Name: 처음 초 유 수 유 전후 개별 Oxytocin 분 비 뇌 핵 신생아 쥐에 있는 염증과 세포 스트레스 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 신생아 쥐 뇌 핵 분리 기법을 통해 초유 수유 전후 스트레스 신호 경로를 분석하는 방법을. 이 기술은 발달 생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자는이 프로토콜을 준비 하 고 있는 그들의 원조에 대 한 마 농 레인저와 알 렉 산드라 슐츠를 감사 합니다.

이 연구는 기관 동물 관리 및 사용 컬럼비아 대학과 뉴욕 주립 정신 연구소에서 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 조직 준비
<ol><li>공급 업체에서 초과 임신 쥐를 주문.</li>
	<li>따라 초과 임신 쥐 주 그들의 도착 후에 그들의 성장 인체를 관찰 하 고 그 후 찾고 새끼 예상된 배달 날짜에 감 금 소를 검사 하 여 모든 2 시간 배달 시작 될 때까지.</li>
	<li>Timeli는에 설명 된 대로 그들의 첫 번째 피드 unprimed 새끼 (아니 흰 우유 배는 명백한 복 부를 볼 때) 또는 (이때 흰색 위 표시 됩니다 그들의 복 부에) 끝났다 새끼에 대 한 첫 번째 피드 후 전에 그들의 꼬리에 의해 장갑 낀 손으로 새끼를 제거 네브라스카 (그림 S1)입니다. 참고: 첫 번째 colostrum 피드는 되 나 못쓰게 강아지; 따라서, 강아지 되지 않습니다 끝났다 후 초 유 액은 첫 번째 피드까지.</li>
	<li>신속 하 게 선명 하 고 깨끗 한 수술가 위를 사용 하 여 unanesthetized 강아지 목을 벨.</li>
	<li>코에 중간 및 두개골의 윗 표면 아래로 피부를 절단 하 여 뇌를 제거 합니다. 그런 다음 집게를 사용 하 여, 부드럽게 놀 리 려 멀리 뼈 뇌 (그림 1A)를 노출 하 고 지역화 bregma, 뼈 격판덮개 제거 펜으로 표시 (그림 1B).</li>
	<li>빠르게 실내 온도 (그림 1C)에 부 러 뜨 리는 혀끝에 대 한 실 온에서 polymethyl 메타 크리 레이트 뇌 형에서 전체 뇌를 놓습니다.</li>
	<li>지체 없이 500 m m 두꺼운 조각 신선한 면도날을 사용 하 여 확인 합니다. Rostral 섹션 (그림 2)의 방향을 유지 하기 위해 페 트리 접시에 꼬리를 조각 하다.</li>
	<li>신속 하 게 인공 뇌 척수 (실제, 1.0 m m KH2포4, 26mm NaHCO3, 118.6 m m NaCl, 3.0 m m KCl, 203.3 m m MgCl2-6 H2O) 없이 포도 당을 추가 하 고 끊임없이에 감동 28-30 ° C에서 60 분에 대 한 슬라이스를 품 어는 metabolically과 차동 초 유 액 조직 대는 unprimed 도전 쉐 하이 궤도 커</li>
	<li>조직 섹션에 뇌 아틀라스33 와 해부학을 사용 하 여 펀치 하는 데 필요한 뇌 핵을 식별 합니다. 페 트리 접시에 관심의 핵이이 슬라이스를 놓고 해 현미경을 이동 합니다.</li>
	<li>시각, 일단 신속 하 게 일관 되 게 가장 문제의 핵 펀치 크기 coring 도구를 사용 하 여 6 다른 핵의 4 하 고 다음으로 샘플 (그림 2) 사이 밖으로 펀치를 합니다. 참고: 나머지 뇌 조각 지금 해야한다 구멍 뇌 조직의 제거 되었습니다. 이 연구에서 우리는 사용 하 여 다음 핵 excised는 좌표 아래. 모든 앞쪽/후부 (A / P) 좌표는 (를 제외 하 고 국세청은 창포 Scriptorius에 관하여) Bregma에서. 모든 지 느 러 미/복 부 (D/V) 좌표는 (국세청, 모 수의 표면에서)를 제외 하 고 피 층의 표면에서. 다음 좌표 포함 A / P, 중간/측면 (M/L), 및 D/V m m에서: 1) 독방로 핵 (국세청, A / P, 0.4 0.8; L, ± 0.2; D/V, 0.3 (모 수의 표면)에서 2) paraventricular 핵 (PVN,-0.8; ± 0.2; 0), 3) 위에 광학 핵 (아들,-1.1; ± 1.4; 4.3), 4) 피 질 (CX, 부분 피 질 영역 1,-2.8; ± 1.5; 0.6), 5)가 핵 (STR,-0.0; ± 1.6, 1.8), 6) 중간 preoptic 핵 (MPO,-0.6; ± 0.2; 4.2).</li>
	<li>빠르게 60 분 (2.3 단계 참조)에 대 한 protease 억제제와 인산 가수분해 효소 억제제를 포함 하는 얼음, 단백질 추출 버퍼의 0.06 ml에서 천공된 핵 담가.</li>
</ol>2. 단백질 추출
<ol><li>예상된 강아지 배달 하기 전에 하루에 단백질 세포 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 단백질 추출 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼 키트의 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 냉동된 (-20 ° C) 용액 (얼음)에 thaw 고 얼음에 세포의 용 해 버퍼 및 프로 테아 제/인산 가수분해 효소 억제제의 DMSO 솔루션을 놓습니다.</li>
	<li>깨끗 하 고 차가운 15 mL 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 1.85 mL를 추가 합니다. 그런 다음, 억제제의 수성 해결책의 DMSO 녹 억제제의 0.05 mL 0.1 mL를 추가 합니다. 마지막으로, 모자 하 고 간단히 소용돌이 튜브 사용까지-20 ° C에서 그것을 유지.</li>
	<li>24 깨끗 한 microcentrifuge 튜브 (각 0.5 mL)는 세포 절차에 대 한 레이블을 지정 합니다. 지정 12 colostrum unprimed 그룹 (U) [6 왼쪽 (L)와 6 오른쪽 (R) 뇌 핵], 그리고 핵 약어에 따라 라벨에 대 한 뇌 당 측면, 및 조건 (예., 국세청-L-U, 국세청-R-U, 등). 초 유 액 샘플 12 관의 두 번째 그룹 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>레이블 튜브의 두 개의 추가 세트 단계 2.4 재고 단백질 추출 물 (1.5 mL Eppendorf 스타일 튜브를 사용 하 여)에 대 한 샘플 준비 (0.5 mL 튜브를 사용 하 여)의 첫 번째 집합에 대 한에서 다. 두 개의 별도, 레이블이 냉동 상자에 (각각 100 튜브에 대 한 설계)이이 관을 유지. 한 상자 unprimed 예제 및 끝났다 샘플에 대 한 다른 사용 됩니다.</li>
	<li>새끼, 전달 당일과 실제, (2.4 단계)에서 세포 절차 튜브에 aliquot 0.06 mL 세포 솔루션에에서 뇌 조각 잠복기 동안 얼음에 세포의 용 해 솔루션을 녹여 및 핵 펀치를 추가 하 고 60 분 동안 얼음에서 품 어.</li>
	<li>14000 rpm (10000 x g) 냉각된 미니 원심 분리기에서 30 분 동안 incubated lysed 핵 원심 하 고 신중 하 게 발음 제대로 설정된 피 펫과 상쾌한 0.055 mL. (2.5 단계)에서 주식 사전 냉각된 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 얼음에 넣어. 냉동 (-20 ° C)에서 단백질 재고 튜브, 전에 (2.5 단계)에서 첫 번째 견본 준비를 위한 사전 냉각된 0.5 mL 튜브에 상쾌한의 0.012 mL를 전송 하 고 얼음에 그들을 두고.</li>
</ol>3. 모 세관에 단백질 측정을 위한 샘플 준비
<ol><li>키트를 사용 하 고 제조업체의 지시에 따라 분리 된 시 약 준비. 0.5 mL 튜브 (2.5 단계)에서 얼음의 단백질 추출 물 0.012 mL를 포함 하는 분류에 12 샘플의 각각의 마스터-혼합 시 약 0.003 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>95 ° C에가 열 블록 켜고 0.004 mL 단계 3.1 이온된 물 0.016 mL 튜브에 biotinylated 분자 무게 (MW) 사다리에서에서 준비 하는 시 약의 추가. 사다리와 샘플 변성을 사다리 튜브와 unprimed 단백질 추출 물 12 샘플 5 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 놓고 사용까지 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.</li>
	<li>초 유 액 쥐에서 패는 핵에 대 한 샘플 준비, 단백질 추출에서 2.0을 3.2, 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 전기 준비
<ol><li>시 약 (-80 oC에서 깊은 냉동 실에 저장) 벤치에 라벨 biotin을 해 동 하 고 제조자의 방향 다음 4 ° C에서 얼음에 단백질 검출 키트 준비.</li>
	<li>과산화 수소의 0.15 mL와 luminol 0.15 mL를 혼합 하 고 자동화 된 서쪽 기계에 대 한 판의 25 우물 (행 E, 우물 1-25) 0.01 mL 로드. Streptavidin HRP의 0.008 mL에서에서 로드 키트 우물 D1으로 D25</li>
	<li>웰 스 C1 C25와 B1 항 체 희석제 솔루션의 0.01 mL 로드.</li>
	<li>스핀 24 단백질 샘플 및 사다리 튜브를 짧게 (2-3 초)는 minicentrifuge에서 증발된 물 아래로 풀 튜브 모자에서.</li>
	<li>A13, A14 A25에 우물에 12 초 유 액 샘플의 0.003 mL을 잘 a 1으로 biotinylated 사다리의 0.005 mL 웰 스 A2 12 unprimed 샘플의 0.003 mL 로드.</li>
	<li>행 F 비어 두고 0.45 mL 워시 버퍼의 각 행 F. 커버의 플라스틱 뚜껑 접시 나머지 절차 동안 증발을 피하기 위해 아래 3 행에서 5 구획의 각 로드.</li>
	<li>짧게 소용돌이 해 동된 biotin 라벨 시 약 및 그것의 지정 된 관; 시의 0.15 mL를 추가 그런 다음 총 단백질 재구성 에이전트의 0.15 mL를 추가 하 고 동질성을 혼합.</li>
	<li>접시에서 덮개를 제거 하 고 에이전트 1 및 2의 0.01 mL 웰 스 B2 B25 로드. 접시를 커버 하 고 다양 한 솔루션에서 모든 기포를 제거 하려면 1000 x g에서 10 분 원심. 빈 접시를 사용 하 여 균형을 위한 원심 분리기에서.</li>
</ol>5입니다. 전기 이동 법
<ol><li>접시를 회전 하는 동안 총 단백질 분석 실험을 실행 하려면 "파일"에서 드롭 다운 페이지에 나타내는 각각의 자리를 클릭 하 여 자동된 서양 기계에 연결 된 컴퓨터에서 실행된 파일을 엽니다.</li>
	<li>주석을 잘 컴퓨터에서 샘플. 그런 다음 분리기 제거 덮개에서에서 접시를 제거 하 고 신중 하 게 분리 솔루션 구획에서 알루미늄 덮개를 벗기다.</li>
	<li>자동된 서양 악기에 접시를 놓고, 모 세관 카트리지 상자에서 덮개를 벗기다 그것의 지정 된 장소에 카트리지를 삽입 하 고 문을 닫고.</li>
	<li>"실행" 버튼을 클릭 하 고 분석 결과 (이 하 "총 단백질")의 형식으로 메시지가 나타나면 예제 이름을 입력 (예를 들어 "2-13과 초 유 액 14-25" unprimed). "확인"을 클릭 하 고 나타나면 활성화 된 실행된 날짜 및 실행된 파일의 ID 번호를 적어 때 실행 종료 하는 시간.</li>
	<li>실행 시작 후 (170 분)의 끝에, 악기 문, 모 세관 카트리지 제거 열고 sharps 처리에 그것을 삭제 합니다. 생물 학적 문제 처리에 접시를 삭제 합니다.</li>
	<li>실행된 파일의 분석 페이지에서 분리 곡선 아이콘을 클릭 하 고 확인 모든 샘플 제대로 실행 하 고 모든 모세 혈관에 여러 단백질 곡선을 보이고 있다.</li>
</ol>6입니다. 신호 단백질의 분석
<ol><li>레이블이 지정 된 1.5 mL 튜브에 안티 인-eIF2a (p eIF2a) 항 체는 토끼의 0.003 mL을 추가 하 고 항 체 적당 한 검출 키트에서 희석제에 0.3 ml (1: 100 희석) 일시 중단. 다음, 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>Luminol 튜브 라벨 및이 탐지 모듈 키트에서 0.15 mL luminol 그리고 과산화 수소의 0.15 mL를 추가 하 고 신선 하 고, 자동화 된 서양 접시의 E25 우물 E1으로 0.01 mL를 분배.</li>
	<li>D25, 하 웰 스 d 2로 토끼 항 체 안티 보조의 0.01 mL를 분배 하 고 잘 D1을 키트에서 streptavidin HRP의 0.01 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>분배는 기본 항 체 (단계 6.1)에서 우물 C2에 C25, 0.01 mL 고 웰 스 C1 및 B1 B25 ~ 항 체 희석제 2 솔루션의 0.01 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>행 F 웰 스 비어 두고 F 행 아래 3 행의 5 구획으로 워시 버퍼의 0.45 mL를 채우기.</li>
	<li>짧게 스핀 3 냉장된 샘플 s, A25 a 2에서 시작 총계 단백질 분석 결과 대 한 추가 된 동일한 순서로 행 A에 각 샘플의 0.003 mL을 추가. A 1을 잘 하 여 접시 커버 biotinylated MW 사다리의 0.005 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>단계 4.8에서에서 다 격판덮개 원심. 접시를 회전 하는 동안 (자동된 서양 관련 소프트웨어 및 컴퓨터)에 새로운 실행된 파일 열고 분자 크기 분석 결과 각각 자리를 클릭 하 여 실행 하려면 "파일"에서 드롭 다운 페이지에 표시 합니다.</li>
	<li>분석 결과 페이지에서 각 모 세관에 예제 이름을 입력 다음 할당 된 자리와 아래 보조 안티 토끼 항 체에 주 항 체의 이름을 입력 합니다.</li>
	<li>원심 분리의 끝에,이 시간 실행된 파일에 지정 된 이름 "p-eIF2a unprimed 2-13 및 14-25 초 유 액" 이어야 한다를 제외 하 고 단계 5.3-5.5를 반복 합니다.</li>
	<li>전기 이동 법 별거 후 40-43 kDa의 크기에서 항 원의 면역 반응 피크에 대 한 실행된 파일을 확인 합니다. 봉우리의이 크기는 누락, 곡선 아래 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 크기와 곡선 아래 임의의 수량 기록 됩니다 보장 피크에 MW를 추가 하려면 드롭다운 목록 내의 나타냅니다.</li>
</ol>7. 처리 결과
<ol><li>오픈 총 단백질에 대 한 스프레드시트 파일 자동된 서쪽에서 실행 파일을 실행 하 고 ID 번호를 제공 합니다.</li>
	<li>곡선 모드에서 분석 페이지에서 전체 단백질 분석 실험의 실행된 파일 열고 개별 모 세관의 모든 봉우리를 표시 합니다. 그런 다음 복사 하 고 스프레드시트에 붙여넣을 전체 모 세관에 기록 된 모든 봉우리의 곡선 아래의 영역 합계.</li>
	<li>별도 열에 모 세관 숫자, 각각 뇌 핵 및 실행된 파일의 ID 번호와 함께 각 열에 대 한 단백질의 총 금액을 정렬.</li>
	<li>단일 열 및 p-eIF2a 항 원에 대 한 스프레드시트를 열고, 각각 모 세관 수, 뇌 핵, 및 실행된 파일의 ID 번호의 이름을 각 모 세관-의해-측면에서 곡선 아래의 영역을 기록.</li>
	<li>세 번째 스프레드시트에 총 단백질 열 (p eIF2a 곡선 수량에 평행)를 복사 하 고 p를 계산-제 3 열에 eIF2a:total 단백질 비율.</li>
	<li>단계 4 ~ 6 각 뇌 핵에서에서 결과 수집 하 고, 핵의 그룹에서 그들을 주선 한 막대 그래프를 생성.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이산의 서에 대 한 기술, OTR 풍부한 뇌 핵 신생아 쥐 두뇌에서이 문서에 제공 됩니다. 뇌에 잘 특징이 핵 내 에서도 매우 신경 전문는 잘 인식 된다. 특정 OTR이 풍부한 핵을 높은 재현성 이렇게 강력한 가설 테스트 수 있습니다. 자동화 된 서 부 럽을 사용 하 여, 일관성과 결과의 재현성 더 개량 되었다. 동안이 기술의 제한 겸손 뇌 펀치 다양성; 이 기술은 단일 셀, 전체 뇌 또는 뇌 조각 접근 미리를 나타냅니다. 단일 셀 접근은 매우 제한 된 스냅 촬영을 제공 하 여 복잡 한. 전체 두뇌를 사용 하 여, 어떤 결과 수 있습니다 희석 효과 뇌 영역 또는 신경 하위 유형을 제한 하는 경우. 기정 없이 뇌 조각 접근은 특히 뚜렷한 핵의 꽉 클러스터링으로 인해 본이 연구에서는 시상 하 부에 대 한 문제가 조각에서 단순한 미크론 이내 결과에 깊은 변화를 발생할 수 있습니다. 표준화 된 펀치와 현미경의 도움을 사용 하 여, 단백질 측정에 있는 가변성 감소 되었다.
이 프로토콜 내...

일-하-주 산 후의 과정을 통해 발생 하는 초기 두뇌 발달의 우리의 이해는 달리 상대적으로 작은 쥐에 있는 생활의 첫 번째 시간에 발생 하는 동적 변경의 무수 한에 대 한 알려져 있다. 핵심 과제는 신생아 쥐 두뇌와 개별 뇌 영역 또는 단일 세포를 분리 하 고 하이테크 도구에 대 한 요구의 작은 크기 되었습니다. 연구는 종종 유전자 녹음 방송 그리고 번역 하지1,2, 활성화 신호 분자의 기능 수준의 확고 한 이해를 포기 하지 않는 평가 합니다. 다른 식 식 레벨3의 정량화에 대 한 허용 하지 않는 참조 뇌 영역 immunohistochemistry를 사용 하 여 검사 합니다. 날짜 없음 연구 활성화 신호 경로 쥐 첫 번째 colostrum 빠른 격리와 희생과 단백질 표정 및 단백질 인 산화 서를 사용 하 여 측정 필요 개별 두뇌 지구에서 피드와 관련 된 검사 하고있다 럽. 뇌 서 더 오래 되 고 큰 머리에 수행 하는 동안 우리가 하지 P0 두뇌에 단일 셀 뇌 펀치를 수행 하는 참조를 확인 했습니다. 이 종이 상대적으로 작은 샘플에 단백질 발현을 측정 하는 상대적으로 낮은 펀치 기술 및 절차를 더럽혀 서를 사용 하 여 신생아 두뇌의 제한 된 영역을 격리 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜은 포스트 번역 상 수정 단백질 식의 평가 필요로 하는 연구 질문에 대 한 적합 한 수 있습니다 (예., 인 산화) 어떤 종류의 작은 두뇌의 상대적으로 제한 된 지역에서 제공 하는 사용자는 시각적으로 아틀라스와 식별 랜드마크 관심 뇌 영역을 식별할 수 있습니다.
이 기술은 신생아 쥐 첫 초 유 먹이 옥 시 토 신 (OT)에서 풍부한 결과로 뇌에서 발생 하는 변화를 이해 하 개발 되었다. OT는 오랫동안 우유 실망 하 고 자 궁 수 축을 자극 하는 기능에 대 한 알려져 있다. 그러나, 연장 전 지금 많은 신체 기능 및 동작4의 규정에 다양 한 역할을 재생으로 알려져 있습니다. 예, OT, 스트레스와 적응 affiliative 동작5와 함께에서 염증 반대 위 비우는 지연 고 장 전송 속도가 느려집니다. OT 수용 체 (OTR) 장 신경에 장 상피6,,78확인 되었습니다. OT의 위장 효과 초기 산 후 기간 동안 유아에 특히 중요 하다. 예를 들어, 모유 수 유 신생아 용기9,10, 상당한 양의 OT의 납기와 연결 되어 있으며 데이터 표시는 OTR 기간8유아 우유 중 십이지 장 villi에 무 겁 게 overexpressed입니다.
창 자 셀 라인을 사용 하 여 생체 외에서 실험 세포 수준에서 보여준 그 oxytocin 변조 신호 통로11,12 스트레스에 중요 한 분자 및 단백질의 번역에 규제 역 12. 이러한 연구 우유, 어머니, exogenous 옥 시 토 신 등의 구성 요소는 세포 스트레스13을 줄이기 위해 신생아에 펼쳐진된 단백질 응답에서 중요 한 것이 좋습니다.
Vivo에서 그리고 생체 내 전 연구 colostrum OT 신생아 쥐 직감 villi에 세포질 긴장 응답, 염증, 및 autophagy 마커 변조 나타났습니다. 신생아 enterocytes 고통을 luminal 그들 측에 상당한 세포 스트레스 용기 colostrum14,15 및 OT9 과 같은 호르몬을 포함 하 여 수많은 단백질에 어머니 로부터 microbiota에 동시에 노출 되 면 , 10 , 16.
OT의 효과 뇌에 공부17되었습니다. 그러나, 이른 출생 후 기간 동안에 보여주었다 OT 신호 메커니즘 있다 하지 두뇌에서 연구 되었습니다. 이 종이에 신생아 쥐 brainstem에 시상 하 부 전기 이동 법을 사용 하 여 개별 뇌 핵을 분리 하는 방법 고립 된 뇌 영역을 프로 파일링 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 두뇌 지역 출생, 유아, 최저 폐해/신경 인덱스와 뇌 조직에 첫 번째 우유 전후에 최대한 가까이에서 신호 하는 세포의 상태를 캡처. 이 기술 개발에 대 한 근거는 ex vivo 연구는 자동화 된 서 부 럽을 사용 하 여 신경의 더 균일 컬렉션 신생아 강아지에서 제한, 미세한 뇌 영역의 급속 한 격리에 대 한 허용 방법론, 상대적으로 작은 해 부 샘플에 매우 일관 된 결과 제공. 이전 작업의 단점에는 더 심한 해 부 (뇌 조각 또는 뇌)와 더 오래 된 동물18,19포함 되어 있습니다. 젊은 새끼의 두뇌는 매우 동적, 파도 출생 후 glial 차별화의 특징입니다. 강아지의 첫 번째 먹이 의해 영향을 하는 두뇌 변화를 공부 하기 위하여 재현 해 부와 제한 신경 핵을 공부는 필요 합니다.
두뇌 개발 뇌 영역에 미치는 영향 거의 공부 하는 반면 우유 피드 일반적으로 (예를 들어 enterocytes20,21), 건강 또는 유전자 표현에 미치는 면역과 영양 영향에 대 한 분석 이다. 뇌 기능에 용기에 우유 운송의 효과 직감 cholecystokinin 수용 체 vagal 릴레이 세포내 신호 통로22하지만 뇌 간 핵에 관하여 분석 했다. 임신23, 동안 어머니의 영양 부족에 개발 신생아 두뇌의 취약성에 광대 한 문학이 있다 하지만 스트레스와 염증 신호를 다루지 않습니다. 중요 한 것은, 현재 메서드는 내장 자극의 vagal 릴레이에서 혈액 태어난 colostrum 자극 격리 하루 0 쥐 신생아에서 현상 이용 합니다. 이것은 소위 스트레스 hypo-응답 기간 미 성숙한 핵 tractus solitarius (국세청)에 의해 특징 이다-국세청, paraventricular 핵 (PVN)을 제한 하는 출생24,25 직후 hypothalamic 회로 및 supraoptic 핵 (아들) 혈액 태어난 자극에 신호.
이 방법은 여러 신호 통로의 분석에 대 한 유용 하 고 상대적으로 제한 신경 세포는 뇌 조직 쥐, 치료의 어떤 종류 또는 어머니는 도전 여부 이외에 출생 후 하루-0에서 수확 동안에 임신. Colostrum 미리 신호 먹이 대 공급의 효과 대 한 새끼를 분석할 수 있습니다. 풍부한 단백질 수율 대 가난한 뇌 영역 사이의 신호를 비교할 때이 메서드는 모세 혈관 단백질 항 원의 면역 정량에 병렬 실행의 polypeptide 밴드의 총 단백질의 모 세관에 결정을 수 있습니다. 이 메서드는 표준 양적 곡선 없이 같은 항 체와 모 세관 당 총 단백질에 대 한 참조를 얻은 결과의 임의의 단위를 사용 하 여 양적 비교 수 있습니다. 다른 항 체에 의해 얻은 결과 비교 하는 것은 양적 표준 곡선을 사용 하 여만 가능 합니다.
이 메서드는 양방향 신호 용기와 뇌 간에 발생 함수 두 기관26에 영향을 미칠 수의 평가 대 한 허용. 광범위 하 게 공부 하고있다 최근 몇 년 동안27, oxytocin 및 음식 섭취 사이 협회 증가 oxytocin 신호 및 양분 가용성 사이의 링크를 지원 합니다. 이러한 연구도 대화 개념 적자 hypothalamic oxytocin 신호에 감소와 함께 결합 된다 에너지를 지원 합니다.
두뇌 활동에 OT의 효과의 이전 학문 유도 창 자 염증 vagotomy28내 화물 있던 hypothalamic PVN, 편도, 및 piriform 피 질에 cFos 전사 elicited 설명 했다. 그러나, secretin와 OT의 조직의 주입 뇌 cFos 응답28창 자 자극된 염증 반응으로 감소. 이 외 인 OT의 효과 vagal 릴레이, 지역 postrema6,29통해 수행 하는, 혈액을 매개로 한 신호 분자를 통해 가능 하 게 다른 경로 의해 실시 됐다 제안 했다.
이 연구에서 이전에 관찰 세포 스트레스 신호 경로 두뇌에서 평가 됐다. 가설 우유 구성 요소 보호 하거나 미생물 및 다른 대사 산물을 창 자 침투성에 염증의 영향을 지연 및 차례 차례로,에 효과 두뇌 기능 이었다. BiP colostrum13, 못쓰게 전후 villi, 있는 신호 대 IkB 명확한 대립 차이 여전히 개발 하는 과정에서 신생아의 두뇌가 colostrum 유도 직감 신호 감지 수 있습니다 제안 했다.
바인딩과 그물 스트레스와 관련 된 이전 용기 실험에 사용 하는 신호 단백질 마커를 측정 했다. 그들은 응급실 보호자 BiP, 번역 개시 인자 eIF2a (는 스트레스 응답 통합자30역할), eIF2a 키 니 아 제 p 포함-PKR, 그리고 두 염증 신호 단백질 (NF-kB와 그 억제제, IkB).
6 뇌 영역 성인 분 비 또는 OT에 응답에서 자신의 능력에 따라 선택 되었다. 국세청, 위 정도에 위치한 내장 입력의 첫 번째 릴레이 이며 직접 용기31 및 가능 하 게 혈액 태어난 cytokines, 독 소, 그리고 인접 한 지역 postrema32통해 호르몬 vagal 감각 신경 세포에서 신호를 받습니다. PVN, supraoptic 핵 (아들)가 핵 (STR), 대뇌 피 질 (CX), 그리고 중간 preoptic 핵 (MPO)는 국세청을 통해 창 자에서 신호 수신.
결과 즉시 산 후 기간 동안 colostrum 못쓰게 이전 직후 첫 번째 먹이 국세청 PVN과 아들에 비해 다른 세포 스트레스 반응을 보여주었다. CX에 신호, STR, 및 MPO 달랐다 PVN과 아들에서 뿐만 아니라. 이전 셀 스트레스와 염증에에서 변조 표시 OT의 고유 보호 기능은 가능성이 뇌의 일부 지역에 의해 감지 됩니다. 공동으로, 데이터는 세포 수준에서 출생, 후 첫 번째 시간 동안 두뇌 응답 영양소 부족와 관련 된 대사 스트레스를 나타냅니다. 데이터는 또한 피드 colostrum의 변조 효과의 방향과 범위는 지역에 따라 다릅니다 및 일부 지역에서 그들은 이전에 표시 된 OT 효과 거울을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Bradford 솔루션</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단백질 용해 키트</td><td>단백질 단순</td><td>CBS403</td><td>Bicine/CHAPS</td></tr><tr><td>WES 키트</td><td>단백질 단순</td><td>WES-Mouse 12-230 마스터 키트(PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 마스터 키트(PS-MK14), WES 12-230 kDa 총 단백질 마스터 키트(PS-TP07)</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 IgG HRP 접합체</td><td>단백질 simple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>SER51, 9721</td><td></td></tr><tr><td>마우스 mAb anti-PKR</td><td>세포 신호 기술</td><td>2103</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-phospho-PKR</td><td>Millipore</td><td>Thr451, 07-886</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit mAb anti-PKR</td><td>세포 신호 기술</td><td>12297</td><td></td></tr><tr><td>rabbit mAb anti-GAPDH</td><td>세포 신호 기술</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>마우스 mAb anti-phospho-IKB</td><td>세포 신호 기술</td><td>9246</td><td></td></tr><tr><td>마우스 mAb anti-IKB</td><td>세포 신호 기술</td><td>4814</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-BiP</td><td>세포 신호 기술</td><td>3183</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti GCN2</td><td>세포 신호 기술</td><td>3302</td><td></td></tr><tr><td>rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td><td>BIORBYT</td><td>T899</td><td></td></tr><tr><td>임신 Sprague-Dawley 쥐</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펀치 장치</td><td>WellTech Rapid Core 또는 Harris Uni-Core</td><td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td><td></td></tr></tbody></table>

처음 초 유 수 유 전후 개별 oxytocin 분 비 뇌 핵 신생아 쥐에 있는 염증과 세포 스트레스 평가

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

이 프로토콜의 목표 처음 초 유 수 유 전후 신생아 뇌에서 옥 시 토 신 수용 체 부유한 두뇌 핵을 분리 하는 것입니다. 대사 스트레스에 반응으로 알려진 단백질의 식 서 부 럽을 사용 하 여 뇌 핵 격리에서 측정 했다. 이 본문에 대사 스트레스 유발 영양소 부족 신경 스트레스 발생 여부를 평가 하기 위해 수행 되었다. 우리는 이전 신생아에서 영양 부족에에서 대사 스트레스 elicits 증명 하고있다. 또한, colostrum oxytocin 신생아 쥐 직감 villi 이전 및 첫 번째 피드 후에 세포질 긴장 응답, 염증, 및 autophagy 마커를 조절 한다. 바인딩과 그물 스트레스와 관련 된 단백질 마커 신호 [응급실 보호자 바인딩 면역 글로불린 단백질 (BiP), 번역 진 핵 개시 요인 2A (eIF2a), 및 eIF2a 키 니 아 제 단백질 키 니 아 제 R (p-PKR)], 2 뿐만 아니라 염증 신호 단백질 [핵 요인-κB (NF-kB)와 억제 물 κB (IkB)], 신생아 뇌 핵에서 측정 되었다 [독방 관 (국세청), paraventricular 핵 (PVN), 위에 광학 핵 (아들), 피 (CX),가 핵 (STR), 핵 및 중간 preoptic 핵 (MPO)] 첫 번째 피드 (colostrum에 의해 unprimed) 전에 전후 간호 (colostrum 여 액)의 시작. BiP/GRP78 및 p-eIF2a의 표현 되었고 unprimed에 upregulated downregulated 끝났다 국세청 조직에. NF-kB 낮은 되었고 두 조건에서 국세청, PVN, 및 아들에서 변경 되지 않은 반면 NF-kB (높은) CX, STR, 및 MPO 세포질에서 유지 되었다. 집단 BiP 및 p-eIF2 결과 스트레스 응답 일치 하는. eIf2a는 dsRNA 종속 키 (p-PKR)에 아들, CX, STR, MPO에 phosphorylated 됩니다. 그러나,는 NTS에서 (그리고 PVN에서 낮은 정도), eIf2a 다른 키 니 아 제, 일반 제어 nonderepressible-2 키 니 아 제 (GCN2)에 의해 phosphorylated 했다. 이전에 신생아 직감 enterocytes 관찰 스트레스 조절 메커니즘 일부 OTR 부유한 두뇌 지구에서 미러링할 나타납니다. 국세청 및 PVN 다른 지역에서 (아래 영양소 결핍) 다른 인 산화 메커니즘을 활용 하 고 영양 부족의 영향을 내 화 될 수 있습니다. 공동으로,이 데이터 영양소 부족 스트레스에 두뇌 응답 enterocytes colostrum 액에서 신호에 의해 상쇄 됩니다 나왔다.

총 단백질 기준으로 immunoreactivity의 대표 밴드 매우 낮은 수확된 단백질으로 뇌 핵이 다는 것을 보여줍니다. 이 정식 서쪽 오 점에 비해 매우 중요 한 자동화 된 서쪽 오 점 기술 사용을 해야 합니다. 이 방법은 모 세관 당 레인 서쪽 오 점에 비해 당 더 적은 fortyfold 단백질으로 실행할 수 있습니다.
뇌 핵에서 BiP 수준에 colostrum 못쓰게의 차동 효과
쥐 두뇌의 코로나 섹션 첫 번째 colostrum (unprimed) 수 유 전후 첫 번째 먹이 (액)를 수확 했다. 샘플 했다 분류 한 모 세관 전기 이동 법 (웨스)에 의해 고 단백질 (프로토콜 참조) 모 세관에서 총 단백질 얼룩에 대 한 키트를 사용 하 여 계량 했다. 추가...

여기, 우리가 제시 첫 초 유 먹이와 함께에서 신생아 쥐 뇌에서 뇌 핵을 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 뇌에 영양소 부족 스트레스 연구를 enterocyte 신호에 의해 조절 되 있습니다.

처음 초 유 수 유 전후 개별 Oxytocin 분 비 뇌 핵 신생아 쥐에 있는 염증과 세포 스트레스 평가

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

이 방법은 우유 를 빨아 뇌의 스트레스 신호에 영향을 미치는 방법에 대한 산후 개발 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 첫번째 자연적인 기아 기간 도중 특정 두뇌 지역을 포착하고 첫번째 자연적인 초유 공급 직후에 각자의 지역에 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 빨아들이는 것이 행동과 감정의 생리학에 어떤 영향을 미치는지 이해하면 전 생체 공학 뇌 조직 분석 중에 다양한 수용체에 길항제를 사용할 수 있습니다.핵 펀치를 얻으려면 장갑을 낀 손으로 꼬리로 쥐 새끼를 제거하십시오. 뇌를 수확한 후, 전체 장기를 실온에서 폴리메틸 메타크라이레이트 뇌 몰드에 빠르게 배치하고 새로운 면도날을 사용하여 500마이크로미터 두께의 조직을 만듭니다. 조각이 페트리 접시에 있는 코달에 놓아, 섹션의 올바른 방향을 유지한다.전체 뇌가 절제되었을 때, 신속하게 접시에 포도당없이 인공 뇌 척수액을 추가하고 궤도 셰이커에 일정한 교반과 섭씨 28 ~ 30도에서 60 분 동안 슬라이스를 배양. 각 조직에 뇌 아틀라스와 해부학 적 랜드 마크를 사용하여 펀치 할 뇌 핵을 식별하고 해부 현미경에서 새로운 페트리 접시에 관심의 핵으로 슬라이스를 배치합니다. 일단 시각화되면, 빠르게 4 ~ 6 개의 다른 핵을 펀치하고 신속하게 60 분 동안 프로테우스 억제제와 인산 억제제를 포함하는 적절하게 표지 된 마이크로 원심 분리기 튜브에 얼음 차가운 단백질 추출 버퍼의 0.06 mL에 각 펀치 핵을 몰입하는 코링 도구를 사용합니다.인큐베이션의 끝에서, 냉각 된 미니 원심 분리기에서 추출 된 핵을 원심 분리하고 마이크로 파이펫을 사용하여 각 튜브에서 0.055 mL의 상신체를 얼음에 적절한 미리 냉각 된 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 조심스럽게 전송합니다. 음의 섭씨 20도 저장전에, 첫 번째 샘플 준비를 위해 얼음에 적절한 0.5mL 사전 냉각 튜브로 각 단백질 스톡 튜브에서 0.012 mL의 상퍼를 전송합니다. 모세관 단백질 측정을 위한 샘플을 준비하려면 단백질 용해 키트에서 0.5mL 표지튜브의 각 샘플에 0.003 mL의 마스터 믹스 시약을 추가합니다.다음으로, 0.016mL의 산화수에 바이오티니화 분자량 사다리 용액에 마스터 믹스 시약0.004mL를 추가하고, 사다리와 단백질 추출물 샘플을 섭씨 95도의 열블록에 분해하여 5분 후에 4도의 모든 튜브를 저장합니다. 신호 단백질 분석을 위해, 새로운 자동화 된 서양 판의 E-1에 E-1에 우물 E-1에 새로 준비 된 루미놀 과산화수소 용액의 0.01 mL을 추가하고, D-2에서 D-25까지 이차 항마우스 항체의 0.01 mL을 추가하고, 1-1에서 D-1에 이르기까지 스트렙타비딘 고추의 0.01 mL를 추가하십시오. C-25에 새로 준비된 1차 항체의 0.01 mL을 C-2에 넣고, 항체 희석제 의 0.01 mL을 B-25에 B-1로 잘한다.행 F 웰을 비워 두고 0.45mL의 세척 버퍼로 F 행 아래 세 행의 5개의 구획을 채웁니다. 다음으로, 냉장 된 샘플을 30 초 동안 잠시 회전시키고 A-2로 시작하여 각 샘플의 0.03 mL을 행 A에 추가합니다. 그런 다음 생체화 분자량 사다리의 0.005 mL을 잘 A-1에 추가하고 원심 분리를 위해 플레이트를 덮습니다.플레이트가 원심 분리되는 동안 자동화된 서부 관련 소프트웨어에서 새 실행 파일을 열고 분자 크기 분석기를 시작합니다. 분석 페이지에서, 각 모세관뿐만 아니라 1차 및 이차 항체의 이름으로 샘플 이름을 입력합니다. 원심 분리의 끝에, 자동화 된 서양 악기에 접시를 배치하고 모세관 카트리지 상자에서 덮개를 벗깁니다.원심 분리에 따라 모세관의 기포가 전동 전류를 차단하고 전체 라운드를 실패할 수 있기 때문에 기포를 검사하는 것을 잊지 마십시오. 카트리지를 계측기 내의 지정된 위치에 삽입하고 문을 닫습니다. 시작을 클릭합니다.분석 유형으로 메시지가 표시되면 실험 이름을 적절한 텍스트 상자에 입력하고 확인을 클릭합니다. 활성화된 실행 날짜와 실행 파일의 ID 번호로 메시지가 표시되면 실행이 끝나는 시간을 기록합니다. 실행의 끝에서, 날카로운 처리에 모세관 카트리지를 버리고 생물 유해 물질 처분에 접시를 폐기.전기전도 분리 후, 인광성 진핵 번역 개시 인자 2A를 의미하는 40~43킬로달톤에서 항원의 면역 반응성 피크에 대한 실행 파일을 확인한다. 이 크기의 분자량 피크가 누락된 경우 곡선 아래를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 분자량을 피크에 추가하여 곡선 아래의 크기와 임의수량을 기록합니다. 비프라임조직 샘플 내에서, 독방 트랙의 핵에 있는 결합 아미노산 글로불린 단백질 수준은 다른 모든 지역에 비해 상당히 높다.초유를 가진 창자 조직의 프라이밍은 독방 트랙의 핵에 결합 하는 아미노산 글로불린 단백질 수준을 감소 하 고 심방 핵및 초광학 핵에 영향을 주지 않습니다. 반대로, 프라이밍은 비프라임 조직에 비해 피질 내의 결합 아미노산 글로불린 단백질 수준을 증가시키고, 다양한 테스트된 뇌 핵에서 결합하는 아미노 글로불린 단백질 수치가 장 프라이밍에 다르게 반응하고 아직 테스트된 다양한 핵 간의 크로스토크가 없다는 것을 암시한다. 진핵 번역 개시 인자 2A 및 인광진 진핵 번역 개시 인자 2A 수준은 다른 핵에 비해 비프라임 된 상태에서 상승된다.프라이밍 후, 진핵 번역 개시 인자(2A)와 인광성 진핵 번역 개시인자(2A)의 수준은 원시조직에 비해 고독한 트랙의 핵에 비해 감소된다. 다른 모든 시험된 핵에서, 프라이밍은 무원시 조직에 비해 진핵 번역 개시 인자 2A 및 인광성 진핵 번역 개시 인자 2A의 수준을 증가시킨다. 그러나, 인계 단백질 키나아제 수용체의 수준은 독방 트랙의 핵에 있는 프라이밍 된 견본에 비해 비프라이드 샘플에서 낮으며, 다른 키나아제는 진핵 번역 개시 인자 2A의 인산화에 관여한다는 것을 강력하게 시사한다.개발 후, 이 기술은 조직 성장과 분화에 관련되었던 신호 통로를 탐구하기 위하여 산후 발달의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장하고 그(것)들이 빨기의 영향을 받거나 독립적인지. 예를 들어, 디티오스레이톨과 같은 휘발성 감소제와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 이 절차를 준비할 때 화학 후드의 준비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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배우세요 신생아 쥐 뇌 핵 분리 기법을 통해 초유 수유 전후 스트레스 신호 경로를 분석하는 방법을. 이 기술은 발달 생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

처음 초 유 수 유 전후 개별 Oxytocin 분 비 뇌 핵 신생아 쥐에 있는 염증과 세포 스트레스 평가

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