는 스트레인; 2 구성 요소 선형 범위 200-300 nM CdII 의 선형 범위와 고원 중앙에 안정적으로 항상 있을 것입니다. 형광 신호 [CdII] 증가 함께 감소가 보여줍니다 높은 Cd 농도 세포에 독성 1000 nM CdII에 고원 후 유도할 수 있는 형광 생산에 있는 감소를 설명할 수 있다. 따라서, 환경 변수 관련 Hg 또는 Cd bioavailability를 테스트할 때는 우리 것이 좋습니다 사용 하 여 5 Hg에 대 한 nMII 및 300 nM cdII.
어떤 경우에, 신호 생산 제대로 기 인할 수 있다 Hg 또는 Cd bioavailability를 하지만 다른 경우에, 신호 생산 바이오 센서 셀 호스트의 생리 적 상태에 있는 변화에 의해 영향을 받을 수 (예: 관심의 금속 또는 환경 테스트 조건은 독성)입니다. 그림 4A, 5 nM Hg bioavailability Zn의 그라디언트를 통해 테스트 되었습니다 (0-10 µ M). Hg를 유도할 수 있는와 제정 긴장, Zn 농도 증가 함께 신호에서 유사한 감소가입니다. 따라서, 하나의 신호 낮춘된 bioavailability에서 결과 또는 Zn 독성의 결과 이다 차별 수 없습니다. 그림 4B 및 4c, 5nM Hg bioavailability Mg의 그라디언트를 통해 테스트II (0-10 m m) 및 미네소타II (0-10 µ M). Mg 증가II 와 MnII 농도 감소를 유도할 수 있는 긴장의 형광 신호. 다른 한편으로, 제정 스트레인 형광 Mg 증가 함께 감소 보여주지 않았다II 와 MnII 농도 (MgII 와 MnII 는 셀 FbFp의 생산에 대 한 유익한 여 형광 신호에 증가)입니다. 이 세포가 가능한 Hg를 유도할 수 있는 긴장의 형광 감소 Hg bioavailability 감소에서 결과 보여 줍니다. 이 데이터 얼마나 중요 한지 그것은 또한 전체 셀 휘트니스의 구성 적인 측정을 제공 하기 위해 모든 바이오 센서 분석 실험에 대 한 강조.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> 그림 3: 수은과 카드뮴 바이오 센서의 선형 범위. 최대 형광 측정 상대 형광 단위 (RFU) ± 1 표준 편차 대장균 NEB5α 방출 pUC57merR 페이지 (Hg를 유도할 수 있는)와 pUC19Balch-Pp (Constitutive)의 추가 함께 품고 A) HgII (0-15 nM) 그리고 B) CdII (0-1000 nM) 혐 기성 조건 하에서. 형광 기술 3의 평균 37 ˚C에서 복제 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> 그림 4: 아연 결정적이 아니는 결과 마그네슘과 망간 결정적인 결과의 예. 최대 형광 측정 상대 형광 단위 (RFU) ± 1 표준 편차 대장균 NEB5α 방출 pUC57merR 페이지 (Hg를 유도할 수 있는)와 pUC19Balch-Pp (Constitutive)의 추가 함께 품고 A) ZnII (0-10 µ M), B) MgII (0-10 m m), 및 C) 미네소타II (0-10 µ M) 혐 기성 조건 하에서. [HgII]을 5로 설정 된 모든 및 형광에 대 한 nM 37 ˚C에서 3 기술 복제의 평균 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리가 어떻게 다른 환경 변수를 평가 하는 혐 기성 전체 셀 미생물 바이오 센서를 사용 하는 프로토콜을 제시 무산 소 환경에서 박테리아를 Hg와 Cd의 bioavailability에 영향을 미칠.

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

이 방법은 다른 환경 변수가 박테리아에 그들의 생체 이용률에 어떻게 영향을 미치는지 와 같은 카드뮴과 수은의 생물지질화학 적 사이클링에 관한 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 산소의 존재에 관계없이 준 실시간 생체 이용률 데이터와 실행 가능한 세포를 제공한다는 것입니다. 일반적으로이 방법에 새로운 개인은 세부 사항에 매우 세심한주의를 필요로 하는 많은 시간 민감한 단계가 있기 때문에 투쟁 할 것이다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 졸업생 인 벤이 될 것입니다. 분석에 대비하기 위해 수은 유도 가능한 바이오 센서와 구성적으로 발현된 바이오센서를 영하 80도의 냉동저온 육수에서 회수합니다. 암피실린의 밀리리터 당 120 마이크로그램을 포함하는 리소게니 국물 판에 세포를 접시.하룻밤 사이에 37도에서 인큐베이터에서 플레이트 배양을 성장시다. 4:30에서 5 p.m. 암피실린을 가진 LB의 10 밀리리터에 있는 문화를 접종하고 220 rpm에서 동요와 섭씨 37도에서 밤새 자랍니다.다음날 아침 9~10시에.m. 그런 다음 신선한 성장 매체의 8 밀리리터와 멸균 발치 튜브에 암피실린의 밀리리터 당 210 마이크로 그램을 추가합니다.이제 하룻밤 재배 문화의 두 밀리리터를 수집하고 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 전송합니다. 90초 동안 10, 000 RCF에서 원심분리한 후, 상체를 제거하고 2밀리리터의 신선 성장 배지로 재연합니다. 그런 다음 신선한 성장 배지와 암피실린의 8 밀리리터를 포함하는 발치 튜브에 재일시 된 문화를 추가합니다.멸균 기술을 사용하여 혐기성 챔버에서 제거하기 전에 발치 튜브에 고무 스토퍼를 조심스럽게 배치하십시오. 그런 다음 튜브를 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 혐기성으로 성장하여 220 rpm에서 흔들어 놓습니다. 3에서 5 p.m 사이.배양, 새로운 멸균 발치 튜브 및 성장 배지를 혐기성 챔버로 가져올 수 있습니다. 멸균 발치 튜브에 암피실린을 넣은 신선한 성장 배지 10밀리리터에 100마이크로리터의 배양을 추가합니다. 멸균 기술을 사용하여 발치 튜브에 고무 스토퍼를 조심스럽게 배치하십시오.혐기성 챔버에서 튜브를 제거한 후 밤새 섭씨 37도에서 220 rpm에서 흔들리면 됩니다. 다음날 9~10시 .m. 문화와 성장 배지를 혐기성 챔버로 옮기다.다시 멸균 발치 튜브에 성장 매체와 암피실린의 8 밀리리터를 추가합니다. 하룻밤 재배 문화의 2 밀리리터를 2 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기다. 이전과 같이 원심 분리에 따라, 상체를 제거하고 신선한 성장 매체의 두 밀리리터에서 세포를 다시 중단.그런 다음 신선한 성장 배지 및 암피실린을 함유한 발치 튜브에 재일시 중단 된 배양을 추가합니다. 멸균 기술을 사용하여 발치 튜브에 고무 스토퍼를 조심스럽게 배치하십시오. 챔버에서 제거하고 220 rpm에서 흔들어 와 섭씨 37도에서 혐기성 성장.배양을 소용돌이게 한 다음 600나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정하여 분광계를 사용하여 배양의 성장을 모니터링한다. 3~4시간의 예상 성장 후, 문화는 6의 OD600에 도달해야 합니다. 이제 혐기성 챔버에 튜브를 가져와 두 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 문화를 전송합니다.상신포를 제거하고 신선한 노출 매체의 2 밀리리터에서 각 세포 입맛을 다시 중단하기 전에와 같이 원심 분리를 따르기. 성장 배지의 흔적을 제거하기 위해 이 세척 단계를 한 번 반복하십시오. 이제 세포 배양의 두 마이크로 원심 분리관을 7밀리리터 PTFE 표준 바이알에 결합하여 노출 분석에서 사용하기 위한 바이오센서 스톡을 얻을 수 있다.실험을 시작하기 전에 혐기성 모니터를 확인하여 혐기성 챔버에 산소가 없는지 확인합니다. 96 웰 템플릿에 따라 플레이트 레이아웃을 디자인합니다. 3개의 기술 복제에서 실험을 실행하면 32개의 다른 치료법이 허용되며, 이는 바이알을 설정하는 데 4개의 그리드로 가장 잘 표현됩니다.분석 플레이트 레이아웃에 따라 4-8 그리드를 설정합니다. 그런 다음 트레이에 7 밀리리터 PTFE 표준 바이알을 놓습니다. 바이알은 바이알의 외부를 조작하여처리해야 합니다.각 치료에 해당하는 각 바이알에 노출 배지 볼륨을 추가합니다. 각 바이알에 플레이트 레이아웃에 따라 테스트할 화학 변수의 해당 부피를 추가합니다. 이제 각 유리병에 질산염을 추가하여 농도가 200 마이크로몰러되도록 합니다.구성 바이오 센서 처리 공백에 대한 이 단계를 제외하십시오. 바이알에 수은을 추가하려면 먼저 4~8개의 마이크로몰러 스톡을 가지고 잘 흔들어 주세요. 용액 및 노출 배지를 7 밀리리터 PTFE 바이알에서 100~250 나노몰러 의 농도로 희석하여 작동 수은 용액을 만듭니다.이 작업 솔루션에서 플레이트 레이아웃에 따라 필요한 바이알에 수은을 추가합니다. 수은 또는 카드뮴을 추가한 후 수동으로 궤도 모션으로 판을 흔들어 줍니다. 이 실험은 수은 또는 카드뮴이 용액에서 관전하는 데 필요한 시간에 따라 지금 일시 중지될 수 있다.실험이 재개되면 균일성을 보장하기 위해 바이오 센서 를 앞뒤로 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 각 바이알에 바이오 센서 스톡 100 마이크로리터를 추가하고 이전과 같이 수동으로 플레이트를 흔들어 줍니다. 플레이트 판독기를 섭씨 37도로 데우고 2점마다 5~5분마다 읽기로 10시간 동안 운동 런을 설정합니다.판독값 사이에 궤도흔들림. 440 나노미터의 형광 발아와 500 나노미터의 방출로 형광 측정을 수행하도록 실행을 설정합니다. 이제 파이펫 200 마이크로 리터각 PTFE 바이알에서 4 그리드에서 96 웰 플레이트의 해당 우물로.파이펫은 각 200 마이크로리터를 전송하기 전에 5번 앞뒤로 전송합니다. 파이펫 팁을 버리는 대신, 파이펫 팁을 PTFE 유리병에 두어 파이펫팅 진행 상황을 추적합니다. 96 웰 플레이트를 플레이트 판독기의 트레이에 넣습니다.그런 다음 뚜껑을 96 웰 플레이트에 놓고 분석서를 시작합니다. 다음은 수정된 형광 데이터를 시간의 함수로 보여주는 대표적인 결과입니다. 형광은 유도 가능한 바이오 센서에 수은의 농도가 증가하는 것으로 나타났다.모든 값은 수은 제어가 없는 데 비어 있습니다. 형광 피크는 수은 또는 카드뮴 농도의 함수로서 형광 신호를 나타내기 위해 정량화 될 수 있습니다. 유도성 및 구성 바이오 센서 모두의 경우 유도 가능한 센서 선형 범위의 중간에 있는 수은 또는 카드뮴 농도가 변수 테스트에 사용되어야 합니다.다음은 아연과 결정적인 결과의 예입니다. 그리고 생체 센서에 수은 생체 이용에 마그네슘과 망간과 결정적인 결과. 아연의 결과는 구성형 형광이 독성을 나타내는 유도성 형광으로 부패하기 때문에 결정적이지 않습니다.이 절차를 시도하는 동안 이러한 바이오 센서를 보정하는 데 사용되는 것으로 카드뮴 이나 수은의 농도를 입력하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 수성 시스템의 열역학 모델링과 같은 다른 방법은 수은 또는 카드뮴의 특정 화학 종이 생체 이용률에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 카드뮴과 수은, 황산과 같은 강한 산과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.개발 후이 기술은 환경 미생물학 분야의 연구원들이 준혐기성 수은 또는 카드뮴 생체 이용률 및 유전적 인 미생물을 탐구할 수있는 길을 열었습니다.

an-anaerobic-biosensor-assay-for-the-detection-of-mercury-and-cadmium

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

출처: Barber, AE, et al. 총상 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 박테리아 바이오센서의 준비 및 적용. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 박테리아 바이오센서를 사용하여 특정 분석물을 검출하는 방법을 보여줍니다. 분석물에 민감한 프로모터 아래에 적색 형광 단백질(RFP) 유전자가 있는 플라스미드를 운반하는 박테리아 배양물을 채취합니다. 테스트 표면을 철저히 닦은 후 물티슈의 작은 부분을 배양액에 담그고 배양합니다. 프로모터와의 분석물 상호 작용은 RFP 발현을 활성화하여 표적 분석물의 존재를 확인합니다.

박테리아 바이오센서를 사용한 표적 분석물 검출

출처: Stenzler, BR et. al., 수은 및 카드뮴 검출을 위한 혐기성 바이오센서 분석. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 혐기성 조건에서 수은 이온의 생체 이용 분율을 정확하게 측정하기 위해 유전자 조작 박테리아 바이오센서를 사용하는 방법을 보여줍니다. 황산마그네슘의 농도를 변화시킴으로써 이 분석은 형광 강도의 변화로 표시되는 대로 바이오센서가 유리 수은 이온에 선택적으로 반응하도록 보장합니다.

혐기성 조건에서 생체 이용 가능한 수은을 검출하기 위한 박테리아 바이오센서 분석

미세조류 배양과 산업용 연도 가스의 통합은 궁극적으로 중금속 및 기타 무기 화합물을 성장 배지에 도입할 것입니다. 이 연구는 광생물반응기에서 자란 Nannochloropsis salina의 성장에 대한 중금속 및 무기 오염 물질의 최종 운명과 영향을 결정하는 데 사용되는 절차를 제시합니다.

중금속과 미세 조류의 생산성에 다른 무기 오염 물질의 정량화

때문에 팔라듐, 금, 코발트의 중요성과 광범위한 사용   첨단 기술 장비 금속은, 자신의 회수 및 재활용은 중요한 산업 문제를 구성한다. 본원에 기재된 금속 회수 시스템은 간단하고, 저비용 도시 내에서 이러한 금속의 유효 검출, 제거 및 복구를위한 수단이다.

감지 및 팔라듐의 복구, 도시 광산에서 금과 코발트 금속은 나노 수레 바퀴 모양의 기공 지정 소설 센서 / 흡착제를 사용하여

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수용액에서 킬레이트화되지 않은 가돌리늄(III) 이온을 감지하기 위한 폴리데옥시뉴클레오티드(44-mer aptamer) 분자의 사용에 대해 설명합니다. 이온의 존재는 센서의 형광 방출의 증가를 통해 감지됩니다.

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이 논문에서 유출 물에 화학 성분의 정량으로 선택 간격으로 시간과 유출 서브 샘플의 컬렉션 총 유출 볼륨을 측정하기 위해 장착 된 24 개인 33.6 m 2 필드 플롯을 포함하는 1,000 평방 미터 시설의 설계, 건설 및 기능을 설명합니다 시뮬레이션 홈 잔디.

도시 유출의 연구 시설의 설계 및 건설

학습하세요 무산소 환경에서 수은과 카드뮴의 생물학적 이용 가능성을 평가하는 미생물 바이오센서 기법을 통해. 이 방법은 실시간 데이터 제공과 세포 생존성 유지로 환경 미생물학 연구에 활용됩니다.

수은 카드뮴의 검출에 대 한 혐 기성 바이오 센서 분석 결과

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