Name: 티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 학습하세요 C. elegans 생식선에서 EdU를 이용한 S상세포 식별 및 세포주기 동태 분석 방법을. 이 기법은 형질전환 없이 면역형광염색과 호환되어 노화 및 영양 연구에 활용됩니다.

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우리는 MG1693;에 대 한 대장균 재고 센터에 감사 Wormbase; 프로그램에 의해 국립 연구소의 건강 사무실의 연구 인프라 (P40OD010440) 긴장;에 대 한 투자는 꼬마 유전학 센터 자크 Pincus 통계 조언; Aiping Feng 시 약;에 대 한 루크 슈나이더, 안드레아 Scharf, Sandeep 쿠마, 그리고 교육, 조언, 지원, 및 유용한 토론; 존 브 레너 그리고이 원고에 피드백 Kornfeld Schedl 실험실. 이 작품 부분 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 주식, TS R01 GM100756 [R01 AG02656106A1]와 [당선-1143954와 ZK DGE-1745038] 국립 과학 재단 predoctoral 친목. 건강의 국가 학회도 국립 과학 재단 연구, 수집, 분석, 및 데이터의 해석의 디자인에도 원고를 쓰기에 어떤 역할을 했다.

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저자는 공개 없다.

듀 라는 박테리아 (단계 1)의 준비는이 프로토콜 및 문제 해결을 위한 첫 번째 포인트에 대 한 중요 한 이다. 야생-타입 젊은 성인 광고에 나온 것 4 h 듀-펄스, 듀 라는 박테리아의 모든 새로운 배치를 위한 유용한 컨트롤 만들기에 매우 안정적으로 레이블. 또한, 소장 (입력 더 오래 된 동물 또는 특정 인 두/분쇄기 결함이 있는 돌연변이) 그대로 듀 라는 박테리아 클릭 화학 레이블 하 고 용기에 밝은 직사각형 puncta로 나타납니다. 광고에 나온 것을 라벨에 대 한 대체 기술 듀3의 높은 농도 (1 mM) "소"를 사용 합니다. 이 기술은,의 기간에 대 한 동물을 starves 하지만 고정 문제를 해결할 때 만드는 듀 라는 박테리아를 무시 하 고 화학을 클릭 하는 유용한 방법을 제공 합니다. 듀 피드 동안 듀 "적신 다" 실험 성공 하면 다음 신선한 듀 라는 박테리아를 준비 합니다. 도달 하기 위해 충분 한 세균 밀도 높은 듀 콘텐츠를 달성 하는 동안, 하나 듀와 티 미 딘 농도...

동물 개발에 수백, 수천, 수백만, 수십억, 또는 심지어 수조 세포 분열의 성인 유기 체를 형성 하기 위하여 필요 합니다. 세포 주기 G1 세포 이벤트 집합 구성 (gap), S (합성), G2 (gap), M (유사 분열) 정의 일련의 이벤트 실행 각 세포 분열. 세포 주기는 역동적이 고 실시간으로 기술적으로 어려울 수 있는 최고의 평가입니다. 이 프로토콜에 기술 단계 측정 및 스틸 이미지에서 세포 주기의 타이밍을 만드는 수 있습니다.
꼬마 선 충 (C. 선 충) 성인에서 세포 주기 역학의 연구에 S 단계를 식별 하는 금 본 위 제는 nucleoside 아날로그 deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2' 등 deoxyuridine (BrdU)-5-브로 모-2'로 자웅 동체 생식1,2,3,,45. 로 그들은 어떤 유전자 구조에 의존 하지 않는 거의 모든 유전적 배경에 듀와 BrdU 사용할 수 있습니다. BrdU 시각화 안티 BrdU 항 체 얼룩이 지기은 종종 다른 세포 마커 추가 항 체와 공동 얼룩에 의해 시각의 평가와 호환에 대 한 항 원 노출에 가혹한 화학 치료를 필요 합니다. 대조적으로, 듀 시각화 클릭 화학 가벼운 조건에 의해 발생 하 고 따라서 공동6,7을 얼룩이 지는 항 체와 호환 됩니다.
라벨의 특이성은 분명, 이후 핵만 포함 티 미 딘 (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 유사 체 DNA로 S 단계. 시각화는 고정된 조직에서 일어난다. 듀 라벨 보이지 않으면 저절로 아 지 드를 포함 하는 염료까지 또는 fluorophore 클릭 구리 촉매 화학8듀에 alkyne covalently 반응. 듀 라벨에 핵은 S-위상, 라벨의 짧은 펄스를 사용 하 여 즉각적인 정보를 제공할 수 있습니다. 듀도 정보를 제공할 수 동적, 펄스-체이스 또는 연속 라벨;를 사용 하 여 예를 들어 펄스-체이스 실험 레이블이 각 세포 분열에서 희석 또는 개발을 통해 서 nondividing 세포 진행을 전파.
C. 선 충 자웅 동체 생식 통로, 줄기 세포, 감수 분열, 세포 주기 신호의 연구에 대 한 강력한 모델 시스템입니다. 성인 생식 줄기 세포 항목 및 meiotic 의향, 더 proximally gametogenesis 단계 조정 (그림 1)를 통해 진행 하는 원심 끝에 편광된 조립 라인입니다. 근 위 끝에 oocytes 성숙, ovulated는 수정 고 자 궁9,,1011에 embryogenesis 시작. Meiotic 의향에 mitotically 자전거 생식 줄기, 뿌리 세포와 meiotic S 단계 세포 하지만 되지 셀을 포함 하는 원심 끝 셀 근처 ~ 20 셀-직경 긴 지역 이라고 조상 영역2,4 , 9 , 12. 세포 막 원심 생식에서 핵 사이 불완전 한 분리를 제공 하지만 조상 영역 셀 mitotic 세포 주로 독립적으로 자전거를 받 다. 젊은 성인 광고에 나온 것에 생식 조상 영역 셀의 메디아 mitotic 세포 주기 기간은 ~6.5 h; G 1 단계는 간단한 결 석, 또는 정지1,,213관찰 하지는. 생식 줄기 세포 분화 본질적으로 직접 차별화를 통해 발생 하 고 따라서 부족 교통 증폭 사단4. Pachytene 단계에서 차별화, 동안 약 4 5 점 만점 핵 oocytes를 형성 하지 않습니다 하지만 대신 apoptosis, 세포질 내용을 개발 oocyte12,14 에 기부 하 여 간호사 셀 역할을 받 다 , 15.
Nucleoside 아날로그와 S 단계에서 레이블 셀, 뿐만 아니라 하나의 유사 분열, 감수 분열이 항 체는 얼룩이 지를 사용 하 여 셀을 식별할 수 있습니다. 유사 분열에서 핵은 안티-인-히스톤 H3를 immunoreactive (Ser10) 항 체 (pH3 라고)7,16. 감수 분열에서 핵은 안티-그-3 항 체 (meiotic 염색체 축 단백질)17에 immunoreactive. 조상 영역에서 핵 그-3, nucleoplasmic REC-818의 존재 나 WAPL-119의 존재에 의해 확인할 수 있습니다. WAPL-1 강도 이며 조상 영역에서 높은 체세포 생식에 높은 낮은 초기 meiotic prophases19동안. 여러 가지 세포 주기 측정 프로토콜에 몇 가지 변형 가능 하다: 나) S 단계에서 핵을 식별 하 고 측정 하는 S 단계 인덱스; II) M 단계에서 핵을 식별 하 고 측정 M 단계 인덱스; III) 핵 mitotic 또는 meiotic S 단계;에 있던 여부를 결정합니다 4) g 2;의 기간을 측정 V) 측정 g 2 + M + G1 단계; duartion VI) meiotic 항목;의 속도 측정 VII) meiotic 진행의 속도 추정 합니다.
하나는 몇 가지 유형의 젖은 실험실 실험에서 여러 세포 주기 측정을 만들 수 있습니다. 프로토콜 아래 듀 박테리아와 공동 레이블 M 단계 셀 이라고 표시 된 안티-pH3 항 체와 조상 영역 셀 안티-WAPL-1 항 체와 얼룩에 의해 얼룩이와 선 충 C. 성인 광고에 나온 것을 먹이로 라벨 30 분 펄스에 설명 합니다. 듀 피드 (2.5 단계), 항 체의 종류 기간에 유일한 변화 고용 (5 단계), 그리고 분석 (단계 8.3) 추가 측정을 위해 필요 합니다.

<table><tbody><tr><td>E. coli MG1693</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6411</td><td>은 표준 비보충 LB</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>900584-50MG</td><td>또는 키트에 제공된 EdU를 사용하십시오</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>D9434-500G</td><td>D-(+)-덱스트로오스</td></tr><tr><td>티아민(비타민 B1)</td><td>시그마</td><td>T4625-5G</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>티미딘</td><td>시그마</td><td>T1895-1G</td><td>생물시약</td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>시그마</td><td>M1880-1KG</td><td>MgSO4, 시약 등급</td></tr><tr><td>인산나트륨, 이염기성, 무수</td><td>피셔</td><td>BP332-500G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기</td><td>성 시그마</td><td>P5379-500G</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>시그마</td><td>A4514-500G</td><td>NH4Cl, 시약 플러스</td></tr><tr><td>세균학 한천</td><td>US 생물학적</td><td>C13071058</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마</td><td>C3881-500G</td><td>CaCl</td></tr><tr><td>LB 육수(밀러)</td><td>시그마</td><td>L3522-1KG</td><td>25g/L</td></tr><tr><td>레바미솔</td><td>Sigma</td><td>L9756-5G</td><td>0.241g/10ml</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Calbiochem Omnipur</td><td>6506</td><td>수제 PBS는 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드, EM 등급 앰플</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>10ml 앰플</td></tr><tr><td>100% 메탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A454-1L</td><td>골드 라벨 메탄올은 특정 항체의 적절한 형태학에 매우 중요합니다</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td>Lot</td></tr><tr><td>1671330 rabbit-anti-WAPL-1</td><td>Novus biologicals</td><td>49300002</td><td>Lot G3048-179A02, 1:2000에서 사용</td></tr><tr><td>mouse-anti-pH3 clone 3H10</td><td>Millipore</td><td>05-806</td><td>Lot#2680533, 1:500</td></tr><tr><td>에서 사용염소-안티-토끼 IgG-conjugated Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Lot 1256147, 1:400에서 사용</td></tr><tr><td>염소-안티-마우스 IgG-conjugated Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Lot 1511347, 1:400에서 사용</td></tr> 4<tr><td>',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)Vector Laboratories H-1200을 포함하는 Vectashield 안티페이드 마운팅 매체</td><td></td><td></td><td>DAPI가 없는 장착 매체를 대신 사용할 수 있으며, 별도의 DAPI 배양</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>Wet n Wild</td><td>DTC450B</td><td>따라 모든 투명 매니큐어가 작동해야 합니다</td></tr>. <tr><td>S-medium</td>은 <td>프로토콜</td><td></td> M9 버퍼<td>에 대한 다양한 wormbook.org 참조</td></tr>, <tr><td></td> 프로토콜<td></td> M9 한천 <td></td> 에 대한 다양한 wormbook.org 참조<td>, M9 버퍼와 다양한 동일한 레시피를 참조하지만 1.7% 한천을 추가해야 합니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>선충 성장 매체</td><td>다양한</td><td></td><td>프로토콜</td></tr><tr><td>해부 wormbook.org 시계 유리</td><td>캐롤라이나 생물학</td><td>42300</td><td></td></tr><tr><td>파라 필름 실험실 필름</td><td>Pechiney 플라스틱 포장</td><td>PM-996</td><td>4 인치 와이드 실험실 필름</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td>직경 60mm</td></tr><tr><td>긴 유리 파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1ml 원심분리기 튜브</td><td>MidSci Avant</td><td>2926</td><td></td></tr><tr><td>팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL 에를렌마이어 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8" 바늘</td><td>BD PrecisionGlide&nbsp;</td><td></td><td></td>305122</tr><tr><td>5ml 유리 원심분리기 튜브</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리관 1ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>번호 1 커버 슬립 22 x 40 mm</td><td></td><td></td><td>번호 1.5 작동 할 수 있습니다, 또한</td></tr><tr><td>37 &deg; C 셰이커 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>임상 원심 분리기</td><td>IEC</td><td>428</td><td>6 스윙 버킷 로터</td></tr><tr><td>미니 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &deg; C 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C 냉장고</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>-20 &deg; C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 63X 1.4 오일 액침 대물 렌즈</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraview Vox 회전 디스크 컨포칼 시스템</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td></td><td>Nikon 스피닝 디스크 컨포칼 시스템은 여기에 설명된 바와 같이 매우 잘 작동합니다 http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&nbsp.</td></tr></tbody></table>

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 c. 생식에 세포 주기 분석

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

진핵생물의 세포 주기 분석 염색체 형태, 식 및 세포 주기의 다양 한 단계 또는 nucleoside 아날로그의 설립에 필요한 유전자 제품의 지역화에 자주 활용 합니다. S 단계, DNA polymerases 분석에 대 한 셀을 표시 하는 염색체 DNA에 듀 등 BrdU 티 미 딘 아날로그를 통합 합니다. C. 선 충는 nucleoside 아날로그 듀 일반 문화 중 벌레는 먹이 및 immunofluorescent 기술을와 호환 됩니다. C. 선 충 의 생식은 신호 경로, 줄기 세포, 감수 분열, 세포 주기 때문에 투명 하 고, 유전으로 손쉬운 meiotic 의향 및 세포 분화/gametogenesis 발생의 연구에 대 한 강력한 모델 시스템을 선형 어셈블리 같은 패션. 이러한 기능에 듀 mitotically 자전거 세포 및 생식 개발의 동적 측면을 연구 하는 훌륭한 도구를 확인 합니다. 이 프로토콜 성공적으로 듀 박테리아를 준비, 야생-타입에 피드 하는 방법에 설명 합니다 선 충 C. 광고에 나온 것, 자웅 동체 생식 해 부, DNA에 듀 설립 얼룩 얼룩 다양 한 세포 주기를 검출 하기 위하여 항 체와 고 발달 마커, 생식을 이미지 하 고 결과 분석. 프로토콜은 메서드 및 S 단계 인덱스, M-인덱스, g 2 기간, 세포 주기 기간, meiotic 항목의 위상과 meiotic 의향 진행의 속도의 측정에 대 한 분석에 있는 변이 설명합니다. 이 방법은 세포 주기 또는 다른 조직, 단계, 유전적 배경, 생리 적 조건에 셀 역사 연구에 적응 될 수 있다.

때문에 DNA 종합에 듀 통합 하는 데 필요한, 하나 듀 라는 핵 듀 라벨 시간 창 동안 S 단계 수술을 가정할 수 있습니다. 하나는 핵 해 부의 때에 S 단계에서 핵으로 박테리아를 분류 하는 듀와 수 유 30 분에 라벨을 해석할 수 있습니다. 핵 실험을 먹이 더 이상 연속 듀에 레이블을 지정 하는 시간 창에 왼쪽된 S 단계부터 초기 레이블을 수 또는 듀 시간대의 후반 부분에 레이블을 수 있습니다. 듀 신호 공동 DAPI 신호와 localizes. 일부 핵에 듀 신호 다른 핵에 듀에서 신호 localizes 1-2 밝은 puncta (그림 4)를 하는 동안 모든 염색체를 다루고 있습니다. 이 puncta은 S 상13에 늦게 복제를 x 염색체.
동물 들이 여기,에 듀와 함께 지속적으로 30 분...

이미징 기반 메서드를 설명 하는 S 단계를 식별 하 고 사용 하는 티 미 딘 C. 선 충 자웅 동체 생식 세포 주기 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있는 아날로그 듀. 이 메서드와 필요 없는 transgenes immunofluorescent 얼룩과 호환 됩니다.

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

이 방법은 C.elegans에 있는 세포 주기 및 세균 선 줄기 세포 인구 역학에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 트랜스유전자가 필요하지 않으며, 면역 형광 염색과 호환되며, 많은 다른 조건하에서 세포를 연구하도록 수정될 수 있다는 것입니다. 나는 처음 Scheda 실험실에서 사용되는이 방법을 보았을 때 매우 흥분했다.이 방법은 C.elegans 세포 주기에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 노화에 대한 광범위한 질문에 적용 될 수있다, 영양, 또는 변경 된 유전자형. 일반적으로 이 방법에 새로운 실험실은 초기 절제 또는 C.elegans 헤마톡시린 염색으로 어려움을 겪을 수 있습니다. 멸균 기술을 사용하여 10 밀리미터 EdU의 200 마이크로리터를 M9 버퍼 100 밀리리터에 추가하고 하룻밤 MG 1693 E.coli 배양4 밀리리터에 적절한 보충제를 추가하십시오.특이하게 만드는 것은 EdU와 티미딘 보충 사이의 섬세한 균형이 필요합니다. 티미딘의 양이 E 대장균이 잘 자라기에는 충분해야 하며, EdU의 양은 레벨링에 대한 견고한 쉴드에 충분해야 합니다. 섭씨 37도 및 RPM 200에서 24시간 이상 후 멸균 기술을 사용하여 원심분리를 위해 멸균 50밀리리터 원간 튜브 2~4개 사이를 배양합니다.신선한 M9 버퍼의 펠라틴 4 밀리리터를 다시 중단하고 개별 실온 60 밀리리터 M9 가드 페트리 접시의 중심에 E Coli MG1693 용액의 약 8 방울을 적용하기 위해 동일한 파이펫을 사용합니다. EdU 라벨이 부착된 박테리아를 선충에 먹이려면 신선한 PBS를 사용하여 선충 성장 중형 식기에서 C.Elegans를 1.5 밀리리터 튜브로 세척하고 동물이 중력에 의해 잠시 정착할 수 있도록 합니다. PBS의 1 밀리리터로 동물을 1~2회 씻고 유리 파스퇴기 파이펫을 사용하여 선충을 EDU 잔디 의 중앙으로 옮기는 작은 PBS 한 방울을 사용하십시오.실험 프로토콜에 따라 액체가 흡수되고 20°C에서 적어도 30분 동안 배양할 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 의 밀리리터 2개를 사용하여 EdU 배양 판에서 유리 해부 접시에 벌레를 플러시합니다. 앞서 설명한 바와 같이 선충 고나드의 해부 및 고정 후, 0.1%tween 20으로 보충된 PBS를 사용한 작은 1밀리리터 보로실리케이트 유리 튜브와 긴 유리 파스퇴르 파이펫을 헹구고 파이펫을 사용하여 고정 된 조나드를 소량의 PBS tween으로 튜브로 전송합니다.원심분리로 조나드를 수집하고 길고 그려진 유리 목초지 파이펫을 사용하여 고나드 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼나텐트를 제거합니다. EdU 감지를 위해 100 마이크로리터의 클릭 EdU 칵테일을 조나드에 추가하고 실온에서 30~60분 동안 실험실 필름으로 튜브를 덮습니다. 인큐베이션이 끝나면 gonads를 100 마이크로리터의 반응 헹구기 버퍼로 한 번, PBS 트위엔 1밀리리터로 4회 세척합니다.마지막 세척 후, 샘플에 DAPI로 보충 된 페이드 장착 방지 배지의 25 마이크로 리터를 추가합니다. 매체가 곤나위에 정착하는 동안, 표준 유리 현미경 슬라이드에 큰 2.5 %의 아가로즈 패드를 놓습니다. 그런 다음 두 번째 슬라이드로 평평하게 합니다.다음으로, 긴 유리 파스퇴기 파이펫을 사용하고 조나들을 패드로 옮길 때 시료 손실을 최소화하기 위해 파이펫의 좁은 끝에 액체와 조나들을 모두 보관한다. 이쑤시개에 붙은 속눈썹을 사용하여 아가로즈 패드 위에 곤드를 분배하고 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 직사각형 유리 커버를 천천히 낮추어 곤나드에 미끄러져 기포를 피하고 실험실 조직으로 과도한 용액을 제거합니다.셀을 3차원으로 계산하는 것은 몇 가지 연습을 안정적으로 수행합니다. 피지의 셀 카운터 플러그인및 같은 스크립트를 사용하여 중복을 제거하기 위해 세포를 표시하면 카운트가 재현 가능하게됩니다. 커버 슬립이 하룻밤 사이에 정착할 수 있도록 허용한 후, 셀 카운터 플러그인과 피지를 사용하여 각 핵을 수동으로 계산하여 인포이스톤 3EdU 또는 프리제너터 존 세포 라벨링의 존재 또는 부재에 따라 각 개별 핵에 라벨을 부착합니다.EdU 신호는 DAPI 신호와 공동 지역화됩니다. 일부 핵에서, EdU 신호는 염색체의 모든 것을 커버하고, 다른 핵에서는, EdU 신호는 S-phase에서 늦게 복제하는 X 염색체에 확률이 높은 1-2개의 밝은 punkta로 국소화합니다. 성공적인 30분 라벨링으로부터의 EdU 신호는 프리제너터 영역에서 핵의 약 절반으로 국소화한다.이 기술은 야생 형 젊은 성인 동물에서 일관되게 작동하지만, 짝짓기 5 일 된 hermaphrodites의 상당 부분은 30 분 EdU 펄스에 레이블을 지정하지 못합니다. G2의 지속 시간은 시간 과정 동안 EdU 양성인 M-phase에서 핵의 백분율을 분석하여 추정할 수 있어 G2의 중앙값 및 최대 지속 시간을 계산할 수 있습니다. G2 및 G1의 지속 시간은 EdU 양성인 모든 전유전자 종구 핵의 백분율로부터 추정될 수 있으며, 결합된 단계의 최대 지속 시간을 계산할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 EdU 접시 배치를 사용하여 실험 간 가변성을 최소화하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 추가 항체로 염색과 같은 그밖 방법은 세포 주기, 세포 운명, 또는 신호 경로에 관하여 추가 질문에 수행하거나 대답할 수 있습니다. 핵제거 유사체와 파라페멜다히드를 사용하면 위험할 수 있으며, 니트롤 장갑착용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

cell-cycle-analysis-c-elegans-germline-with-thymidine-analog

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 성인 생쥐의 조직에 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 이 전략은 세포 수명이 긴 조직의 매상, 종양 발생 변형, 또는 교통 - 확장 세포를 감지하는 데 유용합니다.

기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다.

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.

엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화

5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila 신경 줄기 세포에서 세포 주기 진행 분석을 위한 5-에티닐-2'-Deoxyuridine/인성-히스톤 H3 이중 라벨링 프로토콜

우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

학습하세요 C. elegans 생식선에서 EdU를 이용한 S상세포 식별 및 세포주기 동태 분석 방법을. 이 기법은 형질전환 없이 면역형광염색과 호환되어 노화 및 영양 연구에 활용됩니다.

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

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