Name: 경작 및 O9-1 신경 크레스트 세포의 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 학습하세요 O9-1 신경 크레스트 세포 배양 및 siRNA와 CRISPR-Cas9 유전자 조작 기법. 이 프로토콜은 신경과학 및 줄기세포 연구에 활용 가능한 강력한 in vitro 모델을 제공합니다.

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니콜 Stancel, 박사, ELS, 텍사스 심장 연구소 과학적인 간행물의 논설 지원을 제공 했습니다. 우리는 또한 다음과 같은 자금 출처 감사: 미국 심장 협회의 국가 센터 과학자 개발 그랜트 제이 왕 (14SDG19840000), (하 제이 왕 2014 로렌스 연구 수상 Rolanette Berdon 로렌스 뼈 질병 텍사스의 프로그램에서 ), 그리고 (DE026561 및 DE025873 제이 왕, DE016320 및 DE019650 R. Maxson를) 건강의 국가 학회.

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<li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li>
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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
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<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
<li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%2C+but+not+collagen+I%2C+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

NCC 배아 morphogenesis 동안 다른 조직 및 장기에 다양 하 고 핵심 기여자 이다. O9-1 셀 라인 많은 다른 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력을 유지 하 고 모방 NCCs, 유전자 기능을 연구 하 고 NCCs 분자 규제에 대 한 유용한 체 외에 도구를 만드는의 비보에 특성. O9-1 세포의 다른 상태는 다른 신경 크레스트 자손에서 vivo에서, O9-1 셀의 문화 조건에 따라에 해당할 수 있습니다. O9-1 셀 multipotent 상태 조건 하에서 비 차별 문화, 일반 줄기 세포 배양과 유사한 경작 하는 경우에 유지할 수 있습니다. 비 차별화 O9-1 셀 pre-migratory 및 철새 multipotent 줄기 같은 NCCs에 비보에해당할 수 있습니다. 또한, O9-1 세포 분화 할 수 있다 조건 하에서 특정 차별화 문화, 많은 다른 세포 유형으로는 유전자 기능을 연구 하 고 multipotent 줄기에서 NCCs의 차별화 중 규정에 대 한 중...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

신경 크레스트 셀 (NCCs) 놀라운 철새 능력 및 배아 개발 하는 동안 일시적인 존재 multipotent 줄기 모양의 세포 이다. NCCs 표면 ectoderm 신경 관 사이 시작 하며 배아 개발1동안 태아의 다른 부분에 이주. 도메인의 기능에 따라, NCCs 여러 종류, 두개골 등, 트렁크, vagal, 성 례, 그리고 심장 NCCs로 분류할 수 있습니다. 또한, NCCs 여러 세포 계보, 부드러운 근육 세포, 뼈 세포, 신경, 등으로 구분 하 고 다양 한 조직2,3을 야기할 수 있습니다. NCCs의 개발은 끈 다양 한 분자 신호 하 여 전체적 사건의 복잡 한 시리즈에 의해 특징입니다. NCCs의 복잡 한 규제 및 수많은 구조에 그들의 중요 한 기여를 감안할 때, NCC 개발의 dysregulation 이어질 수 있습니다 일반적으로 선 천 성 기형, 모든 인간의 선천적인 출생 결함의 약 30%를 위한 계정. 신경 크레스트 개발 하는 동안 이상 갈라진된 입술 또는 구개, 결함이 발생할 수 있습니다 코 형성, 증후군, 결함 결함 심장 유출 관, 또는 심지어 유아 사망률1,,45, 6 , 7. NCC 개발의 분자 메커니즘을 이해 하는 것이 NCC 개발에 결함으로 인 한 질병에 대 한 치료법 개발을 위한 중요. 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 의 사용과 접근8,,910,11,12,13,14 ,15를 상당한 진전이 NCC 연구에서. Vivo에서, 닭, 등 양서류, zebrafish, 마우스, 동물 모델 NCCs1을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 인간의 배아 초기 인간 배아 개발16NCC 마이그레이션 과정을 공부 하 사용 되었습니다. 생체 외에서셀 모델에서 NCCs 환자 피하 지방에서 시작 된 인간의 NCCs 등에 대 한 파 킨 슨 병17조사에 사용 되었습니다. O9-1 NCC 선, 원래 생 NCCs E8.5 마우스 배아18에서 고립의 대량 문화에서 파생 된, 공부 NCCs. 중요 한 것은, 비 차별 문화 조건에 대 한 강력한 셀 모델, O9-1 세포는 multipotent 줄기 같은 NCCs. 그러나, 다양 한 문화 조건에서 O9-1 셀 평활 근 세포, osteoblasts, chondrocytes, glial 세포18등 고유 세포 유형으로 분화 될 수 있다. 이러한 속성을 감안할 때, O9-1 셀 NCC 관련 연구, 두개골 얼굴 결함19,20의 분자 메커니즘을 조사 하는 등 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다.
여기, 상세한 프로토콜 제공 O9-1 세포를 유지, O9-1 세포를 다른 세포 유형으로 차별화 하 고 O9-1 세포 게놈 편집과 작은 간섭 RNA (siRNA)을 CRISPR Cas9 유전자 손실의 기능 연구를 수행 하 여- 최저의 기술 중재. 대표적인 예로 야프 와 Taz 손실-의-기능을 공부 O9-1 셀의 사용을 설명 합니다. 야프와 Taz는 신호 전달 경로, 세포 증식, 감 별 법 및 apoptosis에 중요 한 역할을 담당 하는 마의 다운스트림 이펙터. 뚱 땡 통로 또한 보였다 개발 및 여러 다른 조직 및 장기의 항상성 뿐만 아니라 다른 질병20,,2122,23의 병 인에 중요 한 것 ,,2425,26,,2728. Hippo 신호의 핵심 구성 요소는 종양 억제기 살 균 20 같은 kinases Mst1/2, WW 도메인 포함 된 살바도르 비 계 단백질, 및 큰 종양 억제기 상 동 기관 (Lats1/2) kinases 포함 됩니다. Hippo 신호 Taz 및 Yap 활동을 억제 하 고 세포질에 그들의 저하를 촉진 합니다. 하 마에서 억압 하지 않고 얍 Taz 수 핵으로 이동 및 공동 transcriptional 활성 제 기능. 우리 최근 특히cre Wnt1사용 하 여 마우스 NCCs Taz 및 Yap 이펙터를 신호 하는 마를 비활성화 하 고 심한와 E10.5에서 배아 치 귀착되 었 다 Wnt1Cre2SOR 드라이버 craniofacial 결함20. 우리는 또한 야프 NCCs에 Taz의 역할을 조사 하기 위해 O9-1 셀을 사용 하 여 연구를 수행 했습니다. NCC 확산 및 감 별 법, 야프 Taz 최저 Taz 및 Yap 함수를 공부 하려면 세포 siRNA를 사용 하 여 O9-1 셀에 생성 했다 고 얍 녹아웃 셀 CRISPR Cas9 게놈 편집 사용 하 여 생성 된. 다른 경로에 다른 대상 유전자 동일한 유전자 기능 손실 전략을 적용할 수 있습니다. 또한, 이득의 기능 연구와 transfection 분석 또한 적용할 수 있습니다 유전자 기능과 규제 연구 O9-1 셀에. 여기에 설명 된 프로토콜 multipotent stemness 유지 O9-1 세포를 배양, O9-1 셀 조건 하에서 다른 문화, 다른 세포 유형으로 차별화 및 유전자 기능을 공부 가이드로 조사자에 의해 사용 될 것입니다 및 NCCs의 분자 메커니즘입니다.

<table><tbody><tr><td>활성 STO 공급</td>세포 <td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1503</td><td>미토마이신 C-불활성화 형태로도 제공, 카탈로그 # ATCC 56-X</td></tr><tr><td>O9-1 마우스 두개골 신경 능선 세포주</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 글루타민 없음</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS(소 태아 혈청)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질의 젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% HBSS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS(Dulbecco의 인산염 완충 식염수) 없음 칼슘 또는 마그네슘</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산(MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨(100mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO 백혈병 억제 인자(LIF) 106 단위/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 섬유아세포 성장인자-염기성 (rhFGF-basic)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>미토마이신 C</td><td>로슈</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>마트리겔 매트릭스</td><td>코닝</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO(디메틸설폭사이드)</td><td>밀리포어 시그마</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체, Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-글루타민</td>, <td>코닝</td><td>, 10-022-CV</td><td></td></tr>, <tr><td>ON-TARGETplus, Wwtr1, siRNA,</td><td>Dharmacon,</td><td>L-041057</td><td></td></tr>, <tr><td>ON-TARGETplus, Non-target,</td> Pool, <td>Dharmacon,</td><td>D-001810</td><td></td></tr>, <tr><td>ON-TARGETplus, Yap1, siRNA,</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr>, <tr><td>FCS(태아 송아지 혈청)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS(인슐린-트랜스페린-셀레늄)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아스코르빈산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP2(뼈 형태 유전 단백질 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

경작 및 o9-1 신경 크레스트 세포의 조작

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

신경 크레스트 셀 (NCCs) multipotent 줄기 세포를 다른 세포 유형으로 분화 하 고 여러 조직 및 장기를 야기할 수 있는 마이그레이션 됩니다. O9-1 셀 라인은 내 생에서 파생 된 배아 NCCs 마우스 및 그 multipotency 유지. 그러나, 특정 문화 조건 O9-1 셀 다른 세포 유형으로 분화 할 수 있다 하 고 연구 응용 프로그램의 넓은 범위에서. 최근, 마우스 연구 및 O9-1 셀 연구의 조합, 우리가 나타났습니다 그 Taz 및 Yap 신경 크레스트 파생 craniofacial 개발에 중요 한 역할을 재생할 통로 이펙터를 신호 하는 마. O9-1 셀에 대 한 자란 과정은 더 복잡 한 다른 셀 라인에 사용 하는 것, 비록 O9-1 셀 라인 NCCs 체 외조사에 대 한 강력한 모델입니다. 여기, 선물이 경작 O9-1 셀 라인의 stemness, 뿐만 아니라 프로토콜 O9-1 세포, 평활 근 세포와 osteoblasts 다른 세포 유형으로 차별화를 유지 하기 위한 프로토콜. 또한, 프로토콜 O9-1 셀에 CRISPR Cas9 삭제 및 작은 간섭 RNA 중재 최저 사용 하 여 유전자 손실의 기능 연구를 수행 하는 데 설명 합니다.

우리의 최저 및 녹아웃 실험의 목표 Taz 및 Yap 손실-의-기능 O9-1 셀에의 효과 연구 했다. 최저의 및 녹아웃 실험 하기 전에 우리는 되도록 기저 미디어와 문화 O9-1 셀 (예: 그림 1및 복구 O9-1 셀에 표시 된 전체 접시를 충당 하기 위해 지하실 멤브레인 매트릭스 요구 위에서 설명한 대로 준비 하는 액체 질소 그림 2에서 같이). 우리 수행 최저의 실험 위에서 설명한 대로 있는 야프 와 Taz 했다 동시에 무 너 뜨. 같은 양의 얍 siRNA와 Taz siRNA 제조업체에서 권장 하는 마지막 볼륨에 추가 되었습니다. 컨트롤 플레이트 nontargeting siRNA의 동일한 볼륨 추가 되었습니다.
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O9-1 multipotent 마우스 신경 크레스트 셀 라인입니다. 여기는 O9-1 세포를 배양, O9-1 세포 특정 세포 유형으로 분화 하 고 유전자 O9-1 셀 siRNA 중재 최저 또는 CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용 하 여에 대 한 자세한 단계별 프로토콜에 설명 합니다.

경작 및 O9-1 신경 크레스트 세포의 조작

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

O9-1 세포주 체외에서 신경 문장 세포를 공부 하기 위한 매우 유용한 도구. 그것은 연구의 다양 한 사용에 응용 프로그램의 넓은 범위에서 사용 하기 위한 큰 잠재력을 가지고. O9-1 세포는 쉽게 접근할 수 있고 실험을 위해 충분한 세포 수를 빠르게 획득하는 등 명백한 이점이 있어 신경 문장 세포의 체외 연구에 무료로 제공되는 강력한 방법입니다.먼저 텍스트 프로토콜에 따라 O9-1 세포 배양을 위한 기초 매체를 준비합니다. 그런 다음 기초 매체를 걸게 하고 호일로 감싸서 빛으로부터 보호합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 따라 활성화된 STO 셀에서 조건된 기초 매체를 수집합니다.첫째, 2 시간 동안 얼음에 지하 막 매트릭스의 알리쿼트를 해동. 이어서, 10%의 FBS로 여과된 멸균 DMEM으로 지하 막 매트릭스를 0.5mg/ml의 최종 농도로 희석시켰다. 1 시간 동안 실온에서 지하 멤브레인 매트릭스로 플레이트를 코팅합니다.그런 다음, 플레이트를 기울이면서 지하 멤브레인 매트릭스를 흡인한다. 30분간 30°C에서 접시를 말리십시오. 플레이트에 지하 멤브레인 매트릭스를 추가할 때, 용액이 세포 특성을 유지하고 실험 사이에 불필요한 변동을 피하기 위해 균등하게 덮여 있는지 확인하십시오.냉동 병병을 섭씨 37도의 수조에 배치하여 O9-1 세포를 회수하십시오. 용액이 완전히 액체로 변할 때까지 바이알을 천천히 소용돌이시다. 그 후, 저온 바이알에서 15ml 원심분리기 튜브로 세포 용액을 전달한다.세포를 다시 일시 중단하기 위해 튜브에 10%FBS를 사용하여 5권의 DMEM을 튜브에 추가합니다. 180 Gs.Then에서 3 분 동안 세포를 원심 분리하고, 펠릿을 방해하지 않도록주의하여 슈퍼 나텐트를 흡인시합니다. 다음, LIF와 BFGF로 보충 조건 된 기초 매체에서 펠 릿을 다시 중단.6 개의 우물 판에 세포를 시드하고 플레이트를 교반하여 세포를 균등하게 시드합니다. 플레이트를 교반할 때, 플레이트를 소용돌이면 세포가 중앙쪽으로 집중될 수 있으므로 수평 및 수직으로 그렇게 합니다. 그리고 그 세포가 밤새 표준 세포 배양 인큐베이터에서 부착하고 성장하도록 허용합니다.미디어를 변경하기 전에 셀이 부착되어 있는지 확인합니다. O9-1 세포가 80%에 도달하면 지하 막 매트릭스를 해동하고 이전에 설명한 대로 지하 막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비한다. 그런 다음 멤브레인 매트릭스에 LIF 및 BFGF로 보충된 기저 미디어를

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

체외에서 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)을 육성하기 위해 특수 매체 (NCSCM)가 필요합니다. NCSCM의 필수적인 부분은 여자의 배아 추출물 (시)입니다. 우리는 여기서 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정과 같은 세부 사항을 포함하여 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.

Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

신경 튜브의 배아 신경 능선의 분리가의 사용을...

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

이 비디오는 신경 줄기 세포에서 관심 있는 특정 유전자를 침묵시키고 적절한 분화 배지를 사용하여 원하는 세포 유형으로 분화하기 위해 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 신경 줄기 세포의 분화 과정에서 특정 유전자의 중요한 역할을 연구할 수 있습니다.

신경 줄기세포에서 siRNA 매개 유전자 침묵

이 비디오는 병아리 배아의 중뇌 영역에서 두개골 신경 주름을 분리하는 기술을 보여줍니다. 신경 주름의 상세한 해부 과정, 그 위치 및 피브로넥틴으로 코팅된 커버슬립에 부착된 후 신경 주름에서 신경능선 세포의 이동을 관찰합니다.

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이 프로토콜은 주로 세포 이동 연구를 위해 마우스 모델에서 두개골 신경 문장 세포의 해부 및 배양을 설명합니다. 우리는 사용된 살아있는 화상 진찰 기술 및 속도 및 세포 모양 변경의 분석을 기술합니다.

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

이 다목적 프로토콜은 병아리 배아에서 두개골 신경 주름의 절제를 통해 이식 신경 볏 세포 (NCC)의 분리를 설명합니다. 도금 및 배양 시 이동 NCC가 신경 접힘 외식편에서 나와 단순화된 2D 환경에서 세포 형태 및 이동을 평가할 수 있습니다.

병아리 두개골 신경 볏 세포 배양의 준비 및 형태학적 분석

이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.

체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사

우리는 마우스 배아 줄기 세포에서 두개골 신경 능선 세포를 생성하기 위해 재현 가능한 크기의 신경구를 생성하는 3차원(3D) 체외 분화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 방법론이 이전 프로토콜에 비해 변동성을 줄이고 두개골 신경 능선 세포 발달을 연구하기 위한 다중 분석에 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.

Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

학습하세요 O9-1 신경 크레스트 세포 배양 및 siRNA와 CRISPR-Cas9 유전자 조작 기법. 이 프로토콜은 신경과학 및 줄기세포 연구에 활용 가능한 강력한 in vitro 모델을 제공합니다.

경작 및 O9-1 신경 크레스트 세포의 조작

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