Name: 암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 학습하세요 하이드로겔 마이크로챔버 어레이를 사용한 3D 종양 스페로이드 침입 분석 방법으로 항전이 약물 스크리닝을 수행합니다. 이 기술은 균일한 스페로이드 대량 생산과 지속적 모니터링이 가능하여 정확한 단일 요소 해상도 분석을 제공합니다.

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1. HMCA 플레이트 엠보싱
참고: 완전 한 프로세스 설계 및 제조입니다 (PDMS) 스탬프 및 HMCA 이미징 플레이트가이 프로토콜에 사용에 대 한 우리의 이전 기사15,16에 자세하게 설명 되어 있습니다. PDMS 스탬프 (부정적인 모양)는 잘 (그림 1A) 당 약 450 MCs를 이루어져 있는 HMCA (긍정적인 모양)을 돋을새김 하는 데 사용 됩니다. 그림 1B에서처럼 MCs의 마다 잘린된 거꾸로 사각형 모양의 피라미드의 모양 (높이: 190 µ m, 작은 기본 영역: 90 µ m x 90 µ m, 그리고 큰 기본 영역: 370 µ m x 370 µ m). HMCA 판 준비 및 3D 종양 spheroids의 배양과 그 후, 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 또는, 상업 스탬프 HMCA 생산 사용 될 수 있습니다.
<ol><li>6% 낮은 녹는 agarose (LMA)의 솔루션을 준비 합니다. LMA 분말 및 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) PBS의 10 mL 당 LMA (0.6 g) 유리 병에는 자력으로 삽입 합니다. 난방 접시에 병을 배치 하 고 균일 한 솔루션 달성 될 때까지 몇 시간 동안 80 ° C에가 열 하는 동안 솔루션을 저 어. 70 ° C에서 솔루션을 계속 사용까지.</li>
	<li>미리 70 ° c 오븐에서 PDMS 스탬프 열. 그것은 따뜻한까지 계속 사용. 또는 상업 스탬프 사용 하 고 지시를 따르십시오.</li>
	<li>미리 75 ° c가 열 건조 목욕 상업 6 잘 유리 하단 플레이트 위에 접시는 완전히 따뜻한 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	<li>접시에 우물의 각자의 유리 하단에 미리가 열된 LMA (400 µ L) 한 방울을 붓는 다. 부드럽게 agarose 드롭 사전 온수 PDMS 스탬프 장소. 중 고 및 사전 냉각에 대 한 5-10 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어. 전체 agarose 겔 화를 달성 하기 위해 20 분에 4 ° C에서 품 어. 그런 다음, 부드럽게 mcs 꽃무늬 agarose 젤 떠나 PDMS를 벗기십시오. 참고:이 단계는 동시에 모든 웰 스에서 수행 됩니다.</li>
	<li>자외선 (UV) 램프를 장착 하는 시스템을 치료 하는 빛에 양각된 접시를 놓고 3 분 동안 품 어. 참고: 지금 HMCA 플레이트는 UV 살 균입니다.</li>
	<li>되도록 그들은 습 한, 지켜진다 다음 접시 커버, parafilm 포장 사용까지 4 ° C에서 저장 살 균 PBS로 매크로 웰 스를 채우십시오.</li>
	<li>사용 하기 전에 빈 HMCA 접시에서 PBS 오차. 생물 학적 후드에 배치.</li>
</ol>2. 로드 셀 및 회전 타원 체 형성
<ol><li>다음과 같이 셀을 수집: 10 cm 문화 접시 셀 단층에서 모든 매체를 제거, 혈 청 오차의 처리, 트립 신 (37 ° C에 미리 예 열)의 5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 3 분 동안 품 어에 PBS의 10 mL로 두 번 씻어 그런 다음 접시 단층 분리, 동종 세포 현 탁 액 달성 될 때까지 완전 한 매체 (37 ° C에 미리 예 열)와 여기저기 피 펫의 10 mL를 추가를 부드럽게 흔들어. 원심 신선한 매체의 15 mL로 세포 현 탁 액을 씻어 그리고, 신선한 완전 한 매체에 적절 한 농도에서 일시 중단.</li>
	<li>부드럽게 로드 셀 서 스 펜 션 (50 µ L, 매체, 103 셀/mL x 150-360 ~ 16-40 MC 당 세포)는 HMCA의 위에 허용 15 분 동안 중력에 의해 침전 하는 세포.</li>
	<li>부드럽게 외부 링과 히드로 배열 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 500 µ L 신선한 매체 (총 3-4 mL)의 6-8 aliquots를 추가 합니다.</li>
	<li>72 h에 대 한 HeLa 세포와 spheroids의 대형을 위한 습도 분위기에서 37 ° C, 5% CO2, 48 h에 대 한 MCF7 세포를 품 어.</li>
</ol>3. 생존 Propidium 요오드 화물 (PI) 얼룩에 의해 검출
<ol><li>PI의 재고 솔루션을 준비 (500 µ g PI의 PBS의 1 mL 당). 4 ° C에서 약 6 개월 동안 그것을 유지. 갓 6 잘 HMCA 플레이트 (2 mL 잘 당)에 대 한 페 놀 레드, 없이 완전 한 매체의 12 mL 재고의 6 µ L의 추가 의해 1:2,000 (0.25 µ g/mL), 희석을 준비 합니다.</li>
	<li>생물 학적 후드에 인큐베이터에서 48-72 h spheroids와 HMCA 접시를 전송 합니다. 팁 끝 히드로 배열 옆에 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 기대 여는 HMCA에서 모든 매체를 제거, 매체 가득한 배열 탱크를 떠나.</li>
	<li>부드럽게 PI 희석의 2 mL 단계 3.1에서 각 잘 하 여 추가 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기에서 1 h HMCA 접시를 품 어. 7 단계로 계속. 참고: 다른 염료 사용할 수 여기 뿐만 아니라, 예: 핵 얼룩에 Hoechst 얼룩, fluorescein diacetate (FDA) 라이브 셀 검출, apoptosis Annexin V에 대 한 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 대 한 tetramethylrhodamine 메 틸 에스테 르 (TMRM) 탐지 그리고 다른 사람입니다.</li>
</ol>4. 콜라겐 혼합물 준비
<ol><li>압력솥과 1m NaOH 필터 살 균 솔루션의 100 mL의 주식에 의해 살 균 두 배 증류수 (DDW)을 준비 합니다. RT, 그리고 사용까지-20 ° C에서 냉동 콜라겐 혼합 준비를 위해 사용 하는 팁에 있는 자료를 유지 한다.</li>
	<li>사용 하기 전에 10-20 분 배치 등 모든 intergrades: 살 균 DDW, 1 M NaOH 살 균 솔루션, 메 마른 10 PBS, x 나 완전히 냉각 될 때까지 얼음 양동이에 쥐 꼬리 (3-개월 동안 4 ℃에서 저장)와 무 균 튜브에서 콜라겐을 입력. 생물 학적 후드 안에 얼음 양동이 놓습니다.</li>
	<li>다음과 같이 6 잘 HMCA 침공 분석 결과 플레이트 (잘 당 300 µ L) 1800 µ L 3 mg/mL의 최종 농도에 콜라겐 혼합물의 준비. 다음 순서에 따라 냉각된 튜브에 intergrades를 추가: DDW, 1 M NaOH의 24.8 µ L와 10 x PBS의 180 µ L의 515 µ L. 얼음에 다시 소용돌이 및 장소에 의해 잘 믹스. 마지막으로, 혼합물, 다시 소용돌이에 콜라겐의 1080 µ L을 추가 하 고 다시 얼음에 넣어.</li>
</ol>5. 하 고 콜라겐 혼합물 준비
<ol><li>2 ml의 멸 균 DDW HA의 10 mg을 디졸브. 품 어 RT에서 혼합 몇 분 및 소용돌이 부드럽게 가루 완전히 녹아 때까지. 최대 2 년 동안 4 ° C에서 재고 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>바로 사용 하기 전에 생물 후드 안에 얼음 양동이에 하 재고 솔루션을 놓습니다.</li>
	<li>준비 3 mg/mL 콜라겐 혼합 4 단계에에서 설명 된 대로. 20 µ g/mL의 최종 농도 대 한 콜라겐 혼합물을 사용할 준비가의 1800 μ로 하의 36 µ g (7.2 µ L)를 추가 합니다. 다음, 다시 짧게 소용돌이 그리고 다시 얼음에 넣어.</li>
</ol>6. ECM 혼합물 추가
<ol><li>생물 학적 후드에 인큐베이터에서 48-72 h spheroids와 HMCA 접시를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치. 접시는 냉각 될 때까지 10 분 동안 품 어. 예약에 1%의 솔루션 열 물 욕조에 37 ° C에 LMA.</li>
	<li>하이드로 겔 배열 옆에 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 하 여 HMCA, 주위에서 모든 매체를 제거 합니다. 다음, 매우 신중 하 게, 모든 매체에서에서 제거 배열 탱크 좋은 팁/젤 팁 끝 배열 가장자리, 부드럽게 그리고 천천히 빨 아 밖으로 모든 매체에 기대 여 팁, 로드 합니다. 참고: 히드로 배열 주위에서 모든 매체를 제거 후 배열 탱크 여전히 채워집니다 매체. 이 매체는 히드로 MC의 파괴와 spheroids의 전위를 방지 하기 위해 매우 부드럽게 제거할 수 있다.</li>
	<li>좋은 팁을 미리 냉동 하 고 콜라겐 혼합 (ECM 혼합물) 또는 콜라겐 혼합물의 150 µ L 고 배열 가장자리 끝을 연결 하 여 배열 탱크에 추가. 천천히 회전 타원 체 전위를 피하려고 혼합물을 놓습니다. 잘 당 총 300 µ L에 대 한 150 µ L의 다른 약 수와 함께이 단계를 반복 합니다. 모든 우물 가득 때까지 각 잘 동일한 절차를 따릅니다. 다음 ECM의 전체 겔 화에 대 한 1 시간을 위한 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>ECM의 완전 겔 화 달성 된 후에 미리 데워 진된 1%의 400 µ L 플라스틱 ECM 젤 위에 LMA. 커버는 뚜껑 접시, 접시 RT에 5-7 분 후 agarose 겔 화에 대 한 4 ° C에서 2 분 동안 품 어. 마지막으로, 부드럽게 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 하 여 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 참고: agarose 레이어는 HMCA에서 콜라겐 젤 매트릭스의 분리를 방지합니다.</li>
</ol>7. 침입 분석 결과 수집 및 분석
<ol><li>부하는 동력에 HMCA 플레이트 장착 인큐베이터, 37 ° C, 5% CO2 와 습도 분위기를 미리 조정 된 현미경 단계 반전.</li>
	<li>미리 각 이미지 수집을 위한 위치 전체 배열 영역을 커버 하기 위하여 잘 하 고 10 배 또는 4 X 목표를 사용 하 여 결정 (이 단계는 여기에 사용 되는 이미지 수집 소프트웨어에 대 한 필요, 자세한 내용은 아래의 재료 표 참조). 또는 어떤 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 선택 하 여 전체 필요 면적의 자동 검색을 용이 하 게 하는 "Stich" 옵션.</li>
	<li>취득 밝은 필드 (BF) 이미지 마다 2-4 h 총 24-72 h 동안 주변 ECM에 셀의 침공 회전 타원 체 몸에서 따라 하기.</li>
	<li>(여기 필터 530-550 nm, dichroic 거울 565 nm 긴 패스와 방출 필터 600-660 nm) 전용된 형광 큐브를 사용 하 여 PI 검출을 위한 형광 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어에서 시간 경과 BF/형광 이미지를 내보내고 전용된 폴더를 도구 모음 및 다음 "레코드 파일 내보내기" 버튼의 "데이터베이스" 탭을 사용 하 여 태그 이미지 파일 형식 (TIFF)에 저장. 참고: 우리는 침략에 분석 실행 될 수 있습니다 빠르고 쉽게 디자인 된 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 하는 MATLAB 소프트웨어에서 특별 한 사내 분석 코드를 개발 했다. 이 분석 코드에서는 spheroids 및 내 습 지역 세분화 반자동 형태학 연산자 침식과 팽창 뒤 소블 필터를 사용 하 여 이루어집니다. 자동 분할 영역의 후 정확도 높이기 위해 필요한 수동 수정 되었다. 분할 완료 후 매개 변수 집합이 자동으로 소프트웨어에 의해 계산 되었고 추가 조작에 대 한 excel 파일에 수출. 매개 변수 목록이: 시간에 기본 회전 타원 체 단면적 = 0, 회전 타원 체 몸에 연결 된 셀의 침공 지역 = 주요 내 습 지역, 지역, 주요 내 습 지역에서 분리 된 셀의 셀의 수의 평균 거리, 주요 내 습 지역에서 분리 주요 내 습 지역 및 분리 된 세포 집단 침공 거리 매개 변수의 둘레에는 기본 회전 타원 체의 질량 중심에서에서 침략 = d (d = √ (2 -1X) (X2 + (Y2 -Y1)2)의 밖으로 X와 Y 회전 타원 체의 질량 중심 좌표, 전에 (X1, Y1) 후 (X2, Y2) 집단 침공 과정). 또는, 이미지 분석은 다른 전문된 소프트웨어와 함께 할 수 있었다.</li>
	<li>GUI를 열고 "BF 로드" 버튼을 밀어 합니다. 이미지를 연 후 분할 매개 변수를 조정 (최소 크기: > 1과 반경 닫습니다: > 1) 회전 타원 체 및 그것의 내 습의 정확한 세분화를 위해 다음, 실행에 대 한 "관심 (ROI) 세분화의 영역" 단추를 눌러 및 테두리는 각 회전 타원 체 주위에 표시 됩니다. 자동 분할 올바르지 않으면, "삭제" 또는 "추가" 버튼을 누르고 수동으로 요청한 수정. 다음 이미지에 대 한 동일한 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>번호는 spheroids "추적" 버튼 누르고 소프트웨어 시간 경과 이미지의 각 각 회전 타원 체에 대 한 동일한 번호를 할당 합니다. 그런 다음 모든 매개 변수와 함께 스프레드시트 생성 됩니다 "측정" 버튼을 누릅니다. 결과 처리에 사용 하 고 excel 소프트웨어에서 통계에 대 한 excel 파일로이 스프레드시트를 저장 합니다.</li>
</ol>

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

그것은 잘 문서화 살아있는 유기 체, 그들의 복잡 한 3D 다세포 조직이 특징으로하는 꽤 다른 일반적으로 사용 되 2 차원 단층 배양 세포, 더 나은 기능을 모방 하는 휴대 전화 모델을 사용 하는 중요 한 필요를 강조 그리고 마약에 대 한 생명체의 프로세스 심사. 최근, 다세포 spheroids, organotypic, organoids 문화와 장기 온 칩 도입된8 표준화 된 약물 발견에 사용 되었습니다. 그러나, 3D 다세포 모델의 위대한 복잡성 크게 그것의 견고성, 병렬화 및 분석 결과 효율성에 대 한 중요 한 데이터 분석을 위태롭게.
침공 용량의 정량적 인 평가 일반적으로 히드로 자료를 통해 세포의 움직임을 측정합니다. 전통적인 마이크로-잘 접시를 사용 하 여 종양 침입을 측정, 암 세포의 큰 숫자는 하단 플레이트 라운드에서 시드 고 강제로 원심21,<sup class=...

암 사망은 먼 위치에 전이성 세포의 보급에 주로 기인 합니다. 암 치료에 많은 노력 대상 또는 전이성 식민지의 형성과 조직의 전이성 질환1의 진행 방지에 초점. 암 세포 마이그레이션 종양 전이 과정에서 중요 한 단계 이다, 따라서, 암 침입 캐스케이드의 연구는 매우 중요 하 고 필수 안티 전이성 치료제를 찾는 데는.
전이성 질환 연구 도구로 동물 모델의 사용은 매우 비싼 고 하지 항상 인간의 종양의 대표적인 발견 되었습니다. 또한, 세포 외 microenvironment 토폴로지, 역학 및 구성 강하게 영향을 암 세포 행동2. Vivo에서 모델은 본질적으로 분리 및 암 내 습 및 전이에 공헌 하는 같은 특정 매개 변수를 제어 하는 능력 부족, 이후 제어 생체 모방 체 외에서 모델에 대 한 필요가 있다.
먼 장기에 전이 하기 위해서는 암 세포 치료에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 철새와 침략 phenotypic 특성 전시 한다. 그러나, 때문에 대부분의 시험관에 암 모델 고체 종양3의 실제 기능을 모방 하지 않는, 순수 관련 고기 감지 하 매우 도전 이다. 또한, 종양, 내 존재 하는 phenotypic이 지시 형 감독 요법, 예를 들어, 전이 시작 셀을 대상으로 검색 하려면 단일 요소 해상도 종양 마이그레이션 분석 필요 다른 유형의 종양4내의 인구입니다.
세포 운동 성 및 집단의 연구는 주로 균질 평면 표면에 상피 세포의 단층 문화에서 실시 됩니다. 암 세포 마이그레이션에 대 한 이러한 기존의 셀룰러 모델 막과 ECM의 구성 요소5를 통해 침입 하는 개별 셀의 인구 분석을 기반으로 하지만 이러한 시스템에서 개별 셀 사이의 본질적인 차이점 수 없습니다. 공부. 건설 기계를 통해 또는 비 계 없는 마이크로 구조에서 우수한 종양 연구 수단으로 간주 됩니다 생성 3D spheroids 세포 성장과 암 침공6,,78. 그러나, 가장 3D 시스템은 높은 처리량 형식에 적합 하 고 격리 된 개별 spheroids 각 마이크로 잘9에서 생성 되므로 간 회전 타원 체 상호 작용 달성 일반적으로 수 없습니다. 그러나 암 마이그레이션 관련 된 최근 연구는 미세 장치3,10,,1112에 근거 하,, 이러한 정교한 미세 도구 생산 하기 어려운 고 수 없습니다. 반 침략 적 약물의 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량에 사용할 수 있습니다.
두 가지 주요 고기, 집단 및 개별 셀 마이그레이션, ECM 장벽을 극복 하는 종양 세포에서 역할을 하 고 주변 조직 침입 되어 시연된13,14, 각 고유 표시 형태학 특성, 생화학, 분자 및 유전적 메커니즘입니다. 또한, 두 가지 형태의 마이그레이션 종양 세포, 섬유 아 세포와 같은 및 amoeboid, 각 표현 형에서 관찰 된다. 둘 다, 이후 침공 고기 및 마이그레이션 모드, 주로 형태학 속성에 의해 정의 됩니다, 그리고 휴대에 대 한 필요 모델 그 사용 영상 기반 탐지와 종양 내 습 및 마이그레이션 모든 형태의 시험 세포.
현재 방법의 전반적인 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 체 외에서 세포 기반 시스템을 제공 하는입니다. 여기, 종양 침입과 반대로 전이성 치료의 연구에 대 한 HMCA 기반 6-잘 이미징 플레이트를 소개합니다. 기술은 균일 한 3D 종양 spheroids (우물 당 450) 히드로 마이크로-챔버 (MC) 구조에서 다 수의 형성 수 있습니다. 다양 한 ECM 구성 요소는 주변 환경에 셀의 침공 수 있도록 회전 타원 체 배열에 추가 됩니다. 침공 과정 같은 개별 spheroids/침입 세포의 단기 및 장기 관찰에 의해 지속적으로 모니터링 하 고 형태학 상 특성, 형광 얼룩이 지 고 언제 든 지 특정 spheroids의 검색을 용이 하 게. 수많은 spheroids 공유 공간과 매체, 개별 spheroids와 그들의 영향을 서로 사이 용 해 분자를 통해 상호 작용 가능 하다. 자동 이미지 분석은 많은 양의 데이터 빠르고 효율적 컬렉션을 가능 하 게 사내 MATLAB 코드를 사용 하 여 수행 됩니다. 플랫폼 안티 침공 마약의 중간 처리량 심사 허용 시간 효율적인 방식으로 수많은 spheroids/침입 셀의 정확한, 동시 측정을 쉽게 합니다.

<table><tbody><tr><td>14mm 마이크로 웰 #1.5 커버 유리가 있는 6개의 마이크로 웰 유리 바닥 플레이트</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1.5-N</td><td>HMCA 엠보싱에 사용되는 상업용 유리 바닥 플레이트,</td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>6% 아가로스의 용액은 최대 80°C까지 예열됩니다. C 사용하기 전에 1 % 아가로 스 용액을 37 °C로 가열합니다. C</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 솔루션 B</td><td>생물학 산업</td><td>03-052-1A</td><td>37 &deg로 따뜻한; C 사용 전</td></tr><tr><td>DMEM 매체, 고 포도당</td><td>생물 산업</td><td>01-055-1A</td><td>37 °C로 따뜻한; C 사용 전</td></tr><tr><td>특수 신생아 송아지 혈청 (NBCS)</td> <td>생물학 산업</td><td>04-122-1A</td><td>열 비활성화</td></tr><tr><td>DPBS (10x), 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>생물학 산업</td><td>02-023-5A</td><td>사용 전 얼음에 보관</td></tr><tr><td>NaOH, 무수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td> 쥐 꼬리에서 <td>1 M NaOH 용액</td></tr><tr><td>Cultrex Type I 콜라겐 제조에 사용, 5 mg / mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>사용 전 얼음에 보관</td></tr><tr><td>히알루론산 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>사용 전 얼음에 보관</td></tr><tr><td>피세틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>배양 배지에 추가, 침입 억제제</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>배양 배지에 추가, 산화질소 공여체</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>세척할 필요 없이 매우 낮은 농도에서 사용</td></tr> 다이<tr><td>맥스 5000-EC UV 플러드 램프 라이트 쉴드 및 라이트 쉴드가 있는 전체 시스템 다이맥스 400W EC 전원 공급 장치</td><td>다이맥스 코퍼레이션</td><td>PN 39823</td> UV Inverted IX81 현미경<td>에 의한 HMCA 플레이트 멸균에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>자동 이미지 획득에 사용</td></tr><tr>현미경<td>용 인큐베이터</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>이미지 획득을 통한 타임 랩스 실험에 필수, 37°도로 사전 조정됨; C, 5 % CO2 및 가습 대기 유지</td></tr><tr><td>서브 마이크론 전동 스테이지 타입 SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>이미지 획득 영역을 미리 결정하는 데 사용, 자동 이미지 획득</td></tr><tr><td>14 비트, ORCA II C4742-98 냉각 카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>고감도,</td></tr><tr><td>PI 감지용 형광 필터 큐브</td> 이미징에 사용 <td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>필터 큐브 사양 : 여기 필터 530-550 nm, 이색성 거울 565 nm 장거리 통과 및 방출 필터 600-660 nm</td></tr><tr><td>Olympus Cell^P 운영 소프트웨어</td><td>현미경, 전동 스테이지, 카메라 및 이미지 획득을 제어하는 데 사용되는</td><td>Olympus</td><td></td> 소프트웨어</tr><tr><td>Matlab R2014B 분석 소프트웨어</td><td>Mathworks</td><td></td><td>이미지 분석을 위한 사내 그래픽 사용자 인터페이스를 개발하는 데 사용됩니다</td></tr>. Excel <tr><td>소프트웨어</td><td>Microsoft</td><td></td><td>는 데이터 관리, 계산, 플롯 생성 및 통계에 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (hmca)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

암 전이 암 치의 90% 원인으로 알려져 있다. 전이 인접 조직으로 종양 세포의 침투/침공과는 다단계 프로세스입니다. 따라서, 침략 전이, 매우 중요 한 침공 과정 연구와 반대로 전이성 약물의 개발을 하는 중요 한 단계입니다. 이 수요를 해결 하기 위해 단단한 종양의 구조를 모방 하는 3 차원 생체 외에서 모델을 개발할 필요가 있다 그리고 vivo에서 상태 한 손으로, 하지만 동시에 가장 밀접 하 게 그들의 microenvironment 재현, 강력 하 고 적합 고수익 고 높은 콘텐츠 측정입니다. 현재, 대부분 침공 분석 적절 한 정교한 미세 기술을 의지할 연구 하지만 대량 약물 검사. 각 잘에서 격리 된 개별 spheroids와 플레이트 기반 장치를 사용 하 여 다른 분석 실험 자료 소모 고 조건 당 낮은 샘플 크기. 현재 프로토콜의 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 우리는 종양 침입과 반대로 전이성 신약의 연구에 대 한 HMCA 이미징 플레이트에 따라 침입 분석 결과 대 한 3D 모델을 개발 했다. 이 장치는 지속적으로 하 고 동시에 관찰 하 고 측정 하는 매체에 대 한 단일 요소 해상도에서 spheroids 동안 ECM 구성 요소에 의해 포위 잘 (조건 당 높은 샘플 크기) 당 수많은 균일 한 spheroids의 생산 수 있습니다. 반대로 전이성 약물의 처리량 심사입니다. 이 플랫폼 여기 헬러와 MCF7 예증 단일 셀 및 집단의 침략에 대 한 spheroids의 생산에 의해 제공 됩니다. 우리는 헬러 spheroids 주위의 콜라겐의 침략 적 용량에 ECM 성분 히 알루 론 산 (HA)의 영향을 비교 합니다. 마지막으로, 우리 소개 Fisetin (침공 억제제) 헬러 spheroids 및 산화 질소 (NO) (침공 활성 제) MCF7 spheroids. 결과 다중 매개 변수 검사를 용이 하 게 하는 반자동, 간단 하 고 빠른 분석을 가능 하 게 사내 소프트웨어에 의해 분석 된다.

영상 판 독특한 HMCA 3D 종양 spheroids의 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 전체 분석 결과, 회전 타원 체 형성으로 시작 하 고 침공 과정과 추가 조작으로 끝나는 같은 접시에 내에서 수행 됩니다. 회전 타원 체 형성에 대 한 HeLa 세포 배열 분 지에 로드 되 고 중력에 의해 히드로 MCs에 정착. 하이드로 겔 부착/저 첨부 파일 특성 있는 MCs 세포 세포 상호 작용 및 3D 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다. 그림 2A 에서는 150 x 103 셀/mL 로드 솔루션의 사용에 따라 MCs에 정착 하는 셀 (즉., MC 당 ~ 16 셀 값 계산). 그것은 분명 MC 당 셀 인 배열을, 균등 하 게 배포 되지 및 평균 취득된 통계 분포는 MC 당 14.78 ± 3.60 셀. 그림 2b에서 테이블 전체 H...

HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

이 간단한 재현 가능한 생체 모방 3D 세포 기반 시스템의 목표는 항 전이성 약물 스크리닝을 위한 종양 스페로이드의 큰 집단에서 침입 용량 분석을 용이하게 하는 것이다. 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이의 주요 장점은 웰당 동일한 초점 평면을 채우는 많은 수의 균일한 스페로이드를 생산할 수 있다는 것입니다. 상기 스페로이드 위치는 세포외 매트릭스 첨가 후에도 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 구조로 인해 유지되며, 스페로이드 및 침입 공정의 정확한 연속 모니터링을 용이하게 한다.또한, 수많은 스페로이드 및 침입 세포의 형태학적 특성화 및 형광 염색은 현장에서 수행되고 시간 효율적인 방식으로 단일 요소 해상도로 분석될 수 있다. 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 6웰 이미징 플레이트 생산 시술을 시연하는 것은 실험실에서 마리아 소볼레프입니다. 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 플레이트를 준비하기 위해 먼저 6개의 폴리디메틸실록산 또는 PDMS를 예열하여 70°C까지 우표를 찍고, 몇 분 동안 섭씨 75도까지 예열된 드라이 목욕에 6웰의 유리 바닥 플레이트를 놓습니다.접시가 따뜻할 때, 6웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 예열된 저용 아가로즈 400 마이크로리터 드롭을 붓고, 각 방울에 스탬프 1개를 부드럽게 놓습니다. 실온에서 5~10분 동안 설정을 식히고, 섭씨 4도에서 20분 간 식혀 완전한 아가로즈 젤레이션을 준비합니다. 아가로즈가 고화되면 각 우물에서 PDMS를 부드럽게 벗겨 내고, 아가로즈 젤을 마이크로 챔버로 패턴화합니다.UV 램프가 최고 강도에 도달한 후 엠보싱 플레이트를 라이트 경화 시스템에 3분 동안 배치하고 UV 멸균 된 매크로 웰을 멸균 PBS로 채웁니다. 그런 다음 접시를 덮고 파라필름으로 포장하여 사용전까지 섭씨 4도 보관합니다. 세포를 로드하려면 각 우물에서 PBS를 제거하고 각 하이드로겔 어레이 위에 관심 있는 셀의 50 마이크로리터를 부드럽게 로드합니다.세포가 중력에 의해 15 분 동안 정착 할 수 있도록 한 후, 조심스럽게 링과 하이드로 겔 어레이 외부 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 신선한 매체의 500 마이크로 리터의 6 ~ 8 알리쿼트에 추가합니다. 스페로이드 형성을 위해 습도가 있는 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 적절한 기간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 스페로이드를 얼음에 있는 생물 안전 후드로 10분 간 옮킨다.플레이트가 냉각되면 하이드로겔 어레이 옆에 있는 매크로 웰 플라스틱 바닥 의 가장자리에 파이펫 팁을 기대어 배열 주위에서 모든 매체를 제거합니다. 이어서, 어레이 탱크에서 배지를 제거하고, 어레이 탱크의 가장자리에 겔 로딩 파이펫 팁을 매우 신중하게 기울여 마이크로 챔버와 스페로이드를 방해하지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 미리 얼어붙은 미세파이펫 팁을 사용하여 콜라겐 혼합물 150마이크로리터의 2개의 알리쿼트를 한 번에 하나씩 어레이의 가장자리에 추가하여, 스페로이드 탈구를 피하기 위해 천천히 혼합물을 방출한다.콜라겐의 두 번째 라운드가 각 우물에 추가 된 후, 세포 외 매트릭스의 전체 겔화를 위해 1 시간 동안 인큐베이터에 스페로이드를 반환합니다. 매트릭스가 고화되면, 젤 위에 미리 데운 1% 낮은 녹는 아가로즈 400 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5~7분 동안 플레이트를 배양한 후 아가로즈 겔화를 위해 섭씨 4도에서 2분간 냉각합니다. 그런 다음 매크로 웰 플라스틱 바닥의 가장자리에 파이펫을 기울고 각 웰에 완전한 중간 크기의 2 밀리리터를 부드럽게 추가합니다.침략 분석을 수행하기 위해 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 플레이트를 가습 된 대기가있는 37도 및 5 % 이산화탄소 인큐베이터를 갖춘 전동 된 반전 현미경 단계에 적재하고 4 또는 10 배 목표를 사용하여 각 배열 영역을 평가할 수 있도록 이미지 수집의 위치를 미리 결정합니다. 이어서, 스페로이드 체체로부터 주변 세포외 매트릭스로의 세포 침입을 추적하기 위해 총 24~72시간 동안 2~4시간마다 밝은 필드 영상을 습득한다. 이미지 수집이 끝나면 태그가 지정된 이미지 파일 형식으로 저장하기 위해 이미지 수집 소프트웨어의 시간 경과 이미지를 전용 폴더로 내보냅니다.다음으로 그래픽 사용자 인터페이스를 열고 밝은 필드 로드를 클릭합니다. 이미지의 세분화 매개 변수를 조정하여 스페로이드 및 해당 침략 영역의 정확한 세분화를 달성하고 관심 영역 세분화 영역을 클릭하여 각 스페로이드 주위에 테두리를 만듭니다. 자동 세분화가 올바르지 않으면 삭제 또는 추가를 누르고 적절한 수정을 수동으로 수행합니다.추적을 클릭하여 각 시간 경과 이미지의 스페로이드에 번호를 매겨보세요. 그런 다음 측정을 클릭하여 모든 매개 변수가 있는 스프레드시트를 생성하고 스프레드시트를 데이터 처리 및 통계 분석에 적합한 형식으로 저장합니다. 자발적인 HeLa spheroid 침입 과정에 히알루론산의 영향을 조사하기 위해, 이 실험에서, 2일 성숙한 스페로이드는 콜라겐과 히알루론산 혼합물 용액으로 덮여 있었고, 콜라겐 용액으로만 덮인 2일 숙성 스페로이드와 비교하였다.50시간의 배양 후 콜라겐과 히알루론산에 내장된 스페로이드는 콜라겐에만 내장된 스페로이드에 비해 주변 세포외 매트릭스로 의 한 하부 세포 분산을 입증하였다. 실제로, 단일 스페로이드 해상도에서 99개의 스페로이드에 대한 시간이 지남에 따른 침략 영역 운동제의 분석은 콜라겐에 히알루론산을 첨가하면 스페로이드에서 세포 분산을 억제하여 더 작은 침입 부위를 초래한다는 것을 명확하게 나타낸다. 24시간 동안 사이토 및 미정 특성을 가진 생리활성 플라보노이드를 가진 HeLa 스페로이드 배양을 치료하면 비처리된 HeLa 스페로이드에 비해 스페로이드 주위의 억제된 세포 분산이 발생합니다.실제로, 실험의 끝에 488 스페로이드의 침략 영역의 분석은 약물의 10 마이크로 몰라로 치료 후 상당한 억제를 밝혔다. 하이드로겔의 낮은 부착 특성으로 인해, 이 마이크로 챔버 기반 기술은 극소수의 세포의 경우에도 스페로이드의 형성을 용이하게합니다. 이것은 귀중한 한정암 줄기 같이 또는 환자 유래 1 차 세포 견본에 있는 특히 이점입니다.하이드로겔 마이크로 챔버 이미징 플레이트는 단일 요소 수준에서 침입 공정의 평가를 위한 장기 실험 동안 스페로이드의 정확한 공간 위치를 분석할 수 있으며 높은 수준의 통계적 견고성과 정확도를 제공한다. 이 방법론의 미래 응용 프로그램은 매크로 웰 내의 다른 지역에서 종양 및 기질 세포의 나란히 다세포 배양 및 다운스트림 분자 분석을 위한 개별 스페로이드의 검색을 포함한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

암 세포에 의해 내피 세포 단층의 침략을 측정하는 실시간 전기 임피던스 기반 기술

이 비디오는 전기 임피던스를 기반으로 하는 3챔버 어레이를 사용하는 침입 분석에 대해 설명합니다. 이 기술은 종양 미세환경에서 상주하는 기질 세포가 분비하는 수용성 인자의 영향으로 암세포의 침습 가능성을 측정합니다.

Three-chambered Array-based Impedance Assay: 전기 임피던스를 측정하여 암세포의 침습 가능성을 평가하는 실시간 분석 기법

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

시험관내 세포 침습 분석기는 단백질 매트릭스를 함유하는 세포 배양 삽입을 사용하여 침입 및 이동을 위한 세포 전이를 정량화함으로써 암 전이의 잠재력을 측정하는데 사용된다. 세포는 단백질 매트릭스와 다공성 막을 통해, 화학유도제를 향해, 그 때 가벼운 현미경 검사법에 의해 정량화되기 위하여 도전됩니다.

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

이것은 암 전이의 억제제 또는 드라이버를 위해 검열하는 효과적인 방법입니다. 발현 라이브러리로 변환된 세포는 전이성 콜로니를 형성하기 위해 닭 초리오알란토아막 혈관에 주입됩니다. 감소 또는 증가 된 침략을 갖는 식민지는 절제, 확장, 자신의 표현형을 확인하기 위해 재주입, 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석.

신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

암세포의 전이성 능력을 평가하기 위한 CAM-Delam 분석은 비교적 빠르고, 쉽고, 저렴하다. 이 방법은 전이 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 풀고 약물 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 인간 종양 샘플을 분석하기 위한 최적화된 분석은 개인화된 암 치료를 위한 임상 방법이 될 수 있다.

CAM-Delam Assay, 암세포의 박리 및 침윤 능력을 정량화하여 전이성 특성을 점수화하기 위한 분석

침습은 암의 발병과 진행에 있어 중요한 생물학적 현상입니다. 이 과정은 비종양 세포와 종양 미세환경의 구성 요소에 의해 영향을 받습니다. 이 연구의 목적은 3차원(3D) 배양을 사용하여 종양 세포 침입을 in vitro 분석하는 대체 방법을 설명하는 것입니다.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

학습하세요 하이드로겔 마이크로챔버 어레이를 사용한 3D 종양 스페로이드 침입 분석 방법으로 항전이 약물 스크리닝을 수행합니다. 이 기술은 균일한 스페로이드 대량 생산과 지속적 모니터링이 가능하여 정확한 단일 요소 해상도 분석을 제공합니다.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

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