Name: 궁의 분리 마우스 모델에서 병 변 크기의 비 침 투 적인 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 자궁내막증 마우스 모델에서 형광 표지된 인간 자궁내막 조각의 실시간 라이브 이미징을 통한 비침습적 병변 크기 모니터링 방법. 이 기술은 약물 효과를 실시간으로 평가하여 치료 전략 개선에 기여합니다.

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이 작품 경제와 페더 (유럽 지역 개발 기금)에 의해 cofounded 미겔 세르 프로그램 [CP13/00077]을 통해 경쟁력의 스페인 정부에 의해 지원 되었고 박사 R. 고메스 뿐만 아니라 수 여 하는 카를로스 3 세 보건 연구소 교부 금에 의해 수 여 [PI14/00547 및 PI17/02329] 닥터 R 고메스와 교수 A. 카노 [PI12/02582].

인체 조직 표본 사용 기관 검토 위원회 병원 대학교 라 Fe의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 모든 환자 서 면된 동의 제공합니다. 동물 관련 연구 센트 드 Investigacion 프린시페 펠리페 데 발렌시아에서 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다 및 모든 절차 국립 보건원에서 관심과 포유류의 사용에 대 한 지침에 따라 수행 했다 건강.
1. 자궁내 막 조직 수집 및 전처리
<ol><li>흡입 장치에 연결 된 정 맥을 사용 하 여 인간의 endometrial aspirate의 좋은 품질 생을 얻을. 생 검 포함 된 염 분 및 부드러운 수동 동요와 세척 살 균의 10 mL 술병에 붓으십시오. 참고: 좋은 품질 biopsies을 얻을 하는 방법에 앞에서 설명한17되었습니다.</li>
	<li>워시 모든 나머지 혈액 이나 점액의 생 검. 붓는 조직 깨끗 한 관찰 될 때까지 필요에 따라 여러 가지 신선한 염 분을 포함 하는 플라스 크에 조직 하 여 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>전송의 10 mL를 포함 하는 솔루션으로 건강 한 모습으로 생 검 조각 완료 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 항생제 antimycotic 솔루션 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 매체.</li>
	<li>콘텐츠는 10 cm 배양 접시에에서 부 어 고 조직 scalpels의 한 쌍으로 5-10 m m3 조각으로 잘라.</li>
</ol>2. adenoviral Transfection 자궁내 막 조각
참고: 하는 과정에서가 모든 재료는 후드에 미리 소개 한다. 모든 표 백제와 술병을 과정에서 사용할 수 않을 것을 꺼내. Adenoviral vector의 접촉으로 오는 모든 자료 biohazard 컨테이너에 그것을 삭제 하기 전에 표 백제로 소독 해야 합니다.
<ol><li>일단 생 검 다진 되었습니다, 새로운 배양 접시를 가져가 라. 전체 요리에 걸쳐 확산의 여러 30-50 µ L DMEM 방울 플라스틱 그래서 그들은 접촉으로 오지 않는 방울 사이 충분 한 공간을 남겨 주세요.</li>
	<li>주사기, 중간 상품의 각 내부 조각의 단일 조각 장소에 부착 된 바늘을 왔. 참고: 각 드롭 endometrium의 일체를 포함 해야 합니다.</li>
	<li>광고-mCherry 작업 솔루션 mCherry adenoviral 재고 솔루션 [1 x 1010 pfu/mL]의 1시 20분을 diluting 하 여)로 준비 DMEM 매체 (DMEM + 10 %FBS 필터링) 항생제 없이.</li>
	<li>100-200 μ 조각 페 트리 접시 방울 (2.2 단계)에서 사용할 수 있는 많은 웰 스 작성 96 잘 접시에 잘 당 광고 mCherry 솔루션의 분배. 또한, 부정적인 컨트롤 아 데 노 바이러스 무료 DMEM 매체와 적어도 3 웰 스 작성.</li>
	<li>바늘 주사 통, 페 트리 접시 (단계 2.2)에서 파편의 각각 96 잘 접시에 광고-mCherry 솔루션을 포함 하는 우물의 각 전송에 연결 된 주 었.</li>
	<li>16 h 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 광고 mCherry 솔루션 자궁내 막 조각 포함 96 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>조직 완전 한 DMEM 매체 가득한 새로운 96 잘 접시에 전송 하 여 매체에 나머지 adenoviruses 밖으로 세척 (항생제-antimycotics, 무료 아 데 노 바이러스의)와 5% CO2 24-48 h 37 ° C에 품 어. 참고: 모든 잘 접시와 생물 학적 컨테이너로 삭제 전에 광고 바이러스 접촉 온 팁 표 백제와 커버 기억 하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 꺼내 고 568에 형광 현미경 nm (빨강 채널) 최적의 라벨에 대 한 테스트.</li>
	<li>가장 화려한 조각을 선택 하 고 신선한 완전 한 DMEM 매체와 새로운 96 잘 접시에 그들을 배치 (항생제-antimycotics, 무료 아 데 노 바이러스의).</li>
	<li>플라스틱 파라핀 영화와 잘 접시를 봉인 하 고 받는 사람 동물에 자궁내 막 조각 이식에 대 한 특정 병원 체 자유로운 동물 영역에 그것을 수송.</li>
</ol>3입니다. 자궁내 막 증 마우스 모델의 생성
참고: 6-8 주를 사용 하 여-오래 된 athymic 누드 (또는 유사한 immunocompromised 긴장) 특정 병원 체-무료 조건, 받는 사람 동물에 여성 쥐. 호르몬 주기 의존적인 변화와 동시에 연료 병 변 estradiol 성장을 피하려고 동물은 17 βeta-Estradiol (17β-E2)의 18 mg를 포함 하는 ovariectomized와 배치 60 일 릴리스 캡슐. Oophorectomy 및 펠 릿 배치 받는 사람 동물에 자궁내 막 조각 이식에 앞서 1 주일 이상 수행 해야 합니다.
<ol><li>
Oophorectomy 참고: 후드에 외과 살 균된 물자를 준비 합니다. 마 취 장비와 같은 방에 준비 후 수술 복구 영역을 준비 합니다.<ol>
<li>마우스 당 5 mg/kg의 복용량에 모 르 핀 유도체의 피하 주사를 수행 합니다. 그래서 약물의 효과 수 있습니다 각 성 진통제로 주사 후 30 분 동안 휴식 하는 쥐를 보자.</li>
		<li>봉인 된 마 취 실로 흡입 마 취 장비 및 하자 산소와 isoflurane (2 %mg / kg) 흐름 몇 분을 연결 합니다.</li>
		<li>Isoflurane 마 취 챔버로 동물을 소개 합니다. 3-5 분을 기다립니다 고 동물의 발 중 하나를 눌러 완전히 취는 확인 합니다. 동물 수술 영역을 전송 하 고 호흡 기도 덮고 isoflurane 가스의 연속 흐름으로 마스크를 배치 하 여 마 취를 유지.</li>
		<li>Chlorohexidine 지역, 소독 후 날카로운가 위 엉덩이의 높이에 약 가로 0.5 cm 늑 골 절을 수행 합니다.</li>
		<li>복 부 구멍에 접근할 수, 난소를 둘러싸는 흰색 지방 패드를 식별 해 부 집게로 난소를 제거 하는 근육에서 피부를 구분 합니다.</li>
		<li>흡수 봉합과 수 란 관 주위 매듭 하 고 난소를 절 개 하기 전에 적절 한 hemostasis 되도록 그것을 조이십시오.</li>
		<li>6-0 흡수 봉합 사, 근육 레이어 닫고 6-0 비 흡수 봉합 사를 피부를 닫습니다. 살 균 솔루션으로 다시 영역을 청소.</li>
		<li>콘트라 측면 난소를 제거 하는 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estradiol 작은 임 플 란 트 참고: 동물 장소 알 약을 그 시점에서 oophorectomy 수술 중 마 취는 주의.<ol>
<li>Oophorectomy 절차 완료 후 즉시 목 주변 살 균 솔루션으로 피부를 깨끗 하 고 날카로운가 위를 목 덜 미에 가로 피하 작은 (0.5 cm) 절 개를 하 게.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 알 약을 배치 수 있도록 충분히 큰 주머니를 만드는 근육에서 피부를 해 부.</li>
		<li>17β-E2 의 18 mg를 포함 하는 펠 릿 넣고 6-0 비 흡수 봉합 사를 피부를 봉합 합니다. 살 균 솔루션으로 다시 영역을 청소.</li>
		<li>복구 영역에 동물을 배치 하 고 회복 기간을 쉽게 하기 위해 오랫동안 진통의 최적 복용량을 관리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
자 궁 이식 수술 참고: 적어도 7 일 후 자궁내 막 조각 이식 수술을 시작 하기 전에 oophorectomy 동물의 전체 복구를 허용 하도록 격리 기간 허용. 최적의 동기화 조직의 라벨, 수집 생 검 explants의 장기 문화를 피하기 위해 이식 수술 전에 2-3 일.<ol>
<li>특정 병원 체 무료 영역에 수술 방을 얻을 사전에 준비. 또한 모든 필요한 수술 재료, 마 취 장비와 수술 후 복구 영역으로 후드를 준비 합니다.</li>
		<li>동물을가지고, 각 마우스에서 5 (mg/kg)의 복용량에 모 르 핀 유도체의 피하 주사를 수행 합니다. 진통제 효과 약물의 각 성 수 있습니다 그래서 주사 후 30 분 동안 휴식 하는 쥐를 보자.</li>
		<li>봉인 된 마 취 실로 흡입 마 취 장비 및 하자 산소와 isoflurane (2 %mg / kg) 흐름 몇 분을 연결 합니다.</li>
		<li>수술 시작 하기 전에 붙일 포함 된 플레이트 후드에 (2.10 단계)에서 조각을 분류 그것의 봉인을 해제 하 고 조각을 쉽게 처리를 위한 페 트리 접시에 부 어 이동 합니다.</li>
		<li>Isoflurane 마 취 챔버로 동물을 소개 합니다. 3-5 분을 기다립니다 고 동물의 발 중 하나를 눌러 완전히 취는 확인 합니다. 동물 수술 영역을 전송 하 고 호흡 기도 덮고 isoflurane 가스의 연속 흐름으로 마스크를 배치 하 여 마 취를 유지.</li>
		<li>장소 마 취 동물 얼굴. 치료 복 부 지역. 날카로운가 위 복 부에 세로 1.5 c m 절 개를 수행 하 고 근육에서 피부를 분리. 다음, 복 막 구멍에 액세스 하려면 근육에 경도 1.5 c m 절 개를 수행 합니다.</li>
		<li>미니 집게와 복 부 근육 벽의 왼쪽된 가장자리를 누른 외부에 복 막의 내부 얼굴 노출 하려고 그것을 접어.</li>
		<li>미니 족집게는 자궁내 이식가지고, n-부 틸 에스테 르 cyanoacrylate 접착제에 잠시 담가 연결 얻을 것 이다 있는 복 막에 넣습니다. 몇 초 동안 건조 하자. 3.3.6-3.3.7 복의 contralateral 측에는 임 플 란 트를 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>근육 레이어 흡수 6-0 봉합 사를 닫고 6-0 봉합 비 흡수로 피부를 닫습니다. 살 균 솔루션으로 다시 영역을 청소.</li>
		<li>복구 영역에 동물을 놓고 오랫동안 진통의 최적 복용량을 관리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 생체 내 이미징 시스템에 비보와 형광 이미징에
<ol><li>Vivo에서 이미징 시스템 장치, 프로그램 초기화 켜고 몇 분 동안 냉각 CCD 카메라를 허용.</li>
	<li>흡입 마 취 장비를 준비 합니다. 마 취 챔버를 채우기 위해 분의 몇 가지에 대 한 2%에서 isoflurane 흐름을 엽니다. 마 취 후 복구 영역을 준비 합니다.</li>
	<li>일단 프로그램 시작 하 고 냉각 CCD 카메라, 이미징 마법사 도구를 클릭: 자습서를 일련의 연속 창 표시로 시작, 각자의 여러 매개 변수에 해당 하는 선택 될 수 옵션 여 해당 하는 상자에서 클릭 합니다. 각 창에서 해당 상자를 선택 하 여 자습서를 통해 앞으로 이동 하 고 매개 변수 다음 시퀀스를 다음 설정으로 이동 하 고 확인 버튼을 클릭 합니다.<ol>
<li>형광 매개 변수에 대 한 Epiluminescence 상자 선택, 필터 쌍 매개 변수에 대 한 mCherry 상자 를 선택 합니다. 사진 모드와 초점 확인 확인란을 선택 하 고 노출 매개 변수에 대 한 자동 상자를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 악기 설정 되었습니다, 챔버 내부에 마 취 한 동물을 이동 합니다. 완전히 마 취는 vivo에서 이미징 시스템 케이지 안에 동물을 전송 하 고 마 취 기계에 연결 된 관 안에 그것의 머리를 측면 배치. 뚜껑 닫고 모니터링에 대 한 취득 을 클릭 합니다.</li>
	<li>이미지 (총 5 개의 이미지를 선택 하는 필터의 각 쌍에 대 한 이미지)를 표시 하 고 다른 이름으로 저장 단추를 클릭 하 여 데이터를 저장 합니다. 후 마 취 회복의 영역에 마우스를 이동 합니다. 나머지 동물을 가진 과정을 반복 합니다.</li>
	<li>2 모니터링을 반복 하거나 3 번 주 후속 신호를 적절 하 게 시간 과정.</li>
	<li>CO2 질 시간 과정의 끝에서 동물 희생을 진행 합니다.</li>
</ol>5. 형광 이미지 Vivo에서 의 정량화
<ol><li>
이미지 unmixing 통해 실제 형광의 분리:
	<ol>
<li> Vivo에서 이미징 분석 소프트웨어 프로그램을 결합하는 엽니다.</li>
		<li>분석을 시작 하기 위해 "Sequenceinfo" 파일을 선택 합니다. 두 개의 창이 표시 됩니다: "시퀀스 보기" 및 "도구 팔레트". 도구 팔레트 를 선택 하 고 다음 옵션을 선택 하는 메뉴를 표시.</li>
		<li>수정 선택한 적응형 플로리다 배경 빼기 발광 이미지 데이터에서 바람직하지 않은 형광 신호를 제거 하려면 상자를 클릭 합니다. 가장 큰 관심의 임계값을 선택 하 고 설정을 클릭 합니다.</li>
		<li>스펙트럼 Unmixing관심, unmixing (도서관, 가이드, 자동 또는 수동)에 대 한 선택 방법의 파장 선택한 다음 시작 Unmix를 클릭 합니다.</li>
		<li>MCherry 신호에 해당 Unmixed 이미지를 선택 하 고 더블 클릭. 새 창 관심의 신호의 최종 이미지와 함께 표시 됩니다.</li>
		<li>5.1.3 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>선택 사항: unmix 결과의 대표 이미지 (JPEG) 필요한 경우, 도구 팔레트에서에서 원하는 설정을 선택 | 이미지 조정 (색상 테이블, 범주화, 대비, 등.), 다음 현재 이미지 보기를 이미지로 내보내려면 내보낼 그래픽 unmix 창에서 클릭 하십시오.</li>
		<li>순수한 파일 저장: 파일 | 다른 이름으로 저장 | 폴더 선택 및 확인.</li>
		<li>프로세스 모니터링 일의 나머지와 모든 동물 들과 함께 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ROIs를 설정 하 고 정량화 신호
	<ol>
<li>찾아보기 를 클릭 하 고 순수한 파일 선택 (단계 5.1.8 참조)의 분석. 새 창이 나타납니다.</li>
		<li>모든 순수한 파일 다른 시간 지점에서 각 동물을 포함 한 부하로 A 그룹에 다음 클릭 합니다 목록에 추가 클릭 합니다. 모든 이미지는 단일 시퀀스로 표시 되어야 합니다.</li>
		<li>도구 팔레트 윈도우를 이동: 나 같은 규모에 모든 이미지를ndividual 규모는 상자에서 클릭.</li>
		<li>시퀀스의 한 이미지에서 두 번 클릭 하 고 다음 시퀀스를 사용 하 여 관심의 영역에는 투자 수익을 만듭니다. ROI 도구 고 Countour 및 자동 1 옵션 선택, 나타나는 동그라미 모양 클릭, 형광 신호 센터에 배치 이동한 표시 창에서 만들기 를 클릭 합니다. 참고:이 자동으로 배경 값 (즉, 병 변) 위의 형광의 강도 가진 픽셀 하이라이트와 그 지역 포용 개요 픽셀 모양 생성.</li>
		<li>만든된 투자 수익 형태를 복사 및 붙여넣기 배경 영역에 있는 신호.</li>
		<li>측정 ROIs 클릭 | 모두 선택 형광 강도의 값을 표시 하려면. 마우스로 데이터 값을 선택, 오른쪽 버튼을 클릭, 복사 누르고 스프레드시트에 붙여넣기를 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 데이터 (형광 신호) 정규화
<ol><li>신호 강도 최대한 초기 시간 지점을 선택 합니다. 수식을 사용 하 여 각 시간 지점에서 신호를 정상화 하십시오. 각 시간 지점에서 강도 신호 / 최대 신호 강도 관찰 시간 과정) x 100.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 상세한 프로토콜 있는 이식 병 변 아키텍처의 아키텍처는 보존 방출 동시에 실시간으로 형광의 평가 허용 하는 동안 mCherry에 의해 하는 자궁내 막의 동물 모델의 구현을 설명 합니다. 자궁내 막 조직 표시. 이 프로토콜에서 우리는 특정 vivo에서 이미징 시스템 및 비 접촉 레이블이 지정 된 병 변에서 방출 되는 형광을 평가 하기 위해 관련된 소프트웨어의 사용을 설명 합니다. 각 사용자는 특정 이미징 장치 및 관련된 소프트웨어를 그들의 교육 기관에서 사용할 수에 따라 프로토콜을 적응 해야. 모니터링 통해 vivo에서 이미징 시스템 결합 isoflurane 가스 마 취 기계 마 취 동물에 수행 됩니다. 상처에 의해 방출 된 자동 형광 간섭을 유발 하지 않도록, 모니터링 장애 형광 이식 수술 후 적어도 3 일을 시작 하는 것이 좋습니다.
여기 표시 된 것과 비슷한 자궁내 막의 분리 마우스 모델 있다 이전 설명 녹색 형광 단백질 (GFP)18</...

자궁내 막 증은 자 궁 구멍 밖에 기능 endometrium의 주입에 의해 시작 만성 부인과 질환 이다. 소성 병 변은 성장 하 고 만성 골반 통증 및 불 임1선도 하는 염증 성 프로세스를 유도. 그것은 그를 생식 연령 여성의 10-15%에 영향을 받는 endometriosis2, 추정 이며 불 임 여성3의 약 40-50%에 존재. 자궁내 막 증에 대 한 현재 약물 치료 장애를 완전히 근절 수 없습니다 있으며 부작용4,5의 자유로운. 보다 효율적인 치료에 대 한 연구는 인간의 병 변 적절 하 게 유사 수 있습니다, 그리고 다른 사람의 사이에서 병 변 크기에 화합물의 효과 밀접 하 게 평가 될 수 있다 그런 방법으로 자궁내 막의 기존 동물 모델의 구체화의 필요 합니다.
영장류 모델 이식 소성 병 변의 조직학 동일 여 고 인간6,,78;에서 비슷한 사이트에서 궁을 모방 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 윤리적 우려와 높은 경제 비용 관련 영장류도 실험 그들의 사용9. 따라서, 궁의 비보에 모델의 구현에 대 한 작은 동물, 특히 설치류를 사용 하 여 개인10,11의 더 큰 숫자와 함께 연구 수 있습니다 선호 하 고 있습니다. 궁 쥐 자 궁 뿔 ("동종 모델")12,13 의 조각 또는 소성 사이트 (분리 모델) 인간의 궁/endometriotic 조직을 이식 하 여이 동물에서 유도 될 수 있다14 . 인간, 달리 설치류 그들의 자궁내 막 조직 창 고 하지 않습니다 그리고 그로 인하여 궁 수 개발 되지 않을 자발적으로 이러한 수 종에. 따라서, 동종 마우스 사실은 소성 마우스 자 궁 조직 이식 모델 궁의 강평 되었다 인간 endometriotic 병 변15의 특성을 반영 하지 않습니다.
자궁내 막 증의 적절 한 생리학 신선한 인간의 자궁내 막 조각 immunodeficient 동물에 이식 되는 궁의 분리 모델에 유사 수 있습니다. 기존의 분리 모델, 관심의 화합물의 치료 효과 일반적으로 끝점 캘리퍼스16의 사용으로 병 변 크기의 평가 의해 평가 됩니다. 분명 한계는, 따라서, 끝점 동물 모델을 허용 하지 않습니다 이식 역학 또는 시간이 지남에 endometriotic 병 변 개발 공부 이다. 추가 한계는 캘리퍼스를 사용 하 여 병 변 크기의 정확한 측정을 허용 하지 않는다는 것 이다. 실제로, 캘리퍼스에서 제공 하는 표준 오차에 따라서 크기에 실제 변화를 감지 하는 이러한 도구의 용량을 제한 하는 마우스에 이식 하는 병 변의 크기와 같은 범위 (예: 밀리미터)입니다.
이러한 한계를 극복 하기 위해 여기, 우리 기자 m-체리 형광 단백질을 표현 하 이식된 인간 조직 설계는 궁의 분리 마우스 모델의 생성을 설명 합니다. 적절 한 이미지 시스템으로 형광 신호 검출 실시간으로 그것의 크기의 동시 정량화와 병 변 상태 모니터링 비-침략 적 있습니다. 따라서, 우리의 모델에는 병 변 크기에 더 객관적이 고 변이의 정확한 평가 수행 하기 위해 실시간 비-침략 적 모니터링의 기회와 가능성을 제공로 서 기존의 끝점 모델에 비해 명확한 이점을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>엔도샘플러&트레이드;</td><td>Medgyn</td><td>22720</td><td>캐뉼러: 자궁 자궁 내막</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>VWR</td> HYCLSH30285 샘플링을 위한 캐뉼라<td>. FS</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>Vector Biolabs</td><td>1767</td><td>Adenoviral vector expressing mCherry</td></tr><tr><td>PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4</td><td>VWR</td><td>E504-500ML</td><td>버퍼 for washes</td></tr><tr><td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days</td><td>Innovative Research of America</td><td>SE-121</td><td>Hormone pellets for lots lots</td></tr><tr><td>lots Vetbond&trade; 조직 접착제</td><td>3M</td><td>780-680</td><td>조직 접착제</td></tr><tr><td>폴리스티렌 크리스탈의 페트리 접시</td><td>레반티나</td><td>367-P101VR20</td><td>페트리 접시</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333-100ML</td><td>항생제</td></tr><tr><td>주사기, 의료 10 mL 0.5 ml</td><td>VWR</td><td>CODA626616</td><td>주사기</td></tr><tr><td>니트릴 장갑, 파우더 프리</td><td>VWR</td><td>112-2754</td><td>장갑</td></tr><tr><td>동물 실험을 위한</td> <td>연약한 스위스 누드 쥐</td><td>찰스 강</td><td>SNUSSFE05S</td> 쥐</tr><tr><td>Ivis 스펙트럼 생체 내 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>생체 내 모니터링 장비</td></tr><tr><td>Living Image&reg; (아이비스 소프트웨어)</td><td>Perkin Elmer</td><td>---</td><td>생체 내 모니터링 소프트웨어</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Enrichment serum</td></tr><tr><td>96-well cell culture treated plates</td><td>Life technologies</td><td>167008</td><td>Culture plates</td></tr><tr><td>Urine plasks</td><td>Summedical</td><td>4004-248-001</td><td>세척용 플라스크</td></tr><tr><td>멸균 수술용 칼날</td><td>(Aesculap Division) Sanycare</td><td>1609022-0008</td><td>수술용 칼날</td></tr><tr><td>Isovet 1,000 mg/g</td><td>B-BRAUN</td><td></td>---<td>Isoflurane (마취제)</td></tr><tr><td>Buprex&reg; 0.3 mg</td><td>Schering Plough S.A.</td><td>---</td><td>부프레노르핀 (진통제)</td></tr><tr><td>주사 가능한 모르핀 용액 10 mg/mL</td><td>B BRAUN</td><td></td>---<td>모르핀 (진통제 용액)</td></tr><tr><td>모노필&reg; 흡수성 봉합</td>사 <td>COVIDIEN</td><td>---</td><td>봉합사</td></tr><tr><td>Desinclor chlorhexidine</td><td>Promedic SA</td><td></td>---<td>Antiseptic solution</td></tr><tr><td>Microscopy DMi8</td><td>Leica Mycrosystems</td><td>---</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Hera Cell 150 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026282</td><td>인큐베이터</td></tr></tbody></table>

궁의 분리 마우스 모델에서 병 변 크기의 비 침 투 적인 모니터링

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

여기, 우리는 자궁내 막 증의 진행은 이식된 소성 인간의 자궁내 막 조직에 의해 방출 하는 형광의 비 침 투 적인 모니터링을 통해 실시간으로에서 평가 될 수 있다 분리 마우스 모델의 구현에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해 인간의 endometrium의 biopsies 기증자 여성의 지속적인 oocyte 기부에서 얻을 수 있습니다. 인간의 자궁내 막 조각 기자 형광 단백질 mCherry에 대 한 표현 cDNA를 설계 adenoviruses 존재 교양. 시각화, 시 감염 이후에 받는 사람 마우스에 이식에 대 한 선택 후 조직 형광의 최적의 속도 표시 합니다. 이식 수술 전에 1 주 받는 사람 마우스 oophorectomized는 고 estradiol 펠 릿은 피하 장애의 성장과 생존을 유지 하기 위해 됩니다. 수술 당일에 마우스는 교육-알바. 소형 (1.5 cm) 절 개를 통해 액세스 하는 마 취, 그리고 복 막 구멍 붙일 레이블된 임 플 란 트 tweezed, 짧게 접착제에 배어 있으며 복 층에 연결 된. 절 개 봉합은, 그리고 동물 며칠에 대 한 복구. Endometriotic 임 플 란 트에 의해 방출 하는 형광은 보통이 아닌 접촉 vivo에서 이미징 시스템으로 4 주 동안 3 일 마다 모니터링 됩니다. Endometriotic 임 플 란 트의 크기에서 유사 mCherry 신호 및 최대 형광 강도 보여주는 초기 시간 포인트에 대 한 정규화의 정량화 하 여 실시간으로 추정 될 수 있습니다.
궁의 모델의 전통적인 전 임상 설치류의 실시간으로 병 변 비-침략 적 모니터링을 허용 하지 않습니다 하지만 오히려 끝 지점에서 분석 하는 약물의 효과의 평가 허용. 이 프로토콜 실시간으로 병 변을 추적 하 수 하며 궁의 전 임상 모델에서 약물의 치료 가능성에 더 유용 합니다. 따라서 생성 된 모델의 주요 제한은 비-침략 적 모니터링은 불가능 episomal 표현의 광고 바이러스 시간이 오랜 기간 동안입니다.

여기, 우리 비-침략 적 되므로 자궁내 막 증 병 변의 건축 immunocompromised 마우스에 붙일 레이블된 조각의 인간의 endometrium 이식 하 여 보존의 분리 모델을 만들기 위한 과정을 설명 병 변 진행의 모니터링. 자궁내 막 조각 레이블 명시적 mCherry, 가까운 적외선 영역에서 형광을 방출 하는 단백질을 설계 하는 아 데 노 바이러스와 감염에 의해 달성 된다. 그림 1에서 우리는 대표 이미지 광고 mCherry 감염 하는 인간의 자궁내 막 조각의 형광 현미경 관찰을 보여줍니다. 설명의 목적에 대 한 표시와 비 표시 조각 형광 감염 되 고 감염 되지 않은 조직 (autofluorescence) 사이에서 차이 지적 수 있도록 포함 되어 있습니다. MCherry에 대 한 참조 파장 이외에 모니터링 하는 동안 형광 이미지 여기/방출 파장 필터 (그림 2</stro...

여기, 선물이 붙일 레이블된 인간의 자궁내 막 조각 쥐에 투입의 라이브 이미징에 대 한 프로토콜. 메서드를 모니터링을 통해 endometriotic 병 변 크기에 선택의 약의 효과 실시간으로 형광 기자에 의해 방출 되는 형광의 정량화를 공부 하 고 수 있습니다.

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

이 방법은 자궁 내막증 병변의 크기에 항 안드로겐 화합물의 효과와 같은 자궁 내막증 분야에서 치료 약물 효과를 평가하는 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 약물의 효과가 종점보다는 실시간으로 자궁 내막증의 동물 모델에서 평가 될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자인 제시카 마르티네즈뿐만 아니라 센트로 드 Investigacion Principe 펠리페의 수의사이며 우리 팀과 긴밀한 협력자인 비비아나 비스발과 네레아 마린이 될 것입니다.임플란트 수술 2~3일 전에, 완전한 배지를 함유한 10센티미터 페트리 접시로 헹구고 건강한 자궁내막 조직 생검 조각을 옮기고, 메스를 사용하여 조직을 5~10mm 의 큐브 조각으로 다진다. 마이크로파이프를 사용하여 새로운 10센티미터 배양 접시 바닥에 30~50마이크로리터 방울을 추가하여 각 방울 사이에 충분한 공간을 남겨두어 서로 접촉하지 않습니다. 모든 방울이 놓였을 때 주사기 바늘을 사용하여 생검 조직 단편을 각 방울에 배치하십시오.다음으로, 100~200마이크로리터의 갓 준비된 아데노-mCherry를 조직 단편당 96개의 웰 플레이트에 추가하고, 아데노바이러스가 없는 DMEM을 음의 대조군으로 3개의 우물에 추가합니다. 그런 다음 바늘을 사용하여 1개의 조직 샘플을 아데노-mCherry 용액의 각 우물로 전송하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 하룻밤 배양을 합니다. 다음 아침, 형광 현미경 단계에 플레이트를 놓고 568 나노미터 레이저를 사용하여 최적의 라벨링을 위해 조각을 확인합니다.감염mCherry 아데노 바이러스의 적절 한 희석을 사용 하 여 조직의 효율적인 라벨에 대 한 열쇠. 따라서 적절한 농도를 결정하기 위해, mCherry 희석을 위한 몇몇은, 각 개별 실험에 대해, 평가되어야 한다. 그런 다음 신선하고 완전한 매체를 포함하는 새로운 96 웰 플레이트의 개별 우물로 가장 화려한 조각을 옮킨다.난미 절제술 후 적어도 7 일, 페트리 접시에 자궁 내막 조직 조각을 데산, 마취, 전모 동물에 발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인합니다. 마우스를 supine 위치에 있는 것은 복부 부위를 소독하고 복부에 있는 1.5 센티미터 세로 절개를 합니다. 근육에서 피부를 분리 하 고 복 막 구멍에 액세스 하는 근육에 두 번째 1.5 센티미터 절개를.복부 근육 벽의 왼쪽 가장자리를 미니 집게로 잡고 근육을

noninvasive-monitoring-lesion-size-heterologous-mouse-model

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

장 장간막의 동맥 계단식으로 자궁 조직의 자동 이식에 의한 마우스 및 쥐에 endometriosis의 수술 유도의 설명입니다.

자궁의 자동 이식하여 수술 유발 Endometriosis의 마우스 모델

우리는 난소암의 성장과 재발을 감지, 정량화 및 모니터링할 수 있는 비침습적 동물 이미징 플랫폼을 설명합니다. 이 복막내 이종이식 모델은 난소암 환자의 임상 프로필을 모방합니다.

비 침습적 영상에 대한 생쥐 모델 검색 및 모니터 난소 암 재발

우리는 단단한 내시경을 사용하여 마우스의 결장 병리학 치료를 위한 치료제의 효능을 종단적으로 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 살아있는 마우스에서 개별 종양의 치료 반응을 특성화하고 잠재적인 질병 재발을 모니터링하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다.

라이브 마우스의 직렬 내시경 이미징을 사용하여 소장 병변에 대한 새로운 치료제의 효능의 비 침습적 평가

난소암 전이는 수많은 미만성 복강 내 병변을 특징으로 하기 때문에 종양 부담을 시각적으로 정확하게 정량화하는 것이 어렵습니다.  여기에서는 적색 형광 단백질(RFP) 표지 종양 세포 및 광학 이미징을 사용하여 전이성 종양 부담의 현장 및 생체 외 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

복강 내 난소 암 전이의 정량

자궁내막증의 많은 설치류 모델은 기술적 복잡성, 재현성 및/또는 면역 손상된 동물 또는 특수 리포터 마우스에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 우리는 독립적으로 검증 가능하고 객관적인 점수 매기기 시스템을 갖춘 실험용 마우스를 사용하여 병변 유도의 단순화 된 시스템을 제시하며, 난소 절제술 이나 생존 수술에 대한 요구 사항이 없습니다.

자연적으로 사이클링 마우스를 사용하는 자궁내막증의 신제닉 뮤린 모델

이 프로토콜은 전체 및 조직학적 변화와 상관관계가 있는 초음파 영상을 사용하여 자궁내막암의 유도성 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 형태학적 변화의 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

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배우세요 자궁내막증 마우스 모델에서 형광 표지된 인간 자궁내막 조각의 실시간 라이브 이미징을 통한 비침습적 병변 크기 모니터링 방법. 이 기술은 약물 효과를 실시간으로 평가하여 치료 전략 개선에 기여합니다.

궁의 분리 마우스 모델에서 병 변 크기의 비 침 투 적인 모니터링

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