Name: 기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 간-온-어-칩 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 학습하세요 간-온-어-칩 기술을 이용한 B형 간염 바이러스 감염 실험 방법을. 인간 간세포와 쿠퍼세포를 3D 배양하여 생리학적 간 미세환경을 재현하고 장기간 유지하며 바이러스 복제와 면역 반응을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 유럽 연구 위원회 (637304), Wellcome 신뢰 조사 수상 (104771/Z/14/Z)에서 시 동기 부여에 의해 그리고 CN 바이오 혁신에 의해 투자 되었다.

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</ol>

저자는 공개 없다.

여러 문화 모델 개발 증가 기능와 장 수, 각 차동 장단점 전시 PHH의 장기 문화를 유지 하는 도전 몰 았다. 그것은 이제 널리 인정 했다 PHH의 정적 2D 문화 매우 제한 된 양의 시간 hepatocyte 생물학의 특정 측면을 흉내내는. 따라서, micropatterned cocultures12,13,15, 회전 타원 체의 문화14,및 3D 칩에 간 문화16,17 빠르게 이러한 기본적인 시스템을 대체 하는. 생리 적인 환경을 제공 하기 위한 요구 사항은 종종 어려운 자연 인간 트로픽 경작의 underpinned 전염 성 질환, 특정 microenvironments를 활용 하는 것 그들의 호스트와 함께 coevolved 있다, 공부 하는 경우에 특히 전염 성 질환, C 형 간염 바이러스, HBV, 말라리아 등.
3D 칩에 간 문화를 수행 하는 가장 중요 한 단계는 처음 공급된 기본 셀 형식의 품질입니다. 이 세포는 그들의 준수 능력에 대 한 테스트 해야 하 고 plateable PHH 많은 성공적인 조직 형성 및 문화 생성을 위해 사용 되어야 한다. 갓 격리 PHH 사용할 수 있습니다, 비록 그들의 cryopreservation는 일반적으로 복잡 하며 특별 한 속도 제어 냉동 고.
기존의 정적 2D 문화, 달리 호스트 유전 배경 민감성 HBV 감염에 관한 무시할 이며 모든 따라서 멀리 테스트 hepatocyte 기증자 HBV 감염4을 설정할 수 있습니다.
환자 파생 HBV 감염 3D 문화의 설정, 그것은 절대적으로 못 시 켰 던 활용 하 고 자당 쿠션-정화 HBV 바이러스 inocula의 생성에 대 한 라인 유도할 수 있는 HBV 프로듀서 셀을 사용 하 여 언제 든 지. 셀 문화 supernatants 3D 칩에 간 문화, hepatocytes와 현재 성장 요인의 호환성 또는 억제 요인의 존재를 통해 직접 적용 쉽게 감염 발생 하지 않습니다. 또한, 선택할 때 환자 파생 바이러스 inocula, 혈 청만 사용 되어야 한다, 때문에 플라즈마 필연적으로 coagulates 문화 플랫폼의 미세 순환을 나 막 신.
바이러스 inoculum 사용에 관계 없이 초기 HBV inoculum의 완전 한 제거를 보장 뿐 아니라 세포 생존 능력 및 차별화, 확신은 성공적인 장기 감염 연구 열쇠 이다. 이렇게 하는 가장 편리한 방법은 문화 바이러스 inoculum의 제거 다음으로 문화 기간 동안 인간 혈 청 알 부 민 수준 측정 샘플링입니다. 노트, 모든 다른 기술된 플랫폼, HBV 감염, 유사 하 게, 않습니다 쉽게 확산 되지 감염 되지 않은 세포에. HBV 감염 vivo에서 쉽게 감염 간 내 hepatocytes의 대부분 이후이 대 한 기본 메커니즘 애매 남아 있습니다.
PHH와 Kupffer 세포의 cocultures에 관해서는 그것은 이후 모든 상용 Kupffer 세포 기증자는 동일한 응답 IL6 및 TNFα 분 비 LPS 자극에 대 한 응답에서을 평가 하 Kupffer 세포의 많은 테스트를 수행 하는 것이 좋습니다.
중요 한 것은, 모든 약물 치료 또는 HBV와 문화의 초기 감염, 우물의 (1.4 mL)도로 미세 채널 (0.2 mL), 총 볼륨 해야 합니다 수 고려 약물 또는 inoculum 농도의 계산에 대 한. 정확한 투약을 보장 하기 위해서 HBV 또는 약물을 포함 하는 매체와 한 세척 단계는 미세 채널 프라임 위해 수행 됩니다.
사용 하는 플랫폼은 건설 기계 내에서 다층된 hepatocytes 보장 잘 당 600000 PHH 활용 합니다. 휴대폰 번호는 변화 될 수 있지만 선택한 셀 농도 최적의 결과 보장 합니다. 플레이트 형식 12 건설 기계, 건설 기계 36에 격상 될 수 있는 총을 보유 하고있다. 그러나, 미세 요구 사항이 높은 잘 번호 확장 불가능 날짜 합니다.
이러한 방법을 사용 하 여, 문화 유지 될 수 있는 최적의 셀 성능을 가진 적어도 40 일 동안,까지, 새로운 약 후보자를 평가 하 고 다른 간 세포 사이 복잡 한 상호 작용을 공부 전례 없는 기회를 제공 HBV 감염 시의 인구

HBV의 연구 시작 감염1셀당 HBV 게놈 사본의 수천 수백을 요구 하는 문화 시스템의 가난한 민감성에 의해 복잡 하 게 되어 있다. 또한, 기본 인간의 hepatocytes는 일반적으로 매우 약 하 고 빠르게 기존의 문화2동안 dedifferentiate. 이건 평평 하 고 단단한 플라스틱 표면의 자연 extracellular 환경 간 및 미세 순환의 부재에서 문화의 산소의 일반적인 부족 내에서 발견 모방 하지 않습니다는 사실 때문에 주로. 콜라겐 코팅 판에 기존의 정적 hepatocyte 문화는 급속 하 게 dedifferentiate 하 고 HBV 감염3그들의 민감성을 잃게됩니다. 여기, 우리가 설명 설정과 PHH 콜라겐 코팅 판 확장된 그들의 신진 대사와 기능 능력 때문에 기존의 2D 정적 PHH 문화 훨씬 유리한 끝났다, 3D 칩에 간 문화에서 자란의 감염을 촉진 적어도 40 일4의 장기 문화. 이 시스템에서 PHH 지속적으로 세포에 산소와 양분을 공급 성장 매체와 함께 끼얹는다는 콜라겐 코팅 건설 기계에 시드 있습니다. PHH 대안 문화 시스템에 따라 비록 murine 섬유 아 세포 또는 spheroids 3D 성장의 복잡 한 cocultures 검증 된 고 셀, 3D 당 500 게놈 등가물 (GE) HBV의 감염의 복합성을 사용 하 여 HBV 감염에 취약 간 온 칩 문화 유일한 체 외 모델 시스템 0.05에 취약 남아 GE의 HBV 셀4당. 이것은 또한 underpinned 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 높은 농도 사용 하 여 HBV 감염을 확립의 필요성에 의해 이러한 문화에는 3D 칩에 간 문화 시스템의 감염을 위한 불가결 4. HBV의 주요 특징 중 감염 모든 드 노 보-생산 virions5,6transcriptional 템플릿 역할을 하는 cccDNA 풀 이다. 여부 cccDNA의 규칙 및 그것의 제거를 겨냥 하는 어떤 치료 접근은 지에 부분적으로 불분명 남아 비록 cccDNA 기존의 hepatocyte 문화7,8에서 검출 될 수 있다, 또는 완전히 dedifferentiated hepatocytes입니다. 우리는 cccDNA 3D 칩에 간 문화에서 형성 기능, 생리 적 자극에 응답 그리고 transcriptional 기계 cccDNA 게놈4의 접근을 방해 하 여 타겟팅 할 수 있습니다 나타났습니다.
그 관찰 HBV에 감염 된 환자에서 치료 성공으로 감염, 바이오 마커의 식별을 사용 하는 3D 간 온 칩 모방에서 HBV 감염 호스트 응답 합니다. 간 온 칩 문화의 독특한 기능 중 PHH와 Kupffer 세포4, 방사상 세포9및 간 정현파를 포함 하 여 간 내의 다른 nonparenchymal 셀 사이 장기 호스트 응답을 평가 하는 기능이입니다. 내 피 세포10,11. 이 복잡 한 3D microenvironment 상호 작용/셀을 평가 하는 독특한 기회를 제공 합니다.
또한,이 플랫폼의 확장된 문화 기간 용이 불가능 기존의 hepatocyte 문화 시스템을 사용 하 여 순차 약물 치료의 평가 및 HBV 지 속성에 미치는 영향.
이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 3D 간-온-어-칩 PHH의 monocultures 또는 Kupffer 세포 PHH의 cocultures에 대 한 문화 생성 됩니다. 또한, 우리 정화 HBV 감염의 낮은 다중성 연구의 생산 뿐만 아니라 호스트와 바이러스 응답의 후속 분석을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium, no phenol red</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Thaw Medium</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>고급 DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산(NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 미국 유래, 열 비활성화, 멸균 필터, 세포 배양에 적합</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>송아지 피부의 콜라겐</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>무수 탄산나트륨</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>황산, 99.999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>알부민 (인간)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&nbsp; 소 혈청 알부민, 분획 V, 열 충격 처리</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kits/Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile membrane</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 관류 세포 배양 플레이트</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 배양 플레이트 뚜껑</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>멸균 원형 여과지</td><td>CN Bio innovation</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>세포 부착 발판</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>고정 링</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>멸균 플런저</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 혈액 및 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Human Magnetic Luminex 분석</td><td>R & D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA 기질 솔루션</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp 바이러스 RNA 미니 액세서리 세트</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>함유 RNA 캐리어</td></tr><tr><td>밀리셀 HY 5층 세포 배양 플라스크, T-1000, 멸균</td><td>Millipore(Merck)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFHYS1008 MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate(바코드 포함</td>) <td>Life 기술</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Life 기술</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>96-Well</td> Plate용 442404 <td></td></tr><tr><td>밀봉 테이프</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>PES 멤브레인이 있는 Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 병 상단 필터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 가장자리가 있는 미세한 슬라이드, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>관, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Primary cells / Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>Cryopreserved Human Kupffer Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19 cell line</td><td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Primers/Probes/Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA probe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA 포워드 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>리버스 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>포워드 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>리버스 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>교수 Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항-B형 간염 바이러스 코어 항원 IgG 분획 (다클론)</td><td>DAKO</td><td>단종</td><td>Lot 10102505</td></tr><tr><td>Human Albumin Antibody, A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>Human Albumin cross-adsorbed 항체, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsobed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>Lot 1431810</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 진공 펌프</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 공압 훅업</td><td>CN Bio 혁신</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 플랫폼</td><td>CN Bio 혁신</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 플레이트 세척 도크</td><td>CN Bio 혁신</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 금속 집게</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries</td><td>SKU: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow</td><td>MGE worldwide</td><td>&nbsp; SAM12 / 01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE 5800 시리즈 인큐베이터</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>자동 정밀 토크</td><td>CN Bio 혁신</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수동 토크</td><td>CN Bio 혁신</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 압축기</td><td>CN Bio 혁신</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xPONENT 3.1 Luminex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가 장착 된 Luminex LX-200 기기Millipore 핸드헬드 자기 분리기 블록</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar Optima 플레이트 리더</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER 정밀 전기 스크루 드라이버</td><td>VTECH ltd</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER 전원 공급 장치</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>공기 장비</td><td>단종</td><td></td></tr><tr><td>Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR 시스템(384웰 블록</td><td>포함) ThermoFisher Scientific</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

기본 hepatocytes 및 b 형 간염 바이러스 감염에 대 한 kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

어디 3 바이러스 성 게놈은 실험적으로 감염 된 침팬지의 chronicity에서 발생할 수 있습니다, vivo에서, B 형 간염 바이러스 (HBV)의 뛰어난 infectivity에도 불구 하 고 대부분 체 외 모델 셀 당 바이러스 성 게놈의 수천 수백 필요 일시적인 감염을 시작 하는 순서입니다. 또한, 기본 인간의 hepatocytes (PHH)의 정적 2D 문화 때문에 그들의 급속 한 dedifferentiation 단기 연구만 허용합니다. 여기, 우리가 monocultures 또는 다른 nonparenchymal 간 상주 셀 cocultures PHH의 3D 칩에 간 문화를 설명합니다. 이러한 생리 적인 호스트 세포 응답 장기 HBV 감염을 공부 하 고 상당한 개선을 제공 합니다. 약물 효능 연구, 독물학 분석, 그리고 병 인에 대 한 조사를 촉진, 뿐만 아니라 이러한 미세 문화 시스템 사용 covalently 폐쇄, 제거 목적으로 HBV 감염에 대 한 치료 치료의 평가 원형 (ccc) DNA입니다. 이 방법을 제시 설명 PHH monocultures PHH/Kupffer 세포 공동 문화, 그들의 순화 HBV 감염 및 호스트 응답의 분석 설정을 합니다. 이 방법은 특히 HBV 감염, 치료의 조합, 그리고 병의 장기 효과의 평가에 적용 됩니다.

우리는 기본 인간 Kupffer 세포 또는 hepatocytes 및 그들의 HBV 감염의 장기 문화에 대 한 간단 하 고 다양 한 플랫폼을 설명합니다. 기본 인간 세포는 지속적으로 성장 매체 (그림 1a)와 셀 perfuses 미세 플레이트 어셈블리 내에서 폴리스 티 렌 건설 기계 콜라겐 코팅에 시드.
보통만 안정적인 제한 시간 동안에 있는 기존의 문화 시스템, PHH 시간의 연장된 기간에 대 한 기능적으로 유지할 수 있습니다. 인간의 알 부 민, 기능 hepatocytes에 의해 은닉 되 고 간 대사의 평가 대 한 가장 좋은 표식으로 간주 됩니다, 안정적으로 그리고 높게 표현 된다 3D 문화에 의해 하루 40 포스트 시드 (그림 2)까지. Cocultures, 대 한 Kupffer 세포 기능과 생존 능력 (예: IL6 및 TNFα) 특정 cytokines의 분 비에 의해 평가할 수 있습니다. Cytokine 생산 측정, cocultures의 LPS 자극에 따라 캡처 기반 탐지 방법의 사용 것이 좋습니다 (그림 3).
셀은 PHH, 기능적 담 즙 canaliculi와 완전 한 셀 분극 (그림 2)을 보여주는의 뿌리기의 3 일 이내 간 microtissues를 형성 한다. 그들의 생리 적 세포 신진 대사를 유지 뿐만 아니라 이러한 문화 될 HBV 감염에 매우 취약. HBV DNA 및 다른 문화 시스템, 달리 다른 바이러스 성 마커 하루 2 감염 된 후 (그림 4)에서 쉽게 감지 된다. 분 비 바이러스 성 감염의 표식, 이외 hepatocyte 포함 된 건설 기계 문화에서 검색 하 고 수 바이러스 항 원의 면역 형광 탐지를 위해 사용 (예: HBsAg, HBcAg) (그림 4). 어디 기존의 hepatocyte 문화 요구 셀과 2 %DMSO 추가 당 적어도 500 HBV GE와 접종 하 고 4% 말뚝, 몇 가지 0.05 HBV GE로 DMSO의 페그 (그림 4)는 요구 하지 않고 3 차원 문화에 감염을 시작할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> 그림 1: 3 차원 칩에 간 문화의. (한) 이것은 문화 접시의 어셈블리에 대 한 도식 레이아웃 미세 순환의 설립을 위해. (b)이이 패널 표시를 포함 하 여 문화 웰 스의 근접 보기 필터 종이, 비 계, 그리고 유지 반지. (c)이이 패널은 문화를 뿌리기 전에 접시 평형의 과정을 보여 줍니다. 다음 두 개의 패널 시드 hepatocyte monocultures (d) 및 (e) hepatocyte/Kupffer 세포 cocultures의 과정을 보여줍니다. (f)이이 패널이 보여줍니다 세척 단계 중간 변경에 관련 된. (g)이이 패널 표시 inoculum의 제거를 포함 하 여 HBV 감염 설정. S.M. 시드 매체, mm은 = = 유지 보수 매체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> 그림 2: 간장 microtissue 형성과 hepatocyte 생존. (한)이이 패널 표시 다음 microtissue 형성을 보여주는 3D hepatocyte monocultures의 경도 명시 이미지 시드. (b)이이 패널 표시 핵 (파란색)을 위해 문화권의 면역 형광 이미징 및 인간의 알 부 민 (녹색). (c)이이 패널 경도 총 알 부 민을 보여줍니다으로 ELISA 정한 조정 hepatocyte monocultures의 40 일 동안 알 부 민 생산을 셀 당. 표시 된 데이터는 평균 ± sd. 이 그림은 오르테가-데이비스 외.4에서 적응 시켰다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> 그림 3: 3 차원 cocultures에 Kupffer 세포 기능. 이러한 패널 표시 (의한) IL6 분 비 및 (b) TNFα hepatocyte monocultures과 hepatocyte/Kupffer 세포 cocultures 인간의 자기를 사용 하 여 결정으로 하루 9 게시물 시드에 것 추가 LPS에 시드 후 11 일 Luminex의 시험 이 그림은 오르테가-데이비스 외.4에서 적응 시켰다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> 그림 4: HBV 감염 간 온 칩 문화에서. (한)이이 패널이 보여줍니다 HBcAg (레드), HBsAg (녹색), 및 핵 (파란색)의 면역 형광 검사 현미경 검사 법 검출 10 일 HBV와 문화의 감염. (b)이이 패널 문화의 문화 supernatants에서 HBV DNA의 정량화에 의해 결정으로 다른 복합성 감염의 사용 하 여 HBV 감염의 민감성을 보여줍니다. (c)이이 패널 내부 관리 유전자 RPS11 기준으로 HBV pgRNA의 경도 축적의 정량화를 보여줍니다. 표시 된 데이터는 평균 ± sd. 이 그림은 오르테가-데이비스 외.4에서 적응 시켰다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 "간-온-어-칩" 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

이 방법은 간부 감염 및 간 질환 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 간 상주 세포 인구의 기여등, 바이러스 병인, 세로 감염 운동학, 바이러스 복제 메커니즘, 면역 침입, 생리 모델 시스템 및 약물 검사 연구. 이 기술의 주요 장점은 간 미세 환경을 재구성하는 기능입니다.이는 오랜 기간 동안 유지 될 수 있으며 생리적 관련 수준에서 B 형 간염 감염에 자연적으로 취약합니다. 이것은 이전에 B형 간염 필드에 있는 근본적인 제약이었습니다. 약물 검사 연구는 연장된 기간 동안 생리적 플랫폼에서 수행될 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 HBV 감염의 치료 또는 진단으로 확장됩니다.이를 통해 기존 및 신규 치료 전략의 효능을 분석하는 결과순차적 약물 치료의 평가를 할 수 있습니다. 이 방법은 B형 간염에 대한 이해를 제공할 수 있으며, 다른 간편감염, 간 질환 또는 약물 대사 연구를 포함한 질병의 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 투쟁 할 것 이다, 그것은 오랜 기간 동안 간 조직의 성공적인 유지 보수를 허용 하기 위해 특정 세부 사항에 주의 필요 하기 때문에.또한 특수 공구 및 장비에 익숙합니다. 이 메서드의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 플레이트의 조립뿐만 아니라 세포의 해동 및 파싱을 포함한다.간 유래 세포의 장기 배양에 관여하는 단계는 새로운 배양 시스템을 사용할 때 도전적이기 때문에. 먼저, 간 칩 플랫폼과 관련된 압축기와 진공 펌프를 모두 켭니다. 유리 튜브 캐비닛으로 이동하여 접시를 조립하고 평형화합니다.소염수 판을 무균 조립하기 위해 플레이트 베이스에 멸균 멤브레인을 배치합니다. 멸균 멤브레인이 베이스 플레이트의 두 핀에 원활하게 놓여 있는지 확인합니다. 그런 다음 잘 함유 된 상단 플레이트를 추가합니다.멸균 플레이트 뚜껑을 추가합니다. 또한 33파운드로 설정된 자동 정밀 토크를 사용합니다. 나선형 조임 시퀀스를 사용하여 플레이트 베이스의 나사를 조입니다.수동 토크를 사용하여 모든 나사를 35 파운드로 조여 있는지 확인하십시오. 다음으로, 프라이밍 전에 간세포 파종 중간을 섭씨 37도로 미리 데우습니다. 완전히 조립된 접시를 세탁도크에 놓습니다.그리고 접시가 완전히 스냅 있는지 확인하십시오. 각 웰의 저수지 측에 간세포 파종 배지 400 마이크로리터를 추가하여 판을 프라임합니다. 그 후 초당 1마이크로리터에서 3.5분 동안 위쪽으로 흐름을 시작합니다.플레이트 측면의 빨간색 표시기는 미세 유체 순환이 제대로 작동하는지 나타냅니다. 배지가 플레이트의 세포 성장 측에 펌핑되면 간세포 종자 배지의 1.2 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 37°C와 5%의 CO2에서 가습된 인큐베이터 내에 도킹 스테이션으로 조심스럽게 옮기면 됩니다.16시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 시작합니다. 그 후 접시를 세탁도크로 옮기습니다. 거품을 제거하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫.멸균 집게를 사용하여 각 웰에 멸균 원형 필터 용지를 추가합니다. 그런 다음 셀 부착 스캐폴드와 각 웰에 유지 링을 추가합니다. 멸균 플런저를 사용하여 각 우물을 밀어 내고 고정 링과 비계를 제자리에 고정하십시오.다음으로 모든 매체를 흡인합니다. 그리고 스캐폴드 위에 미리 데워진 간세포 파종 배지 400마이크로리터를 부드럽게 추가합니다. 3 1/2 분 동안 초당 한 마이크로 리터에서 아래쪽 방향으로 흐름을 시작합니다.플레이트의 저수지 측에서 펌핑된 모든 매체를 흡인합니다. 각 웰에 간세포 파종 배지의 1.4 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 도크에 반환하여 최대 1.6 밀리리터당 총 부피를 가져옵니다.첫째, 간세포 해동 매체및 간세포 파종 중37도까지 미리 데워보겠습니다. 다음으로, 공급 업체의 지시에 따라 기본 인간 간세포의 한 유리병을 해동. 유리 튜브 캐비닛에서 간세포 파종 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.그런 다음 다시 중단된 세포를 얼음 위에 놓습니다. trypan blue를 사용하여 셀의 생존 가능성이 90% 이상이되도록 셀을 세어 완전히 조립된 플레이트를 세척 도크로 옮길 수 있습니다. 그리고 우물에서 모든 매체를 흡인.얼음에서 세포를 검색하고, 간세포 파종 배지의 500 마이크로 리터 부피에서 각 우물에 600, 000 간구를 추가합니다. 초당 1마이크로리터의 유량으로 하향 방향으로 흐름을 시작합니다. 각 웰에 900 마이크로리터의 간세포 파종 배지를 추가하여 각 웰의 총 부피를 1.6 밀리리터로 가져옵니다.플레이트를 37°C에서 가습된 인큐베이터 내에 5%의 CO2로 옮기는 경우. 8시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 하향 방향으로 흐름을 시작합니다. 그 후, 8시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 반전시다.그런 다음 접시를 세면 선착장으로 옮기고 우물에서 모든 매체를 흡인합니다. 각 웰에 400 마이크로리터의 간세포 유지 보수 매체를 추가합니다. 그리고 3 1/2 분 동안 초당 하나의 마이크로 리터의 유량으로 하향 방향으로 흐름을 시작합니다.다음으로, 저수지에서 모든 매체를 흡인하고 간세포 유지 보수 매체의 1.4 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 가습된 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션으로 옮기면 섭씨 37도, CO2 5%로 이동합니다. 48시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 시작합니다.48 시간 후, 세척 도크에 전송하여 접시를 씻어. 우물에서 모든 매체를 흡인. 또한 유지 보수 매체의 400 마이크로 리터를 추가합니다.그리고 3.5 분 동안 초당 한 마이크로 리터에서 아래쪽으로 흐름을 시작합니다. 그런 다음 우물의 저수지 측에 나타나는 모든 매체를 흡인합니다. 간세포 유지 보수 매체의 1.4 밀리리터를 추가합니다.그런 다음 가습 된 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 플레이트를 다시 옮기합니다. 48시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 시작합니다. 48시간마다 이 세척 및 교체 공정을 사용하여 매체를 교체하십시오.1차 인간 간세포는 일반적으로 기존의 배양 시스템을 사용할 때 제한된 시간 동안만 안정됩니다. 그러나 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 장시간 기능적으로 유지 관리할 수 있습니다. 인간 알부민은 기능성 간세포에 의해 분비되며 간 기능을 평가하기위한 최고의 마커로 간주됩니다.알부민은 적어도 날 40 포스트 시드까지 3D 문화에 의해 안정적으로 높게 표현되는 것으로 보입니다. 공동 배양의 경우, Kupffer 세포의 기능성과 생존능력은 특정 사이토카인의 분비를 측정하여 평가됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이, IL-6 및 TNF 알파의 측정된 수준은 세포가 기능적으로 유지되고 실행 가능하다는 것을 나타냅니다.그들의 생리적인 세포 대사를 유지하는 것 이외에, 이 문화는 HBV 감염에 예외적으로 영향을 받기 쉽게 되었습니다. HBV DNA 및 그밖 바이러스성 마커는 감염 후 2일에서 쉽게 검출될 수 있습니다. 기존의 배양은 DMSO 와 PEG로 보충된 적어도 500HBV 게놈 등가물로 접종을 요구하지만, 이러한 3D 배양은 05만큼 적게 보충되지 않은 게놈 등가물로 감염됩니다.바이러스 감염의 분비 마커 이외에, 간세포 함유 발판은 이 배양에서 회수됩니다. 면역 형광 현미경 검사는 이 비계가 바이러스성 항원이 포함되어 있다는 것을 밝힙니다. 이 절차를 시도하는 동안, 세포 죽음을 피하기 위해 시드하기 전에 간세포를 처리 할 때 부드러운 것을 기억하는 것이 중요합니다.또한 플레이트가 올바르게 조립되고 모든 흐름 채널이 간구체를 시드하기 전에 올바른 미디어 순환을 허용하는 것이 필수적입니다. 이 절차에 따라, 면역 형광과 같은 그밖 방법은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다. 조직 내 감염된 세포의 위치 및 빈도를 포함한다.간세포의 생리적 상태는 또한 단단한 접합 단백질 ZO-1을 포함하는 알부민 또는 간 구조물을 염색하여 평가될 수 있다. 이 발달 후에, 이 기술은 생리적인 3D 모형 시스템에서 B형 간염 감염 및 면역 반응을 탐구하는 바이러스학의 필드에 있는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다. B형 간염 바이러스와 함께 일하는 것은 위험할 수 있고, 이전 예방 접종, 적절한 PPE의 사용, 적절한 생물 안전 지침에 따라 일하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

liver-on-chip-cultures-primary-hepatocytes-kupffer-cells-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

여기서 우리는 HBV의 생활주기의 초기 단계를 모니터링하는 새롭게 개발 된 B 형 간염 바이러스 (HBV) 리포터 시스템을 설명한다. 시험 관내 시스템에서 간략화 이것은 높은 처리량 전략을 사용 항 HBV 에이전트 스크리닝 도울 것이다.

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

이 원고는 인간 NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα를 발현하는 새로운 엔지니어링 293T-NE-3NR및 전통적인 간 세포(HepG2-NE, 인간 NTCP를 표현하는 HepG2-NE)에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

비 간염 293T-NE-3NRs 세포에 있는 B형 간염 바이러스 감염을 모델링

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드

여기에서는 쥐 눈의 전방에 생착된 간 스페로이드의 비침습적 in vivo 이미징을 허용하는 플랫폼에 대해 설명합니다. 워크플로우는 일차 간 세포에서 스페로이드를 생성하는 것부터 마우스 눈에 이식하고 컨포칼 현미경을 통해 세포 해상도로 생체 내 이미징을 수행하는 것까지 다양합니다.

쥐 눈의 전방에 생착된 간 회전 타원체의 In vivo 이미징

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

학습하세요 간-온-어-칩 기술을 이용한 B형 간염 바이러스 감염 실험 방법을. 인간 간세포와 쿠퍼세포를 3D 배양하여 생리학적 간 미세환경을 재현하고 장기간 유지하며 바이러스 복제와 면역 반응을 연구할 수 있습니다.

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

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