Name: 영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 학습하세요 기관 점막에서 2광자 생체 현미경법을 이용한 면역 세포 상호작용 분석 방법을. 이 기술은 호흡기 감염 중 호중구와 수지상 세포의 동역학을 실시간으로 관찰하여 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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<li>Jaber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+regimens%2C+variability%2C+and+complications+associated+with+using+repeat-bolus+dosing+to+extend+a+surgical+plane+of+anesthesia+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).</li>
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저자는 공개 없다.

이 작품 마우스 기도에 인플루엔자 감염 시 adoptively 전송 된 호 중구 및 DC와 그들의 상호 작용의 마이그레이션을 보여주는 4 D 이미지의 생성에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 설명된 2 P-IVM 모델 기도에 감염 시 면역 세포 역학 연구와 관련이 있을 것입니다.
최근, 기도에 셀 역학의 시각화를 기반으로 여러 모델 개발된9,10,11,12,,1314,15 되었습니다. ,16. 그러나...

두 광자 intravital 현미경 검사 법 (2 P-IVM) 실시간 이미징 세포 세포 상호 작용의 그들의 자연 환경1에서 발생에 대 한 효과적인 기술입니다. 이 방법의 주요 장점 중 하나는 다른 전통적인 이미징 기술을2에 비해 더 큰 견본 깊이 (1 m m 500 µ m)에서 세포질 과정의 학문을 허용 한다. 같은 시간에 두 광자 레이저에 의해 생성 된 두 개의 낮은 에너지 광자를 사용 하 여 일반적으로 이미지 수집 과정2와 관련 된 조직 사진 손상 최소화 합니다. 지난 10 년 동안 2 P IVM 여러 분야3,,45에서 세포 세포 상호 작용의 다른 유형을 공부에 적용 되었습니다. 이 연구는 특히 면역 세포, 그들의 높은 역동성과 다른 세포와 환경에 의해 발생 하는 신호에 따라 눈에 띄는 연락처의 형성에 의해 특징 조사에 관련 된 되었습니다. 2 P-IVM 또한 병원 체 및 호스트6간의 상호 작용을 공부에 적용 되었습니다. 실제로, 그것은 이전 표시 되었습니다 일부 병원 체 종류와 면역 세포, 방해, 결과적으로 면역 반응7사이의 연락처의 기간을 변경할 수 있습니다.
기도 점 막 첫 번째 사이트는 공 수 병원 체에 대하여 면역 반응을 생성8입니다. 따라서, vivo에서 이 조직에서 호스트 병원 체 상호 작용의 분석은 감염 시 호스트 방어 메커니즘의 개시를 이해 하는 것 중요 합니다. 그러나, 기도의 2 P IVM 이미지 수집의 과정을 타협 하는 동물의 호흡 사이클을 제작한 유물 때문에 주로 도전 이다. 최근, 다른 외과 모델 이미징 murine 기관9,10,,1112 및 폐13,14,15, 설명 되었습니다. 16. Tracheal 2 P-IVM 모델 폐 포 2 P IVM 모델은 더 적당 한 감염의 늦은 단계를 공부 하는 동안 위의 기도에 면역 반응의 초기 단계를 시각화 하는 우수한 설치를 나타냅니다. 개발된 폐 모델 제시는 레이저의 광 침투를 제한 하 고 intrapulmonary 기도의 점 막 층을 vivo에서 17 이미징에 대 한 액세스할 수 있도록 공기 채워진 폐 포의 존재와 관련 된 제한 . 반대로, 연속 상피에 의해 형성 된 기관지의 구조는 이미지 수집을 촉진 한다.
여기, 우리가 현재 인플루엔자 감염, 동물, 수술 준비와 기도의 2 P IVM 수행 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 포함 하는 프로토콜. 또한, 우리는 호 중구 및 모 수석 세포 (DC), 인플루엔자 바이러스18,19에 대 한 방어 메커니즘의 중재자로 중요 한 역할을 재생 하는 두 개의 면역 세포 유형의 시각화에 대 한 특정 실험 설정 설명 . 마지막으로, 우리는 neutrophil DC 상호 작용을 분석 하는 절차를 설명 합니다. 이 연락처 DC 활성화 변조 표시 되었습니다 및, 그 후, 병원 균20에 대 한 면역 반응에 영향을 미칠.

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml; LKE & Mayr GmbH</td><td></td><td>4 % 용액</td></tr><tr><td>CD11c-YFP 마우스</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008829</td><td>마우스는 사내에서 사육</td></tr>되었습니다 <tr><td>CK6-ECFP 마우스</td><td>Jackson Laboratories</td><td>004218</td><td>마우스는 사내에서 사육되었습니다</td></tr><tr><td>1x Dulbecco의 인산 완충 식염수는 칼슘 Choride 및 염화마그네슘없이 변형</td>되었습니다 <td>Sigma D8537-500ML</td><td></td><td></td></tr><tr><td>칼슘 코라이드와 마그네슘 클로라이드 없이 수정된 10x Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L</td><td>4&deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>Ketamin Labatec Labatec</td><td>Pharma</td><td>7680632310024</td><td>RT의 4 &deg에 저장; C ket / 크실 혼합물</td></tr><tr><td>Rompun 2 % (Xylazin)</td> <td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>RT에 저장, 4 °C에 저장; C ket / xyl 혼합물</td></tr><tr><td>26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 0.3 mL BD 마이크로 파인 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro의 용액에있을 때; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x 18 G 바늘</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G (카테터)</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Cell Culture Cluster</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>4&deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Liberase TL 연구 등급</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>-20 &deg에 저장; C / 콜라겐 분해 효소 (I 및 II) 혼합물</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Amresco (VWR)</td> <td>0649-50KU</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>CellTrace 바이올렛 염색</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>-20°C에서 보관 & deg; C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>-20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>PE-10 마이크로 의학 배관</td><td>2Biological 계기 SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>외과 플라스틱 테이프</td><td>M Plast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch & Lomb</td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Plasticine</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High tolerance Glass Coverslip 15mm Round</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 휴대용 동물 마취 시스템</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag (기체 마취 및 가열 벤치)</td><td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SURGICAL BOARD</td>, <td>베른</td><td></td><td></td>대학교</tr><tr><td>TrimScope II, 이광자 현미경</td>, <td>LaVision, Biotec</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Chameleon Vision, Ti:Sa 레이저,</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 침수 대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>The Cube& The Box 인큐베이션 챔버 및 온도 컨트롤러</td><td>Life imaging Services</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td>imaging software</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistical software</td></tr></tbody></table>

영상 셀 상호 작용 tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

셀 또는 셀-병원 체 상호 작용에서 생체 내에서 의 분석 감염에 면역 반응의 역학을 이해 하는 중요 한 도구입니다. 2 광자 intravital 현미경 검사 법 (2 P-IVM) 이미지 수집 중에 생성 된 photobleaching를 최소화 하면서 생체, 깊은 조직에 세포 상호 작용의 관측을 허용 한다. 날짜 하려면, 다른 모델 2 P-IVM 림프 및 비 림프 기관에 대 한 설명 되었습니다. 그러나, 호흡 기관의 이미지는 동물의 호흡 주기와 관련 된 운동으로 인해 도전 남아 있습니다.
여기, 우리 2 P IVM를 사용 하 여 인플루엔자 바이러스에 감염 된 쥐의 면역 세포 상호 기도에 vivo에서 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 목적에 우리 외과 노출 및 호 중구 및 점 막 상피에서 수지상 세포 (DC)의 동적 이미지의 취득 다음, 기도의 삽 관 법을 포함 하는 사용자 지정 이미지 플랫폼을 개발 했다. 또한, 우리 인플루엔자 intranasal 감염 및 흐름 cytometric 분석 면역 세포의 기도에 수행 하기 위해 필요한 단계 자세한. 마지막으로, 우리 분석 neutrophil DC 운동 뿐만 아니라 그들의 상호 작용 영화의 과정. 이 프로토콜은 기도에서 세포 세포 상호 작용의 평가에 필요한 안정적이 고 밝은 4 D 이미지의 생성에 대 한 있습니다.

이 작품에서 우리 상세한 프로토콜 vivo에서 공부 하는 운동 성 및 호 중구 및 DC 간의 상호 작용 동안 설명 murine 기도 (그림 3A)에 인플루엔자 감염. 이 목적에 우리 고립 CFP+ 호 중구 (92% 순도; 그림 3B) CK6 ECFP에서 마우스와 우리 adoptively 전송 그들 독감 감염 CD11c YFP 마우스에. 그 후, 우리는 2 P-IVM 하루 3 탐정에서 기도의 수행 이 시간 지점에서 흐름 cytometric 분석 (그림 3C)와 같이 감염된 지역에서 호 중구의 명확한 모집을 관찰 합니다. 2 P-IVM 프로토콜 설치류 (그림 1A)에 대 한 특정 외과 보드 및 산소 공급의 사용을 요구 한다. 기...

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

이 방법은 호흡기 감염 중 면역 세포의 상호 작용 역학에 대한 공기 중 병원체에 대한 면역 반응 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단한 수술 전반에 걸쳐 기관 상피의 밝고 안정적인 4D 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 인플루엔자 감염 중 호중구와 용해 세포 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 면역 세포 또는 공기 중 병원체 연구에도 적용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 안정적이고 최소한의 염증 수술을 유지하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 또한 심장 결함이 있기 때문에 이미지 분석이 까다로울 수 있습니다. 비강 내 인플루엔자 감염의 경우, 마취된 6-8주 된 CD11c-YFP 마우스를 앙와위 자세로 눕히고 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 깊은 진정을 확인합니다.피펫을 왼쪽 콧구멍 가까이에 놓고 마우스가 15마이크로리터 용량의 PR8 접종을 모두 흡입할 때까지 약 20초 간격으로 작은 물방울을 비강으로 분사합니다. 2-5분 후 같은 방법으로 15마이크로리터의 바이러스를 오른쪽 콧구멍에 전달합니다. 모든 접종물이 전달되면 쥐가 정상적으로 호흡하고 있는지 확인하고 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 동물을 우리에 눕힙니다.감염 3일 후, 형질전환 CFP 발현 마우스에서 대퇴골과 경골을 모두 제거하고 집게로 뼈를 부드럽게 세척합니다. 뼈 골단을 자르고 26게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 멸균 차가운 PBS로 각 뼈의 골수를 얼음 위의 50ml 튜브로 씻어냅니다. 골수를 모두 채취한 후 바늘 끝을 통해 골수를 여러 번 흡인하고 40마이크로미터 여과기를 통해 해리된 세포 현탁액을 여과합니다.원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 2ml의 차가운 PBS에 재현탁합니다. 다음으로, 15밀리리터 튜브에 가장 집중된 것부터 가장 덜 농축된 것까지 3개의 Percoll 구배를 각각 2밀리리터씩 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 그런 다음 원심 밀도 구배 분리를 위해 2ml의 골수 세포 현탁액을 상단 구배층에 조심스럽게 추가합니다.원심분리가 끝나면 64 및 72% gradient 인터페이스에서 밴드를 조심스럽게 제거하고 차가운 PBS에서 호중구를 세척합니다. 그런 다음 계수를 위해 펠릿을 얼음 위에 100마이크로리터의 신선한 PBS에 재현탁시키고, 접종된 CD11c-YFP 수용 동물에 정맥 주사를 위해 PBS 농도 100마이크로

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

독감 바이러스에 동시 감염 asymptomatic 동안 침투 폐렴 구균 질환의 유도에 연루 요인 중...

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

본 연구진은 흉선의 생체 내 영상 획득을 위한 새로운 실험실 도구 및 프로토콜을 개발하였습니다. 이러한 기술은 T 세포 발달이 일어나는 흉선 내의 "니치(niches)"를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

인간 인플루엔자 A 바이러스에 대한 전신 및 국소 제브라피시 감염 모델을 보여줍니다. 전신 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 항바이러스제를 스크리닝할 수 있습니다. 국소 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 숙주 면역 세포 반응을 특성화할 수 있습니다.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

이 프로토콜은 IAV의 비강내 투여 및 마우스 폐 손상 및 폐 세포 유형에 대한 관련 전사 변화의 다운스트림 분석에 대한 지침을 제공합니다.

인플루엔자 감염 후 이형성 및 기능적 폐포 복구 모델링

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

학습하세요 기관 점막에서 2광자 생체 현미경법을 이용한 면역 세포 상호작용 분석 방법을. 이 기술은 호흡기 감염 중 호중구와 수지상 세포의 동역학을 실시간으로 관찰하여 면역 반응 연구에 활용됩니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

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