Name: 전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 마우스 신경근 접합부에서 근육 및 슈반 세포의 칼슘 신호를 실시간 이미징하는 방법을. 이 기법은 특정 세포 유형의 활성화를 시각화하여 신경 자극에 대한 세포 반응을 연구합니다.

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이 작품은 자금 및 연구 자원 5P20RR018751에 대 한 국립 센터 및 국립 연구소의 종합 의료 과학 8 P 20 GM103513 (G.W.H.)에 건강 (NIH) GM103554 및 GM110767 (T.W.G.)에 국립 보건원에서 지원 되었다.

축산 및 실험 치료 및 실험 동물의 사용 및 네바다의 대학에 IACUC 국가 학회 건강 가이드에 따라 수행 했다.
1. 격 막 및 유전자 변형 쥐에서 인할지 신경의 준비
<ol><li>유전자 변형 쥐와 유전자 형을 oligonucleotide 뇌관 이러한 마우스 구입. 참고: 뇌관은 이러한 쥐의 각에 대 한 "정보" 페이지에 표시 됩니다.<ol>
<li>Cre 드라이버 대립 유전자 변형/노크-에서 적절 한 1 부와 조건부 GCaMP3의 하나 또는 두 개의 복사본을 표현 하는 같은 나이의 두 번째 마우스 조건부 GCaMP3/6 대립 유전자의 복사본 0 3-6 개월 마우스 사육 / 6 대립 유전자와 제로 사본의 Cre 드라이버 대립 유전자.</li>
		<li>유전자 형 Cre와 조건부 GCaMP3/6 대립 새끼와 마크 것 들-이 이제부터 이중 유전자 변형 쥐 이라고 불릴 것 이다 (예를 들어, Myf5 Cre, 조건부 GCaMP3)6. 참고:이 방법으로 모든 데이터는에서 파생 Cre와 조건부 GCaMP3/6 대립 유전자의 복사본 하나를 표현 하는 쥐. 이 십자가에 다른 돌연변이 마우스 (예를 들면, 녹아웃)에 추가할 때 이것은 특히 중요 하다입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 나이의 이중 유전자 변형 쥐가 되는 때 (예를 들어, 0 또는 5 [P0 또는 P5] 출생 후 하루 또는 성인)가 위 (P10 보다 젊은 쥐)에 대 한 그들을 목이 또는 isoflurane 흡입 챔버에 배치 하 여 쥐를 안락사-때 더 이상 꼬리를 꼬 집는 집게의 쌍을 가진 반응, 그들은 희생에 대 한 준비입니다.</li>
	<li>가 위로 잘린 여 동물을 희생.</li>
	<li>전체 동물 간 바로 아래와 심장 그리고 iridectomy가 위 폐 바로 위에 걸쳐 transversely 섹션.</li>
	<li>멀리 간, 심장, 그리고 충분히 흡입 전극 (즉, 1-2 cm)으로 얻을 수 긴 인할지 신경의 길이 유지 하기 위해 주의 되 고 폐 해 부. 참고: 왼쪽된 인할지 신경 왼쪽된 횡 경 막의 중간 부분을 입력 하는 직물의 백색 조각으로 확인할 수 있습니다. 그것은 폐를 제거할 때 잘라 하지 해야 합니다. 바로 인할지 신경도 뛰어난 베 나 정 맥을 포함 하 고 얇고 하얀 베 나 정 맥 보다는 근 막의 조각 내에서 실행 됩니다. 함께, 그들은 둘 다 오른쪽 중간 격 막 관통.</li>
	<li>또한 흉 곽과 횡 경 막 주위의 얇은 릿지를 제외한 척추 열을 제거 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 10 분 1 µ g/mL 594-αBTX와 Krebs 벨 솔루션 microfuge 관에서 횡 경 막과 인할지 신경 샘플을 놓습니다. 참고: 594-αBTX의이 농도 그들의 기능 (개인 관찰)를 차단 하지 않고 ACh 수용 체 (AChRs) 라벨.</li>
</ol>2. 자극과 근육 활동 전위의 기록
<ol><li>횡 경 막을 무력화 minutien 핀을 사용 하 여 고정 6 cm 접시에 실리콘 유 전체 젤 코팅 산소 Krebs 벨 솔루션의 ~ 8 mL 가득 하 고 현미경 스테이지에 배치. 30 분에 대 한 더 많은 Krebs 벨 솔루션 (8 mL/min) 격 막 perfuse 참고:이 빨고 언바운드 594-αBTX로 조직 해 부 후에 equilibrates.</li>
	<li>7설립된 방법 따라 흡입 전극을 확인 합니다.<ol>
<li>Micromanipulator를 사용 하 여 4 배 확대에서 왼쪽된 인할지 신경 흡입 전극 이동 하 고 흡입 전극에 연결 된 배관에 연결 된 5 mL 주사기의 배럴을 밖으로 당겨 흡입을 적용 합니다. 참고: 성공적으로 흡입 전극으로 당겨 때 인할지 신경 긴장 된입니다. 자극을 자극은 인할지는 수동 틀 지 하 여 신경 스위치 1 x.</li>
		<li>횡 경 막 계약 1 Hz 자극에 응답에서 시각적으로 명시 조명 그것을 검사 하 여 확인 합니다. 그렇지 않은 경우에 점차적으로 근육 수축의 시각적인 검사에 의해 확인 될 수 있는 supramaximal 펄스를 달성 하기 위해 전압 조절기를 켜는 여 전압을 조정. 아직도 보이지 않는, 주사기와 신경 려 고 흡입을 적용 하 여 다시 그리는 시도.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관류를 끄고 특정 근육 myosin 억제제 제너 시스6 또는 전압 개폐 나트륨 채널 길 항 제 µ-conotoxin8 100 µ M의 최종 농도를 추가.<ol>
<li>100 µ M 제너 시스, DMSO에 200 m m 재고 4 µ L 플라스틱와 Krebs 벨 솔루션의 1 mL에 predilute.</li>
		<li>접시에서 Krebs 벨 솔루션의 1 mL를 제거 합니다.</li>
		<li>접시에 제너 시스 prediluted를 추가 합니다. 참고:이 predilution GCaMP3 표현 셀에 임시가 아닌 형광 반응의 undiluted DMSO에 의해 유도 방지할 수 있습니다.</li>
		<li>30 분을 기다려 하 고, 또 다른 20-30 분에 대 한 신선한 Krebs 벨 솔루션의 관류를 켭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기록 전극 준비.<ol>
<li>입고 장갑는 1 m m와 0.4 m m의 내부 직경 (ID)의 외경 (OD)와 붕 규 산 filamented 유리 micropipette 끌어당기는 장소와 위치에 그것을 클램프로 다이얼을 조여. 끌어당기는 사람 문을 닫습니다.</li>
		<li>P-97 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음과 같은 설정 프로그램: 900에서 열, 120에서 당겨, 75에서 속도, 250, 500, 그리고 아무 추가 루프에서 압력에 시간. 참고: Resistance (R)는 앰프의 소프트웨어 컨트롤을 사용 하 여 측정: 수식 V를 해결 하 여 저항을 확인 하는 데이터 수집 소프트웨어 적외선 = 소프트웨어 컨트롤러 전극을 통해 알려진된 전류 (I) (일반적으로 1 없음)를 전달 하 고 우리 인민에 대 한 해결 하기 위해 활성화 전압 (V)에 변화를 측정</li>
		<li>배아 격 막에 대 한 저항 60 m ω, 및 더 오래 된 격 막, 10-20 m ω에 대 한 있는지 확인 합니다. 3m KCl와 기록 전극 로드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 배 확대에 전극 자극 전극으로 무대의 반대 측에 두 번째 micromanipulator를 사용 하 여 근육에 낮은.</li>
	<li>휴식 막 잠재력 0에서-65로 변경 될 때까지 기다립니다 electrophysiological 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여, mV 또는 아래.</li>
	<li>1 Hz에서 자극 하 고 겸손 한 오버 슛을 전시 하는 큰 잠재력을 확인 하 여 근육 활동 전위의 존재를 확인 (0 이상으로 상승 잠재력-65에서 시작 될 때 뮤직 비디오 mV 또는 아래). 활동 전위와 자극 유물을 혼동 하지 마십시오. 참고: 잠재력은 상당히 긴 기간 (~ 5 ms)에 자극 유물 보다.</li>
</ol>3. 샘플의 형광 이미징
<ol><li>20 X 확대, 녹색/황색 빛 여기에서 NMJs 594-αBTX-표시를 찾아 근육의 중심에 종판 밴드 찾습니다 (550 nm). 파란 가벼운 흥분으로 전환 (470 nm) 이미지 캘리포니아2 + 근육, 모터 신경, Schwann 세포에 응답을.</li>
	<li>원하는 경우, 대역 통과 필터와 듀얼-파장 이미징 dichroic 단일에 지 필터 이미지 스플리터를 설정 합니다.</li>
	<li>GCaMP3/6 표현 조직에 의해 전시 최대 형광 (Fmax)를 계산 하기 위해 횡 경 막 준비63 M 염화 칼륨 (KCl)의 12 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>GCaMP3/6 표현 조직 KCl에 binning 없이 20 배 확대에 채도 전시 하는 레벨의 110%로 설정 하는 조회 테이블 바에 밝기 바와 실험을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>어떤 빠른 이벤트를 놓치지 하지 초당 20 프레임에 기록.</li>
	<li>충 동을 사용 하 여 흡입 전극의 기차를 제공 하 여 신경 자극의 20-40 Hz의 1-45 s 자극 하 고 또는 목욕 응용 프로그램 또는 관류 약리 촉진제를 추가 하 고 동적 형광 캘리포니아2 + 응답 한 셀 하위에 수집 함께 정적 594-αBTX NMJ 신호. 참고: 조직의 특정 빨강 또는 빨강 GECI 또는 GEVI 마우스는 NMJ에 사용 하기 위해 사용할 수 있게, 그들은 NMJ에 두 가지 세포 요소를 반영 하는 두 개의 동적 신호 수집을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>끝나면 이미징 또는 electrophysiological 실험은 원하는 결과 달성 했기 때문에, perfuse 관류 라인을 통해 물 하 고 물 2 배-3 배 소금 구축 하지 않습니다 보장 하기 위해 흡입 전극을 통해 빨 아.</li>
</ol>4. 수출 및 (SDiu16) 형광 강도의 표준 편차 지도 데이터의 분석
<ol><li>16 비트 TIFF 스택으로 기록 된 이미지 시퀀스를 기록 하 고 분석을 위해 원하는 이미지 데이터 분석 시스템으로 그들을 로드.</li>
	<li>소프트웨어의 8 d 파일 메뉴에서 관심의 이미지 스택 을 선택 하 고 로드를 클릭 합니다.<ol>
<li>비디오 로드, 일단은 아무 세포 형광 활동 섹션을 식별 하는 시간을 통해 검색 합니다. 참고:이 지역의 배경 샘플을 만드는 데 사용 됩니다.</li>
		<li>Shift 를 누른 배경 샘플 지역으로 확인 된 지역 지역 관심 (ROI) 상자를 클릭 합니다.</li>
		<li>상자를 만든 후 배경 활동 변경의 플롯을 생성 하기 위해 스페이스 바 를 누르십시오.</li>
		<li>추적 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 xy 좌표 텍스트 파일로 추적을 덤프 텍스트로 ROI 에 옵션을 제시 하는 여러 옵션을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 관심의 비디오를 이동, 다시 관심의 활동 발생 시간 영역을 식별 하기 위해 스캔.<ol>
<li>마우스 가운데 단추를 사용 하 여 노란색 시간 상자에이 시간 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>동영상에 단추로 스택 본부 및 다음 합계 지도 옵션 5 선택 합니다. 참고: 왼쪽된 창에 표준 편차 (SD 지도) 지도 생성 됩니다.</li>
		<li>SD에 클릭 하 고 다음 눌러 ] 키 19 x 적용 적절 한 색상 열 지도를.</li>
		<li>SD 지도 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 STM 로드 및 저장, SD 지도 저장 하 stm tiff로 저장 하는 옵션을 제공 합니다를 선택 합니다.</li>
		<li>그때, 기자 [ 키 19 x는 회색조 색상 지도 돌아갑니다.</li>
		<li>C 와 다음 D 밀도 매핑 도구를 누릅니다. 왼쪽된 마우스 버튼, 가운데 마우스 버튼 사용 하, 임계값 SD 지도에 표시 된 모든 형광 활동을 조정할.</li>
		<li>C 임계값 설정을 유지 하면서 밀도 도구를 닫으려면 누릅니다.</li>
		<li>SD 지도 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택한 STM 입자 다음 찾을 PTCLS. 참고:이 형광 활동을 표현 하는 개별 셀을 식별 합니다.</li>
		<li>SD 지도 한 번 더 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 입자 ROIs 만들기를 선택 합니다. 참고:이 관심의 원본 동영상에서 선택한 셀을 입력 해 것입니다.</li>
		<li>Shift 키를,하는 동안 원본 비디오에 지금은 확인 된 입자 ROIs 중 하나에 마우스 오른쪽 단추로.</li>
		<li>투자 수익 마커 및 투자 수익의 측정 Int를 선택 합니다. 참고:이 관심의 비디오에서 확인 된 각 투자 수익에 대 한 개별 형광 활동 플롯을 생성 합니다. 이 텍스트로 덤프 ROI선행 Assorted, 선택 하 고 아무 이들 중 하나를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이러한 작업을 기본 자세한 논리, 소스 코드 파일9를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 측정 캘리포니아2 + 그대로 신경 근육 학 조직 GECI 표현 하는 마우스를 사용 하 여 특정 셀에 응답의 몇 가지 예제를 제공 합니다. 이러한 실험을 성공적으로 수행 하려면 인할지 신경 해 부 동안에 상처를 하지 필수적입니다. 캘리포니아2 + 응답 Schwann 세포 낮은 또는 높은 전력 (즉, 20 X 또는 X 60)에, 이미지를 제너 시스 또는 µ-conotoxin 블록에 사용할 필요가 있다. 캘리포니아2 + 근육 세포에 반응의 낮은 전력 이미징, 그것은 따라서 허용 근육 캘리포니아2 + 과도 농도 근육의 동시 취득 중 길이 변경 이러한 약물이 없을 경우에 그들을 측정할 수 고주파 신경 자극6. 동일한 샘플에서 여러 실험을 수행할 때 그것은 각 한 시간 동안 샘플을 끼얹는다 수 적어도 15 분을 구분 하는 데 필요한. 이 단계 적어도 3-5 시간 동안 자극 유발 Ca...

모든 시 냅 스 처럼 NMJ 3 요소의 구성: 터미널 연 접 신경 postsynaptic 신경/이펙터 셀에서에서 파생 하 고 perisynaptic glial 세포1,2. 시 냅 시스 전송의 기본적인 측면 처음이 시 냅 스3에서 설명 되었다, 하는 동안이 프로세스의 여러 측면,이 시 냅이 스의 고유 셀룰러 요소에 의해 동일한 분자의 표현 때문에 부분에서 알 수 없는 남아 있습니다. 예를 들어 모터 뉴런 척추 NMJ에 의해 공동 출시 되는 퓨 린 아데닌 뉴클레오티드 ATP와 아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 근육, Schwann 세포, 모터 신경, 따라서 복잡의 해석에 의해 표현 됩니다. 이러한 물질 (예를 들어, 송신기 릴리스 또는 응답, 근육 힘 세대)4에 의해 발휘 하는 기능 효과. 또한,는 NMJ의 같은 구성 요소는 간단한에 비해, 예를 들어 신경 중앙 신경 조직에 여러 개의 시 냅 스 입력, 수시로 전시 하는 모터 신경 세포, 근육 세포, 또는 Schwann 세포 다를 기반으로 하는 자극에 대 한 응답 여부 그들의 내장에 (예를 들어, 배아 파생, 섬유 하위, 형태학)이 명확 하지 않다. 각 이러한 문제를 해결 하기 위해 그것은 동시에 같은 시간, 같은 다른 별도 요소 중 하나에 응답에 트랙 뿐만 아니라 한 시 냅 스 요소 내의 많은 세포의 응답을 추적 하는 것입니다. 칼슘 신호 측정 화학 염료를 사용 하 여 기존의 전략 목욕 적용 염료 조직으로, 신청 후 여러 셀 유형에 의해 채택 되 고 침 로드 염료 시각화에 사용할 수 있기 때문에이 두 가지 목표를 달성할 수 없는 셀의 개인 또는 작은 동료 여기, 휴대 전용 칼슘 신호, 특정 영상 및 소프트웨어 도구5, 우리는이 두 가지 전반적인 목표의 처음을 설명 하 고 토론을 측정 하도록 설계 GECIs를 표현 하는 유전자 변형 쥐를 이용 하 여 어떻게의 새로운 유전자 변형 도구 두 번째 달성 도움이 될. 이 기술은 추적 칼슘 역학 또는 동시에 여러 세포 인구에서 유전자 인코딩 광학 센서를 통해 이벤트 관찰할 신호 다른 세포에 관심이 사람에 대 한 유용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>Myf5-Cre 마우스</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>E136</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre 마우스</td><td>Jax</td><td>#003829</td><td>발현을 모두 주도합니다&nbsp; E13에서 Schwann 세포를 사용하지만 P20<sup가 아닌 class="xref">9<</td></tr><tr><td>/sup>Sox10-Cre 마우스</td><td>Jax</td><td>#025807</td><td>고령에서 Schwann 세포 발현을 촉진</td></tr><tr><td>조건부 GCaMP3 마우스</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>GCaMP3를 세포 특이적 방식으로 표현</td></tr><tr><td>조건부 GCaMP6f 마우스</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>GCaMP6f를 세포 특이적 방식으로 표현</td></tr><tr><td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>골격근 미오신 차단하지만 신경 전달은 차단하지 않음6</td></tr><tr><td>CF594-&alpha;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>Labels 아세틸콜린 수용체 클러스터 NMJ</td></tr><tr><td>&micro;-conotoxin GIIIb</td><td>Peptides Int'l</td><td>#CONO20-01000</td><td>Nav1.4 전압 의존적 나트륨 채널 차단8</td></tr><tr><td>실리콘 유전체 젤; 일명 Sylgard</td><td>Ellswoth 접착제</td><td># Sil Dielec 젤 .9KG&nbsp;</td><td>minutien 핀에 의한 다이어프램의 고정을 허용합니다</td></tr>.<tr><td>Minutien 핀 (지름 0.1mm)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>다이어프램을 실리콘 유전체 젤</td></tr><tr><td>Eclipse FN1 수직 현미경</td>에 고정시킵니다.<td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td></td></tr><tr><td>수동 XY 현미경 변환기를 사용하여 표본 기본 고정 현미경 플랫폼의</td> 스테이징 및 관찰을 허용합니다&nbsp;<td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>표본</td></tr><tr><td>수동 미세 조작기의 이동 허용&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td>는 <td>녹음 및 자극 전극을 보유하고 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>미세 전극 증폭기&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A는</td><td>날카로운 전극을 이용한 세포 내 전기생리학적 기록을 가능하게 하는</td></tr><tr><td>Microelectrode 저소음 데이터 수집 시스템</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1550&nbsp;</td><td>전기생리학적 데이터 수집 허용</td></tr><tr><td>미세전극 데이터 분석 시스템</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 10 표준</td><td>전기생리학적 데이터 분석을 수행합니다</td></tr>. <tr><td>사각파 자극기</td><td>Grass</td><td>S48</td>은 <td>신경을 자극하여 근육을 자극합니다</td></tr>. <tr><td>자극 격리 유닛</td><td>Grass</td><td>PSIU6</td>는 <td>자극 아티팩트</td></tr><tr><td>Borosilicate 필라멘트, 외경 1.0mm, 내부 직경 0.5mm</td>를 줄입니다.<td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td>는 <td>신경 유발 근육 잠재력을 관통하고 기록합니다.</td></tr><tr><td>보로실리케이트 필라멘트, 외경 1.5mm, 내경 1.17mm&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>흡입 전극</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter</td><td>P-97에</td> 사용 연장 및 사용;<td>기록 전극을 당기고 준비합니다.</td></tr><tr><td>1200x1200 픽셀, 이면조사형 cMOS 카메라&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>고해상도, 고속 이미징을 허용하는 민감한 카메라</td></tr><tr><td>광원</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>형광 관찰을 위해 LED에서 조명을 제공</td></tr>&<tr><td>nbsp; 무한 보정된 형광 물 침수 목표물, W.D. 2mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td>은 할로겐 램프가 있는 표본 광섬유 조명기의 <td>시각화를 위한 긴 작동 거리를 제공합니다</td></tr>. <tr><td></td><td>LS-DWL-N</td>은 <td>명시야 관찰을 위한 조명을 제공합니다</td><td></td></tr>. <tr><td>W-View Gemini 이미지 스플리터&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td>은 <td>이색적으로 단일 카메라로 분리된 이중 파장 이미지 1쌍을 투사</td></tr>합니다<tr><td>. 단일대역 밴드패스 필터&nbsp; (512/25-25 및 630/92-25)&nbsp;</td><td>셈록</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>듀얼 밴드 이미징 허용</td></tr><tr><td>560nm 단일 에지 이색성 빔스플리터</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>이중 파장 이미징을 허용하기 위해 광선을 분리하는 이색성 미러</td></tr><tr><td>이미징 데이터 수집 시스템</td><td>Nikon</td><td>NIS 요소 - MQS31000</td><td>이미징 데이터 수집 허용</td></tr><tr><td>파장 제어 모듈</td> 이미징 데이터용 <td>Nikon</td><td>MQS41220</td><td>모듈 acqusiition</td></tr><tr><td>방출 스플리터 하드웨어 모듈&nbsp;</td><td>이미징 데이터 수집을 위한</td> <td>Nikon</td><td>MQS41410</td> 모듈</tr><tr><td>이미징 데이터 분석 시스템</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D5, 피지</td><td>형광 강도 및 기타 이미징 데이터 분석 가능</td></tr></tbody></table>

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Electrophysiological 기법에 의해 조직에 있는 세포의 전기적 활동을 모니터링할 수 있습니다 있지만 이들은 일반적으로 개별 셀의 분석을 제한. 셀의 이미징 형광 칼슘-민감한 로드 이후는 cytosol에서 세포내 칼슘 (캘리포니아2 +)의 증가 종종 전기 활동 때문에 발생 합니다 또는 다른 자극의 무수에 응답,이 프로세스에 의해 모니터링 수 있습니다. 염료입니다.  그러나, 그것은이 염료는 조직 내의 모든 세포 유형에 의해 채택 하기 때문에 전체 조직 내에서 개별 셀 형식에서이 응답을 이미지 어렵다. 반면, 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)는 개별 셀 형식에 의해 표현 될 수 있습니다 및 세포내 캘리포니아2 +, 따라서 허용의 캘리포니아2 + 의 전체 인구에 있는 신호 이미징의 증가에 대 한 응답 형광 개별 셀 종류입니다. 여기, 우리는 마우스 신경 근육 학 교차로 적용할 GECIs GCaMP3/6의 사용, 모터 신경, 골격 근육, 및 터미널/perisynaptic 사이 3 자간 냅 Schwann 세포. 조직 준비 클래식 비보 전 에이 기법의 유틸리티를 설명합니다. 광 스플리터를 사용 하 여, 우리 수행 동적 캘리포니아2 + 신호 듀얼-파장 이미징 및 신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 정적 레이블 두 셀 전용 GECI 또는 유전자 인코딩된 전압 모니터링을 쉽게 적용할 수 있는 방법을 지표 (GEVI) 동시에. 마지막으로, 우리는 형광 강도의 공간 지도 캡처하는 데 사용 하는 루틴을 논의. 함께, 이러한 광학, 유전자 변형, 그리고 분석 기술은 공부를 다양 한 문맥에서에서 NMJ에 뚜렷한 세포 모집단의 생물 학적 활동을 사용할 수 있습니다.

형광 강도 변화, 세포내 캘리포니아2 + , NMJ의 정의 된 세포 유형 내에서 증가 의해 중재의 몇 가지 예는이 접근의 유틸리티 표시. 이러한 결과 응답 셀의 위치 뿐만 아니라 셀 수 응답 및 얼마나 많은 각 셀에 특정 응답의 평가 되므로 그들의 반응의 강도 제공 하는 공간 형광 강도 지도 제시 자극입니다. 예를 들어 그림 1에서 보듯이, 우리의 동영상을 했습니다 터미널/perisynaptic Schwann의 인구에서 캘리포니아2 + 응답 P7 Wnt1-Cre;의 격 막의 NMJs에 셀 (TPSCs) 조건부 GCaMP3-인할지 신경의 자극에 대 한 응답에서 마우스 하 고 공간 형광 강도 지도 응답 셀의 모집단 식별 표현. 형광 강도의 이러한 지도 열 지도 하 고 불 색 조회 테이블 (화재 CLUT)에 따라 색상으로 구분 되 게 됩니다. 우리는이 ...

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

이 방법은 신경 자극에 응하여 근육 또는 슈완 세포에서 칼슘 신호의 역할과 같은 신경 근육 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 자극에 반응하여 특정 세포 유형의 활성화를 이미지화 할 수 있다는 것입니다. 시작하려면, 형질 전환 마우스를 얻고, 텍스트 프로토콜에 상세한 대로 유전자형을 얻을.안락사 에 따라, 횡방향 간 바로 아래와 iridectomy 가위와 심장과 폐 바로 위에 전체 동물을 가로 질러 섹션. 간, 심장 및 폐를 해부합니다. 흡입 전극에 끌릴 만큼 충분히 긴 프린닉 신경의 길이를 유지하기 위해 주의.다이어프램 주위의 얇은 능선을 제외하고, 흉곽과 척추 컬럼을 추가로 제거합니다. 형광으로 표지된 알파 분가로톡신의 밀리리터 당 1마이크로그램을 함유한 크렙스 링거 용액을 함유한 미세분리관에 다이어프램과 프린소 신경 샘플을 배치합니다. 표본이 어둠 속에서 10 분 동안 용액에 인큐베이션되도록 하십시오.미누티엔 핀을 사용하여 실리콘 유전체 젤로 코팅하고 산소가 공급된 크렙스 링거 용액약 약 8밀리리터로 채워진 6센티미터 접시에 고정하여 다이어프램을 고정합니다. 현미경 단계에 접시를 놓습니다. 그런 다음 분당 8 밀리리터에서 30분 동안 더 많은 크렙스 링거 용액으로 다이어프램을 견딜 수 있습니다.4배 배율에서, 마이크로 조작기를 사용하여, 좌측 프렌닉 신경 위로 흡입 전극을 이동합니다. 흡입 전극에 부착된 튜브에 연결된 5밀리리터 주사기의 배럴을 꺼내 흡입을 적용합니다. 다이어프램이 브라이트필드 조명으로 시각적으로 검사하여 헤르츠 자극에 대응하여 수축되는지 확인합니다.그렇지 않은 경우, 전압 노브를 점진적으로 돌려 근육을 수축하는 육안 검사에 의해 확인할 수 있는 초막펄스를 달성하여 전압을 조절한다. 여전히 보이지 않는 경우 주사기로 신경을 날려 흡입을 적용하여 다시 그릴 수 있습니다. 지금, 근육 특이적 미오신 억제제 BHC 또는 전압 게이트 나트륨 채널 길항제 mu-conotoxin를 추가하기 위해 관혈을 끕니다.크렙스 링거 솔루션의 1밀리리터에 DMSO에 200 밀리머 스톡 BHC의 4개의 마이크로리터를 배관하여 BHC 사전 희석을 준비하십시오. 접시에서 크렙스 링거 용액 1밀리리터를 제거합니다. 그런 다음 미리 희석 된 BHC를 접시에 추가합니다.30분 후, 신선한 크렙스 링거 용액의 관류를 20~30분 간 돌립니다. 장갑을 착용하고, 1밀리미터의 외지와 0.4밀리미터의 내지름을 마이크로피펫 풀러에 배치하여 기록 전극을 준비합니다. 다이얼을 조여 제자리에 고정하고 풀러 도어를 닫습니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 풀러를 프로그래밍합니다. 배아 다이어프램의 경우 앰프의 소프트웨어 제어를 사용하여 저항을 측정합니다. 저항이 60 메가옴에 가깝고 오래된 다이어프램, 10~ 20메가옴에 가깝습니다.이제 기록 전극을 3개의 어금니 칼륨염으로 적재합니다. 10배 배율에서, 자극전극으로 무대 반대편에 있는 두 번째 미세 조작기를 사용하여 전극을 근육으로 낮추어보라고 한다. 전기 생리학적 데이터 수집 소프트웨어를 사용하면 휴게멤브레인이 0에서 영하 65밀리볼트 이하로 변경될 때까지 기다립니다.한 hertz에서 자극 하 고 겸손 한 오버 슈트를 전시 하는 큰 잠재력을 확인 하 여 근육 행동 잠재력의 존재를 확인. 자극 아티팩트를 작업 잠재력과 혼동하지 마십시오. 20배 배율은 녹색 노란 빛 여기 아래 형광표 알파 분가로톡신 신경근육 접합을 찾아 근육의 중심에 엔드 플레이트 밴드를 찾습니다.근육, 운동 신경 또는 슈완 세포에서 칼슘 반응을 이미지하기 위해 청색 광 여기로 전환하십시오. 이 예에서 GCaMP 3근육 세포에서 발현된다. 원하는 경우, 밴드 패스 필터와 이중 파장 이미징을 위한 디크로이크 단일 가장자리 필터로 이미지 스플리터를 설정합니다.슈타튬 염화물에 반응하여 비닝하지 않고 조직을 표현하는 유전적으로 인코딩된 칼슘 표시기가 20배 배율로 포화를 나타내는 레벨의 110%로 설정된 조회 테이블 바의 밝기 막대로 실험을 수행합니다. 빠른 이벤트를 놓치지 않도록 초당 20 프레임으로 기록하십시오. 흡입 전극을 사용하여 충동의 기차를 제공함으로써 신경 자극의 20 에서 40 헤르츠의 1 ~ 45 초로 자극하고 정적 형광표시 알파 bungarotoxin 신경 근육 접합 신호와 함께 한 세포 하위 유형에서 동적 형광 칼슘 반응을 수집합니다.약리학 작용제는 또한 목욕 응용 프로그램에 의해 또는 관류에 의해 추가될 수 있고 동적 형광 칼슘 반응은 같은 방법으로 수집될 수 있습니다. 화상 진찰 또는 전기 생리학적 실험이 완료되면 원하는 결과가 달성되었기 때문에, 관류 선을 통해 물을 퍼퓨아서 흡입 전극을 통해 2~3회 물을 빨아 소금이 쌓이지 않도록 한다. 7일 산후일에 Wnt 1 GCaMP 3개의 마우스 횡격막의 프렌트 신경 자극에 대한 슈완 세포 칼슘 반응의 공간지도는 신경근육 접합부에서 말단 파라시냅틱 슈반 세포에 대한 제한을 나타낸다.같은 다이어프램은 형광으로 표지된 알파 분가로톡신으로 라벨을 붙인 후 이미지화되었으며, 이는 신경 근육 접합의 아세틸콜린 수용체를 가능하게 하는 결속을 결합합니다. 동일한 다이어프램은 또한 신경 근육 접합에 의해 근육의 시냅스 후 부위에 기록 전극을 안내하기 위해 브라이트 필드 조명 에서 이미지되었다. 여기에 개별 칼슘 과도의 분석을 위해 취한 색 코딩 된 세포 또는 관심 영역의 공간 경계가 있습니다.mth 5 GCaMP3 마우스 다이어프램의 근육 세포 칼슘 반응의 공간 맵은 모신 억제제 BHC의 존재에서 프렌닉 신경 자극에 모든 다이어프램 근육 세포의 전체 영역에 걸쳐 응답을 나타낸다. 대조적으로, 무코노톡신이 존재하여 동일한 다이어프램의 자극은 아세틸콜린 수용체 클러스터농축 단판 대역에 대응하는 모든 다이어프램 근육 세포의 내측 영역에서 공간적으로 제한된 칼슘 반응을 일으킨다. 이 절차에 따라 면역-히스토케또는 면역블로팅과 같은 다른 방법은 전기생리학 또는 칼슘 이미징에 의해 확인된 세포의 분자 프로파일과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니까?이 방법은 일반적인 신생아 마우스에 있는 신경 자극에 Schwann 세포 및 근육 세포의 인구 반응에 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 더 오래 된 쥐의 연구 또는 신경 근육 질환 관련 된 단백질을 표현 하는 쥐의 연구에 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Heredia, D. J., et. al. 마우스 횡격막의 삼자 시냅스에서 세포 특이적 칼슘 신호의 생체 외 이미징. J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오는 형광 이미징을 보여줍니다. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 마우스의 신경근 접합부(NMJ)에서의 칼슘 역학. NJM은 횡격막과 횡격막에 형광으로 표시된 아세틸콜린 수용체에 의해 확인됩니다. 이미지 스플리터는 여러 신호를 동시에 시각화하는 데 사용됩니다. 전기 자극이 전달되고 칼슘 유입에 대한 NMJ의 형광 변화가 기록됩니다.

형질전환 마우스의 횡격막에서 신경근 접합부에서 칼슘 역학의 형광 이미징(Fluorescence Imaging of Calcium Dynamics at Neuromuscular Junctions in the diaphragm of a transgenic mouse)

출처: Shannonhouse, J., et al. 생체 내 온전한 배근 신경절의 1차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 형질전환 마우스의 배측근신경절(DRG)에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 생체 내 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. DRG 뉴런은 칼슘에 결합할 때 형광 강도를 증가시키는 칼슘 지표를 발현합니다. 뒷발에 가해지는 기계적 또는 열적 자극은 DRG로 전파되는 활동 전위를 생성하여 뉴런에 칼슘 유입을 유도하고 형광 방출을 증가시킵니다.

In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

출처: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ 장 신경계의 영상. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 칼슘을 보여줍니다. 마우스 Colonic Myenteric plexus 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 시각화하고 분석하기 위한 이미징.

Calcium Imaging of enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus(마우스 결장 근육총에서 장 뉴런 및 신경교 활동의 칼슘 이미징)

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

배우세요 마우스 신경근 접합부에서 근육 및 슈반 세포의 칼슘 신호를 실시간 이미징하는 방법을. 이 기법은 특정 세포 유형의 활성화를 시각화하여 신경 자극에 대한 세포 반응을 연구합니다.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

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