Name: 성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 학습하세요 성인 Drosophila 다리에서 축 삭 표적화를 시각화하는 방법을 형광 단백질을 사용하여. 고정, 마운팅, 이미징 단계를 포함하는 이 프로토콜은 3D 재구성과 신경 연결 연구에 활용됩니다.

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우리 감사 로버트 Renard 비행 음식 매체를 준비. 이 작품은 NIH 그랜트 NS070644 R.S.M.에 의해 지원 되 고 J.E.에 ALS 협회 (#256), FRM (#AJE20170537445)와 ATIP 미래 프로그램에서 자금

1. 다리 절 개 및 고정
<ol><li>유리 다 잘 접시와 채우기 적절 한 수의 70% 에탄올과 웰 스 가져가 라. 추가 15-20 공동2-각 (중 섹스의 모든 나이) 마 취 파리 잘와 브러쉬를 사용 하 여 부드럽게 소량 에탄올 솔루션으로 파리 파리 완전히 잠긴 때까지. 참고:이 단계는 표 피의 hydrophobicity를 제거 하는. 이 자동-형광 표 피의 증가 하기 때문에 1 분 이상 씻지 않는.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에서 3 번 0.3% 비 계면 활성 제 세제 솔루션으로 파리를 헹 구 십시오. 적어도 10 분 동안이 솔루션에 파리를 유지. 참고: 때 다리 안쪽 정착 액의 침투를 증가 하는 세제를 포함 하 여 다리 고정 잘 됩니다.</li>
	<li>4 %paraformaldehyde (PFA) 튜브 함께 얼음에 다 잘 접시를 놓습니다. 참고: 신선한 4%의 준비는 16 %PFA 에탄올 무료 재고 솔루션에서 PFA이 중요 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 머리와 파리의 복 부 흉부 세그먼트 또는 다리를 손상 없이 제거 하. 참고: 비행 하 고 다리 부를 쉽게 제거 하는 복 부.</li>
	<li>집게와 흉부 세그먼트에서 다리를 해 부하 고 4%를 포함 하는 우물에서 다리 PFA. 이 위해, 다리 분리 될 때까지 잘 집게의 팁을 사용 하 여 고관절 흉부 접합에서 부드럽게 하지만 단단히 밀어.</li>
	<li>4% PFA 4 ° C (대략 20 h 총)에서 하룻밤에 다리를 수정.</li>
	<li>1 x PBS에 0.3% 비 계면 활성 제 세제 솔루션, 20 분 동안 5 배 다리를 씻어.</li>
	<li>설치 중간에 세척 버퍼를 바꿉니다. 다리에 그것의 완전 한 침투 수 있도록 장착 전에 적어도 하루에 대 한 설치 중간에 다리를 유지. 참고: 경우 장착 매체는 높은 점성, 점도에 급격 한 변화는 붕괴 하 고 다리의 전체 구조를 손상 표 피를 발생할 수 있습니다 때문에 장착 매체 1 x PBS와 80%에 희석. Gal4 드라이버에 따라 장착까지 미디어를 마운트에 4 ° C에서 1 ~ 3 주 위해 파리를 유지 수 있습니다.</li>
</ol>2. 다리 장착
<ol><li>70% 글리세롤의 약 20 µ L 현미경 슬라이드와 커버 평방 22 x 22 m m2 coverslip (그림 2A, B)의 왼쪽에 놓습니다. 평행 하는 작은 거리에서이 coverslip의 오른쪽 가장자리에서 라인을 따라 설치 매체의 약 10 µ L 플라스틱 (그림 2C) 슬라이드의 오른쪽에 추가 장착 매체의 또 다른 30 µ L를 추가 합니다. 참고: 다리 (아래 참조)는 coverslip를 적용할 때 설치 매체 부드럽게 확산 됩니다는 coverslip 아래와 다리 주위 그들을 전치 하지 않고.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 솔루션에서 다리를 들어올려 고 부드럽게 왼쪽된 coverslip 근처 장착 매체에 그것을 넣어. 각 다리에 대해 동일 하 고 위에서 아래로 (그림 2D) 그들을 정렬.<ol>
<li>들어올린 다리는 집게의 두 끝 사이 매체의 한 방울에 전송. 두 가지 방법으로 다리 방향: 외부 측 위 또는 아래로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 다리 (최대 6-8 다리 거치 될 수 있다) 올바르게 정렬 하 고, 일단 넣어 두 번째 coverslip 다리는이 coverslip 이전 배치 coverslip (그림 2E) 하는 coverslip와 조직 사이의 공간에 대 한 있도록 약간 달려있다 점점 손상된 (그림 2G)에서 다리를 방지 합니다. 참고: 또는 스티커 우물 또는 교정 왁 스는 coverslip와 슬라이드 사이의 공간에 사용.</li>
	<li>매니큐어를 사용 하 여 각 모서리 (그림 2F)에서 coverslips의 위치를 확보. 참고: 조직 이미지 준비가 이제는.</li>
</ol>3입니다. 영상
<ol><li>GFP 형광과 표 피 자동 형광을 동시에 488 nm 레이저 및 두 개의 검출기를 사용 하는 단일 트랙을 설정 합니다. 소프트웨어의 빛 경로 창의 스펙트럼 창에서 범위 컨트롤 또는 슬라이더 디스플레이 사용 하 여 하나의 검출기 (검출기 1) 498-535 nm와 다른 하나 (감지기 2) 566-652 nm 사이 사이 감지 범위를 설정 합니다. 참고: 일반적으로, 발견자 1 이어야 한다 GaAsP 검출기와 검출기 2 광 전 증폭 관 관. 498-535 채널 최적의 GFP 신호를 감지 하지만 표 피에서 자동 형광 탐지. 그러나, 566-652 채널 (그림 3A) 표 피에서 자동 형광만 감지합니다.</li>
	<li>X 20을 사용 하 여 또는 25 X 기름 침수 목표, 1024 x 1024 픽셀 해상도, 12-비트 깊이 Z 간격으로 1 µ m. 설정된 픽셀 면만 약 1.58 µs, 시간 평균 2 프레임/이미지 설정. 목표를 사용 하 여 높은 수 가늠 구멍으로.</li>
	<li>Confocal 현미경 및 이미징 소프트웨어 사용에 따라 다른 모든 설정을 설정 합니다.<ol>
<li>498-535 검출기 보다 566-652 검출기에서 밝은 표 피 신호를 얻을 수 있는지 확인 합니다. 이렇게 하려면 두 탐지기 488-레이저 같은 레이저 파워를 사용 합니다. 채도 마커를 사용 하 여 먼저 검출기 충분히 밝은 GFP 신호 (그림 3B, D)를 1의 이득을 조정 합니다. 그런 다음 높은 표 피 신호 (다리, 관절의 가장자리)와 일부 지역이이 검출기 (그림 3C, E)에서 포화 신호 생성 되도록 감지기 2의 이득 조정.</li>
		<li>다리 확장 하 고 단일 프레임에 이미지를 너무 큰 경우 현미경 이미징 소프트웨어에서 타일 또는 위치 옵션을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>중 독점 현미경 이미징 소프트웨어 또는 ImageJ/피지 프리웨어 (아래 참조)를 사용 하 여 사용 하 여 최종 이미지를 재구성 합니다.</li>
</ol>4입니다. 게시물 처리 이미징
<ol><li>ImageJ/피지에 confocal 스택을 엽니다.<ol>
<li>Bioformats 플러그인을 사용 하 여 (플러그인 | 바이오-형식 | Bio-formats 수입)에 되지 않은 이미지를 열고 피지에서. 독자적인 이미징 소프트웨어 패키지9에서 TIF 형식입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지를 선택 하 여 채널 분할 | 컬러 | 분할 채널. 참고: 여러 위치에서 이미지 되었다 재결합 해야 하는 경우는 없음을 사용 바느질에서 피지에 플러그인 (플러그인 > 바느질 > 쌍 바느질)10,11.</li>
	<li>GFP 신호에서 표 피 신호를, 열고 이미지 계산기 (과정 | 이미지 계산기): 이미지 1 (GFP + 표 피) 탐지기 1에서에서 스택 선택 (그림 4A), 작업 창에서 빼기, 선택한 스택 탐지기 2에서에서 이미지 2 (표 피) (그림 4B). 그 결과, GFP 생 신호 (GFP)에 (그림 4C) 얻을 수 있다.<ol>
<li>발견자 2에서에서 얻은 ' 표 피 전용 ' 스택 (GFP)이이 스택을 다시 병합 (그림 4B 이미지 | 컬러 | 병합 채널)는 RGB 이미지 구성 된 조직 관련 GFP 신호 뿐만 아니라 (그림 4D) 다리 세그먼트 내의 축 삭 아 버를 식별 하는 데 도움이 표 피 신호를.</li>
		<li>각 이미지의 밝기 및 대비 조정 (이미지 | 조정 | Brightness/Contrast) 단일 RGB 이미지를 생성 하 고 (이미지 | 유형 | RGB 색상). 참고: Z 스택의 최대 투영 생성 하 (이미지 | 스택 | Z 프로젝트...), GFP 신호 및 다음 두 개의 채널을 병합 하기 전에 밝기 조정 될 수 있는 표 피에 대 한 평균 강도 대 한 최대 강도 투영을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는 매크로 사용 하 여 자동 뺄셈과 ImageJ/피지에 이미지의 처리에 대 한. 매크로 편집기에서 추가 파일 1에서 텍스트를 복사 (플러그인 | 새로운 | 매크로), 플러그인 폴더에 매크로 저장 하 고 매크로 사용할 수에 ImageJ/피지 한 번 다시 시작.<ol>
<li>매크로 사용 하려면 confocal 스택 열고 밝기/대비 창을 엽니다 (이미지 | 조정 | Brightness/Contrast). 다음 매크로 실행 (플러그인 | 매크로 | 실행) 지침을 따릅니다.</li>
		<li>작업 (이미지 계산기 창)을 지정 하도록 요청 하는 경우 스택 1 (GFP) 이미지 1, 이미지 2 스택 2 (표 피), 그리고 빼기를 선택 합니다. 참고: 매크로 생성 최대한 프로젝션 이미지 처리 GFP 신호 (stack1 MAX_Result)의 표 피 (AVG_stack2), 표 피 스택 GFP 스택 (stack1의 결과), 그리고는 처리에서 뺄셈의 결과의 평균 투영 표 피 스택 (stack2)입니다.</li>
		<li>대비를 조정 하도록 요청 받을 때 밝기/제어 창에서 컨트롤을 사용 하 여 GFP, 최대한 프로젝션 이미지의 밝기/명암 대비를 조정 하 고 RGB를 생성 하는 표 피의 평균 투영의 두 신호에 GFP를 보여주는 이미지를 병합 녹색 그리고 회색에 표 피입니다. 마찬가지로 다음 단계에서 사용할 수 있는 결합된 GFP와 표 피 스택 생성을 stack1, 그리고 stack2의 결과 병합 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 차원에 다리를 시각화 하려면 새로 생성 된 더미 (그림 4E)와 전문된 3D 소프트웨어를 사용 합니다.<ol>
<li>3D 소프트웨어와 RGB 스택 엽니다 ( 재료의 표참조). 팝업 대화 상자 창에서 모드 전환 섹션에 모든 채널을 선택 하 고 복 (픽셀의 볼륨)의 크기를 입력 합니다. 참고: 필요한 모든 정보는 사용 되 고 어떤 독점 현미경 소프트웨어에서 이미지 파일에 포함 됩니다.</li>
		<li>채널 2 모듈 (GFP 신호), 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 디스플레이 | volren. 그런 다음, volren 모듈에 왼쪽 클릭 하십시오. 속성 섹션 (화면 왼쪽 아래)에서 왼쪽 편집을 클릭 하 고 volrengreen.col를 선택 합니다. 채널 1 모듈 (표 피 신호)에 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 디스플레이 | volren. 그런 다음, volren 모듈에 왼쪽 클릭 하십시오. 고급 선택 ddr (투명 한 방사선 사진 처럼 디스플레이)에 속성 섹션 왼쪽에서 다음 표 피 배경 (그림 4E) 보러 감마 값을 조정 합니다.</li>
		<li>3 차원 회전을 생성 하려면 프로젝트 스택 모듈에 마우스 오른쪽 단추로. 다음 선택 애니메이션 | 회전. 회전 모듈에서 왼쪽 클릭 하십시오.</li>
		<li>속성 에서 섹션 bbox 센터를 사용 하 여클릭 합니다. 회전 모듈에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 계산 | 영화 제작자. 무비 메이커 모듈에서 마우스 왼쪽된 버튼을 클릭 합니다. 속성 섹션에서 클릭 왼쪽된에 고급 (속성 섹션의 오른쪽 상단).</li>
		<li>파일 이름 필드에 영화 회전의 이름 입력. 품질 분야에서 1 (최고 품질)을 작성 합니다. 8.3 s 회전 바란다면 200 프레임 을 두고 (이 수 감소 또는 증가 하는 회전의 속도 수정). (녹색 버튼, 속성 섹션 (참조 비디오 1)의 왼쪽 아래) 적용 을 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).</li>
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<li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila%3A+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199(2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

표 피 성인 초파리와 다른 절지동물의 많은 어두운 안료를 포함 하는 그들의 신체 내부 구조를 보기 위한 중요 한 장애 이다. 또한, 그것은 강력 하 게 고정 하 여 악화 시킨 자동 형광입니다. 이 두 기능은 매우 형광 염료 또는 외 골격을 가진 동물의 체 내 분자의 관찰에 대 한 문제가 있다.
우리가 설명 하 고 우리가 일상적으로 실험실에서 사용 하는 절차는 축 삭 궤도의 고 성인 초파리 다리에 그들의 터미널 엔딩의 깨끗 하 고 상세한 이미지를 생성 합니다. 중요 한 것은 깨끗 한 GFP 신호 다리 표 피에 의해 방출 하는 형광에서 어떤 오염 없이 얻은 것입니다. 이 기능은 시각화 및 3D 이미징 프로그램을 사용 하 여 축 삭 아 버의 3 차원 기능을 quantitate 수 필수입니다. 이 방법으로 여러 다리에서 얻은 데이터를 비교할 수 있습니다. 절차 쉽게 다른 형광 단백질에서 신호를 관찰에 대 한 적응 하 고 다른 성인 절지동물 축 삭 이미지를 쉽게 사용할 수...

척 추가 있는 사지 처럼 초파리 성인 다리 세그먼트로 구성 됩니다. 각 비행 다리는 각각의 구성 하는 여러 근육 섬유1,214 근육을 포함 되어 있습니다. 성인 다리 MNs의 셀 시체 (prothoracic) T1, t 2 (mesothoracic), 및 복 부 신경 코드 (VNC), 척추 척수 (그림 1)에 유사한 구조의 각 측에 T3 (metathoracic) 중추에 있습니다. 어떤 대상 근육은 동측 다리 (고관절, trochanter, 대 퇴 골, 경골)의 4 개의 세그먼트에서 (그림 1)3각 중추에 약 50 MNs가 있다. 중요 한 것은, 각 개별 성인 다리 미네소타 동물3,4사이 진부 매우 독특한 형태학 상 id를 있다. 이러한 독특한 MNs 라는 neuroblasts (NBs) 다리 MNs 애벌레 단계3,4생산 11 줄기 세포에서 파생 됩니다. 모든 애벌레 단계의 끝에 미 숙 postmitotic MNs 취득 그들의 특정 수지상 아 버 및 axonal 터미널 대상 그들의 독특한 형태3,4를 정의 하는 변 태 중 분화. 이전 녹음 방송 요인 (TFs)의 조합 코드 각 초파리 성인 다리 미네소타5의 독특한 형태를 지정 하는 가설 테스트. 모델, 우리 혈통 B 11 주의 계보는 MNs에서 7을 생산 하 고 조합 코드 postmitotic 성인 다리 MNs에에서 표현 하는 TFs의 그들의 개별 형태학 지시 증명 중 하나를 사용 합니다. MNs의 TF 코드 reprograming 여 우리 미네소타 형태학 예측 가능한 방식으로 전환할 수 있다. 우리는 이러한 TFs 전화: mTFs (형태학 TFs)5.
성인 MNs의 형태소 분석의 가장 어려운 부분 중 하나는 높은 해상도 자동 형광 표 피를 통해 축 삭을 시각화입니다. 우리는 일반적으로 DVglut Gal4같은 이진 식 시스템과 MNs에 표현 되는 막 태그 GFP와 축 삭 라벨 /UAS-mCD8::GFP 또는 DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, DVglut 는에 표현 하는 강한 드라이버 motoneurons6. Repressible 마커 (MARCM)7,8, cis-MARCM 또는 MARCMbow5모자이크 분석 등 다른 클론 기술로 이러한 도구를 결합 하 여 MNs phenotypic 분석의 모집단 GFP 식이 제한할 수 있습니다. 축 삭 쉽게. 우리는 프로토콜 성인 다리의 내부 구조 (1) 고정 등 성인 초파리 다리에 본질적인 특정 문제를 해결 하 여 이미징 및 후속 3D 재구성 그대로 다리 미네소타 axonal 형태를 유지 하기 위해 생성 된 축 삭 형태학, 형광 식 생과 다리 근육에 영향을 주지 않고 전체 구조는 coverslip 아래와 표 피를 처리 하는 이미지, 그리고 (3) 이미지에 대 한 적절 한 방향으로 유지 하기 위해 다리의 (2) 장착 배경으로 axonal 형광 신호입니다. 이 프로토콜 미네소타 axons에서 형광 식의 검출에 대 한 자세한 되었습니다 동안 시각화 절지동물의 다리 neuromusculature의 다른 구성 요소에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>Fisher</td><td>E/6550DF/17</td><td>앱솔루트 분석 시약 등급</td></tr><tr><td>비이온 계면활성제 세제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100, 분자생물학용</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td>Jewelers 겸자, Dumont No. 5</td></tr><tr><td>유리 멀티 웰 플레이트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71563-01</td><td>9 캐비티 파이렉스, 100mm x 85mm</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td>Pierc 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올이 없는</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 229-1</td><td>글리세롤(분자 생물학)</td></tr><tr><td>스페이서</td><td>Sun Jin Lab Co</td><td>IS006</td><td>iSpacer, 4개의 웰, 약 12 &mu; L 웰 당 작업 볼륨, 직경 7mm, 깊이 0.18mm</td></tr><tr><td>정사각형 22mm x 22mm 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-541-B</td><td>No.1.5-0.16 - 0.19mm 두께</td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Vectashield 안티페이드 장착 매체</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM780; 용도 사용 LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2011</td></tr><tr><td>3D-Image 소프트웨어</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Amira 6.4</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>ImageJ/FIJI</td></tr></tbody></table>

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

대부분 신경 사양에 대 한 작업의 유전자와 순수 세공 모델 C에서 실시 되었습니다. 선 충, 초파리 애벌레 및 물고기, 모든 운동의 그들의 기본 모드 (예: 크롤링 또는 수영) undulatory 운동에 참여. 그러나, 보다 정교한 개별 모터 신경 (미네소타) 규격의 이해-이상 질병 치료를 알리는 측면에서-더 나은 모델의 복잡 한 돌출부 기반 운동 체계는 동등 하 게 세공 시스템 요구 척추 동물입니다. 걸어 담당 성인 초파리 운전 시스템 모두 충족 이러한 기준의 쉽게, 이후이 모델에서 쉽게 고유 다리 MNs (다리 당 약 50 MNs) 작은 수의 규격을 연구 수 둘 다 광대 한 사용 강력한 유전자 도구, 및 돌출부 기반 운동 체계의 생리 적 맥락에서 배열입니다. 여기 우리는 성인 비행에 다리 근육 신경 분포를 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다.

그림 4에서 같이,이 절차 그들의 터미널 버는 함께 성인 초파리 다리 GFP 표시 된 축 삭의 우수한 영상이 있습니다. 중요 한 것은 깨끗 한 GFP 신호 다리 표 피에 의해 방출 하는 형광에서 어떤 오염 없이 얻은 것입니다. 표 피에서 신호는 GFP 신호 식별 (그림 4E, 그림 1및 비디오 1) 다리에 축 삭의 위치를 다음 결합 수 있습니다. 비판적으로, 잘 고정 다리를 얻기 위해 중요 하다. 그림 5 는 잘 고정 (그림 5A)와 심하게 고정 다리 (그림 5B)의 예를 보여줍니다. 경우에서 다리 안쪽 내부 구조는 균일 한 색상의 고이 ...

여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

이 방법은 다른 형광 단백질로부터 신호를 관찰하기 위해 용이하게 적응할 수 있거나 다른 성인의 축축을 이미지화하는 데 사용될 수 있으며 이 기술의 주요 장점은 축축과 말단 식목의 우수한 3차원 재구성 및 시각화를 용이하게 한다. 70%에탄올로 유리 멀티웰 플레이트에 적절한 수의 우물을 채우는 것으로 시작합니다. 브러시를 사용하여 모든 연령 또는 성별의 이산화탄소 마취 파리 15~20개를 각 우물에 추가하고 완전히 물에 잠길 때까지 파리를 에탄올에 부드럽게 두드려 주세요.1분 이상 후, 시동당 최소 10분 동안 인산염 완충식식염에 0.3% 비이온 계면활성제 세제용액으로 파리를 세 번 헹굴한다. 마지막 세척 후, 집게를 사용하여 흉부 세그먼트 또는 다리를 손상시키지 않고 각 플라이의 머리와 복부를 제거하고 미세 집게 한 쌍의 끝을 사용하여 코카 흉부 접합에 압력을 부드럽게 바르지만 단단히 가하여 흉부 세그먼트에서 한 쪽 다리를 분리합니다. 갓 준비된 4%파라포름알데히드가 들어있는 새로운 멀티웰 플레이트의 한 웰에 다리를 놓고 밤새 4도의 배양을 합니다.다리를 고정 된 다리를 얻기 위해 떠두지 않고 고정 버퍼에 다리를 부드럽게 밀어 넣는 것이 중요합니다. 다음 날, 신선한 0.3 % 비 이온 계면 활성제 세제 용액으로 다리를 5 번 세척하여 세척 당 20 분 동안 씻습니다. 마지막 세척 후 세제를 장착 매체로 교체하고 다리를 장착 매체에 24시간 이상 유지하십시오.다음 날, 유리 현미경 슬라이드의 코팅 된 끝 옆에 70 % 글리세롤의 약 20 마이크로 리터를 추가하고 22 by 22 mm 커버 슬립으로 글리세롤을 덮습니다. 다음으로, 커버슬립의 오른쪽에 약 10 마이크로리터 라인의 장착 매체를 추가하고 10 마이크로리터 라인의 오른쪽에 장착 매체의 두 번째 30 마이크로리터 라인을 적용한다. 미세한 집게를 사용하여, 중간 크기의 멀티웰 플레이트에서 외부 측 또는 아래 방향으로 장착 매체의 10 마이크로리터 스트립으로 한 쪽 다리를 옮길 수 있습니다.6~8개의 다리가 장착되고 정렬될 때까지 반복하고 두 번째 커버슬립이 첫 번째 커버슬립에 약간 놓이도록 다리 위에 두 번째 커버슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버립의 각 모서리에 매니큐어를 사용하여 제자리에 고정하십시오. 다리를 이미지화하려면 488 나노미터 레이저와 두 개의 검출기를 동시에 사용하여 GFP 및 큐티클 자동 형광을 모두 얻기위한 첫 번째 트랙을 설정합니다.2

visualize-drosophila-leg-motor-neuron-axons-through-the-adult-cuticle

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Drosophila melanogaster의 애벌레가 애벌레 segmental 신경 이내 axonal 수송의 메커니즘을 조사하기 위해 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 이 절차를 사용하여 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레는 야생 타입 애벌레 비교할 수 있습니다.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

이 프로토콜은의 라이브 절개를...

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

현장 패치에 클램프 녹음은 그대로 회로의 뉴런의 electrophysiological 특성에 사용됩니다. CNS는 작고 강력한 피복에 둘러싸여 있기 때문에 Drosophila 유전자 모델 패치를 고정으로 어렵습니다. 이 문서는 이후의 패치 클램프 녹음의 집과 깨끗한 뉴런을 제거 할 수있는 절차에 대해 설명합니다.

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

이 비디오는 이미징 분석을 위해 신경근 조직을 그대로 보존하면서 초파리 성인 다리를 절개, 고정 및 장착하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경 검사를 위한 곤충 다리 처리: 이미징을 위한 신경근 구조를 보존하는 방법

출처: Guan, W., et. al. 시각화 Drosophila  다리 운동 뉴런은 성인 표피를 통해 축삭을 형성합니다. J. Vis. Exp. (2018년) 이 비디오는 다음의 이미징을 보여줍니다.Drosophila 다리. 레이저와 두 개의 검출기가 GFP와 큐티클 자가형광을 포착합니다. 이미지는 채널을 분할하고, 자가형광을 빼고, 착색된 복합 이미지로 병합하여 다리 세그먼트 내의 축삭을 시각화하여 처리됩니다.

Imaging of fluorescently-labeled motor neurons in an adult drosophila leg(성인 초파리 다리에서 형광 표지된 운동 뉴런의 이미징)

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

우리는 신경 근육 접합의 건축을 보존하고 성인 Drosophila 다리에 있는 운동 신경의 상세한 면역 세포화학 연구 를 가능하게 하는 해부 기술을 기술합니다.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

학습하세요 성인 Drosophila 다리에서 축 삭 표적화를 시각화하는 방법을 형광 단백질을 사용하여. 고정, 마운팅, 이미징 단계를 포함하는 이 프로토콜은 3D 재구성과 신경 연결 연구에 활용됩니다.

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

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