Name: 성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: 학습하세요 성인 제브라피시의 경구 삽관법을 통해 생리활성 화합물의 장 점막 흡수와 면역 반응을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기법은 점막 백신학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 유럽 위원회와 AGAUR 자금 (AGL2015-65129-R MINECO/페더 및 2014SGR-345 AGAUR) NR 과학, 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 되었다. RT는 AGAUR (스페인), JJ에서에서 전 박사 장학금 중국 장학금 위원회 (중국)에서 박사 학위 장학금에 의해 지원 되었다와 NR 라몬 y Cajal 프로그램 (RYC-2010-06210, 2010, MINECO)에 의해 지원 됩니다 보유 하고있다. 우리는 단백질 생산, "룸 드 Microscopia"에서 명 Barba 전문가 조언에 감사 박사 Torrealba와 Universitat Autònoma 드 바르셀로나 유용한 기술 지원의 "룸 드 Citometria"에서 닥터 엠 코스타.

Zebrafish (Danio rerio)를 포함 하는 모든 실험 절차 연구와 관련 된 동물 (국제 원칙와 Universitat Autònoma de 바르셀로나 (CEEH 수 1582)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 EU 2010/63). 라이브 zebrafish 모든 실험 26-28 ° c.에 수행 되었다
1. 구강 삽 관 법에 대 한 장비 준비
<ol><li>31 G Luer 잠금 바늘 바늘 팁을 커버 하기에 좋은 실리콘 튜브의 대략 1 cm를 놓습니다.</li>
	<li>컷 10 µ L 살 균 필터 피 펫 팁 (약 2cm), 미세한 끝과 칼 집으로 실리콘 튜브 위에 그것을 배치. 피펫으로 확장 부상 동물을 피하기 위해 바늘의 끝 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>100 µ L Luer 잠금 주사기 바늘을 연결 합니다. 참고: 항상 에탄올으로 씻어 고 다음 인산 염 버퍼 (PBS, 자료를 참조) 치료 사이의 철저 하 게.</li>
</ol>2입니다. 솔루션 필요
<ol><li>150 mg/L (마 취) 또는 300 mg/L (안락사)는 zebrafish 유지는 수족관에서 물과 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) 솔루션의 준비. 마 취 솔루션의 1 리터와 작은 탱크를 화난 그것을 유지.</li>
	<li>물고기 복구에 대 한 MS-222 없이 수족관 물 1 리터와 함께 또 다른 작은 탱크를 화난 그것을 유지.</li>
	<li>살 균 재고 솔루션 x 10에서 1 x PBS의 50 mL를 확인 합니다.</li>
	<li>Cytometry 분석/장내 세포 격리에 대 한 1 %v / v 페니실린과 스 (자료 참조)와 함께 물고기 재고 솔루션 또는 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) 분말 당 1 ml 충분 한 신선한 0.15% 콜라 유형 IV 솔루션을 준비 합니다. 2 mL 원심 분리기 튜브에 aliquots (물고기 당 1) 1 ml를 확인 합니다. 해 부 단계 전에 30 분까지 4 ° C에서 유지.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법/샘플 고정, 50 mL PBS에 신선한 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 준비 또는 재고 솔루션 증기 두건에서-20 ° C 냉장고에서 해 동. 주의: PFA 독성이 있다. 그것으로 작업 하기 전에 물질 안전 데이터 시트를 읽어 보시기 바랍니다. 장갑, 안전 안경 착용 해야 하 고 항상 증기 두건 내부 솔루션을 떠나.</li>
</ol>3. 준비 형광 나노 서 스 펜 션
<ol><li>Atto 488 NHS 에스테 르 단백질 나노 레이블 ( 테이블의 자료를 참조) 또는 제조업체의 지침에 따라 적절 한 형광 성 염료.</li>
	<li>2 mg/mL의 농도에서 0.1 M 탄산 버퍼에는 나노 입자를 resuspend.</li>
	<li>2 mg/mL에 디 메 틸 아민 무료 sulfoxide (DMSO)에 거 488 NHS 에스테 르 분해. 라벨 효율 (3.7-3.8 단계)을 확인 하는 10 µ L의 약 수를 유지 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 감동으로는 나노 입자와 1:2 (단백질: 염료)의 어 금 니 비율에서 Atto 488 NHS 에스테 르를 혼합.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여 레이블이 지정 된 나노 입자를 회전 시키십시오, 제거는 상쾌한 고 라벨 효율 (3.7-3.8 단계)을 확인 하.</li>
	<li>Vortexing 및 아래로 pipetting으로 1 mL의 0.1 M 탄산 버퍼에 resuspending에 의해 레이블이 지정 된 나노 입자를 씻어. 다음 실 온에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다. 5 회 3.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 튜브에 0.1 M 탄산 버퍼의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 aliquots 형광 나노 입자의 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (30 aliquots). 실 온에서 10 분 동안 8000 x g 에 아래로 회전, 삭제는 상쾌한 고 빛 으로부터 보호-80 ° C에 저장 합니다.</li>
	<li>
Microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 라벨 효율성을 측정 합니다.
	<ol>
<li>원래 거 488 솔루션 단계 3.3에서에서 유지의 1 µ L을 추가 (예를 들어, 볼륨 비율에 따라 1시 20분) DMSO에 희석. 이것은 단계 3.4에서 단백질 나노 입자와 거 488 믹스의 어 금 니 비율을 얻을 하는 데 사용 하는 볼륨입니다.</li>
		<li>3.5 단계에서 라벨 반응에서 저장 된 상쾌한의 1 µ L를 가져가 라. 흡수 (abs) 측정 = 501 nm. 라벨의 백분율은: (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58366/58366eq1.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 전에 나노 서 스 펜 션 1 x PBS 솔루션을 사용 하 여 원하는 농도에서 준비 합니다.</li>
</ol>4. 제 브라 Anesthetization 및 구강 삽 관 법
<ol><li>빠른 물고기 (&gt; 0.5 g) 이상 48 h 소장을 실험 하기 전에.</li>
	<li>하룻밤 순응12수 있도록 실험 전에 실험 탱크 (6 패) 물고기 (12 생선)을 이동 합니다.</li>
	<li>회오리 잘 나노 솔루션 (예: 2500 rpm 및 30 s) 보호 바늘에 연결 된 주사기에 원하는 양의 나노 서 스 펜 션 (예를 들어, 20-50 µ L)를 그립니다.</li>
	<li>화난된 150 mg/L MS에서에서 장소 물고기-222 솔루션 (섹션 2 참조) 그들은 탱크의 바닥에 가라앉을 때까지 꼬리 핀치;에 응답 하지 않는 이 과정에는 5 분 미만 걸립니다.</li>
	<li>신속 하 게 젖은 플라스틱 쟁반에 그물과 마 취 물고기를 전송, 바늘 얼굴과 구강 삽 관 법을 즉시 시작 하 가로 동물을 찾으시는.</li>
	<li>조심 스럽게 한 손으로 물고기를 지원 하 고 보호 된 바늘을 사용 하 여 다른 손으로 입을 열어. 부드럽게 열고 입에서 약 1 cm 식도 아래로 바늘을 삽입 합니다. 참고: 연산자는 피 펫 팁의 끝은 길 통과 하는 때 약간의 저항을 느낄 수 있습니다. 알아서 하지 각도 아가미 구멍 수 있습니다 너무 많은 바늘 항목.</li>
	<li>천천히 물고기를 나노 입자 현 탁 액을 주입. 정지 아가미 또는 입을 통해 밖으로 흐름 하지 않습니다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>부드럽게 바늘을 제거 하 고 복구 탱크 (섹션 2 참조)에 물고기를 놓습니다. 복구는 일반적으로 1 분 이내 소요 됩니다.</li>
	<li>신중 하 게 어떤 이상에 대 한 물고기를 확인 하십시오 (예를 들어, 아가미에 출혈 구멍 뚫 기의 표시 이다).</li>
	<li>일단 물고기, 회복 실험 탱크에 그들을 반환 합니다.</li>
</ol>5. 제 브라 내장 해 부
<ol><li>지정 된 기간 후 게시 삽 관 법 (예를 들어, 5 h / 24 h), 장소 300 mg/L MS에 그물을 사용 하 여 물고기-안락사 (섹션 2 참조)에 대 한 222 솔루션. operculum 이동 중지 하 고 아무 꼬리 핀치 반사는 다는 것을 확인 하십시오. 5 분은 일반적으로 충분 합니다.</li>
	<li>그물을 가진 안락사 동물을 선택 하 고 필터 종이에 그것을 배치. 참고: 필터 종이 소장을 따라 접착제 조직을 제거에 대 한 매우 유용 합니다.</li>
	<li>날카로운 해 부가 위를 사용 하는 operculum에 항문에서 세미 원형 절 개 및 오픈 절 개 괜 찮 핀셋을 사용 하 여 확인 합니다. 내장의 양쪽 끝을 잘라, 모든 내부 장기를 꺼내와 필터 종이에 그들을 배치. 주의: 세포 대사와 죽음을 줄이기 위해 신속 하 게 작동 합니다. 참고: 또는, PBS에 얼음에 접착제 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>(앞쪽 후부 장 세그먼트) 방향을 유지 하 고 그것을 밖으로 기지개 하는 내부 장기에서 내장을 분리 합니다. 일반적으로, 내장의 앞쪽 세그먼트는 후부 세그먼트 보다 넓은. 내장의 모든 해 부 할 때를 돌 봐. 참고: 후부 끝은 아주 작은 물고기에 연약한 고 끊다 수 있습니다, 특히 동물에서에서 &lt; 0.7 g.</li>
	<li>소장에서 접착제 조직 분리 하기 위해 핀셋으로 필터 종이에 소장 롤.</li>
	<li>다양 한 다운스트림 분석 (섹션 6, 7, 8)에 대 한 소장을 준비를 진행 합니다.</li>
</ol>6. Cytometry 장 세포 준비
<ol><li>0.15% 콜라 솔루션 (섹션 2.4 참조)의 aliquots 사전에 준비 합니다. 참고: 계속 하기 전에 실내 온도에 Aliquots 이어야 한다.</li>
	<li>옵션: 단계 5.5에서에서 계속, 슬릿 오픈 소장 경도 하 고 1x PBS로 세척.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여, 0.15% 콜라 솔루션으로 가득 2 mL 원심 분리기 튜브에 내장을 놓습니다.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 수직 실험실 회전자에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>100 µ m 셀 거르는 50 mL 원심 분리기 튜브 지원에 소장을 놓습니다. 50 mL 원심 분리기 튜브에 샘플을 통해 흐름을 수집 1 x PBS로 3 번 세척 5 mL 주사기 플런저와 소장을 휴식.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분, 400 x g 에서 50 mL 원심 분리기 튜브 원심</li>
	<li>신중 하 게 일부는 점액에 연결 될 수 있습니다, 셀을 잃지 않는 하는 동안 상쾌한의 대부분에서 피 펫.</li>
	<li>Resuspend 1 x PBS의 500 µ L 원심 분리기 튜브의 하단에 장 세포와 cytometry 분석까지 얼음에 계속</li>
	<li>5 mL로 30 µ m 셀 필터를 통해 필터 샘플 하단 튜브 cytometry에 대 한 라운드.</li>
	<li>매개 변수 (예를 들어, 분석에 대 한 셀의 수, 관심 지역, 전압 보상, 검출기의 선택) cytometer 장비에 설정 (자료 참조).</li>
	<li>즉시 분석에 사용13의 지침에 따라는 cytometer 세포.</li>
</ol>7. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 내장 Cryosections 준비
<ol><li>플라스틱 몰드 채우기 ( 재료의 표참조) 절반 볼륨 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물.</li>
	<li>신중 하 게 장소 단계 5.5에서에서 해 부 후에 즉시 계속, 플라스틱 형 소장. 내장은 완전히 O.C.T. 화합물에서 포함 된 다는 것을 확인 하십시오. 필요한 경우, 플라스틱 형에 더 O.C.T. 화합물을 추가 합니다. 참고: 그것은 쉽게 자연 방향을 따라 복합 O.C.T.에 "Z" 모양으로 소장을 배치 하 고 좋습니다.</li>
	<li>(1 분 미만) 불투명가 될 때까지 드라이 아이스에 플라스틱 금형을 놓습니다.</li>
	<li>장기간 사용 하거나 즉시 다음 절차를 사용 하 여 프로세스에 대 한-80 ° C에서 플라스틱 금형을 저장 합니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>10 µ m 섹션 또는-20 ° c.에 있는 cryostat를 사용 하 여 적절 한 간격으로 냉동된 내장 슬라이스</li>
	<li>슬라이드에 좋은 브러쉬 내장 섹션을 수집 합니다.</li>
	<li>4%에서 슬라이드를 담가 PFA 실 온에서 15 분에 대 한 예제를 해결 하기 위해. 주의: PFA 독성이 있다. 그것으로 작업 하기 전에 물질 안전 데이터 시트를 읽어 보시기 바랍니다. 장갑, 안전 안경 착용 해야 하 고 항상 증기 두건 내부 솔루션을 떠나.</li>
	<li>슬라이드 1 x PBS, 10 분으로 3 회 씻는 다.</li>
	<li>설치 매체의 한 방울을 추가 하 고 장소는 coverslip 표본. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>적절 한 배율에 confocal 현미경 샘플을 관찰 합니다.</li>
</ol>8. 실시간 정량 pcr (RT-정량) 소장 준비
<ol><li>단계 5.5에서에서 계속, 극저온 유리병에 내장을 넣어 하 고 빠르게 사용까지 액체 질소와-80 ° C에 게 소장을 동결. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>균질, 추가 200 µ L 2% (v/v)의 냉장 1-Thioglycerol/균질 솔루션 ( 재료의 표참조) 또는 대체 균질 솔루션 내장 샘플을.</li>
	<li>신속 하 게 작업, 얼음에 내장 샘플 균질 아니 보이는 조직까지 (25-30000 rpm 설정) 빠른 속도로 실험실 균질 화기 파편 남아 있다. 5를 3 번 s 일반적으로 충분 하다.</li>
	<li>상업을 사용 하 여 RNA를 분리 ( 재료의 표참조) 키트 제조 업체의 지침14 또는 적당 한 다른 방법. 필요에 따라 장기간 사용-80 ° C에서 RNA를 저장 합니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>15 분 광 광도 계 사용 하 여 RNA 농도 계량 하 고 RNA 분석기16를 사용 하 여 품질을 평가 합니다.</li>
	<li>1 µ g 또는 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 cDNA의 적절 한 금액을 준비 합니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 정량 분석을 위한 MIQE 지침17을 따르시기 바랍니다.</li>
	<li>관심사의 유전자/s에 대 한 적절 한 뇌관 쌍을 디자인 합니다.</li>
	<li>적합 한 참조 유전자를 선택 하 고 실시간 정량 검출에 의해 각 유전자의 표현 분석 상업을 사용 하 여 시스템 키트 (자료 참조). 참고: 예를 들어 정량 플레이트의 각 잘 10 µ L의 최종 볼륨에서 SYBR 녹색 supermix의 5 µ L, 0.5 µ M 뇌관, 희석된 cDNA의 2.5 µ L 및 1.5 µ L의 물 추가 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 아무 경쟁 관심사 존재 선언 합니다.

이 프로토콜은 Collymore 그 외 여러분 에 의해 구강 삽 관 법에 대 한 앞에서 설명한 방법의 개선 4 우리의 프로토콜 구강 삽 관 법 방법 자세히 설명 하 고 다운스트림 분석에 대 한 내장의 준비를 포함 한다. 우리의 방법은 사업자 사이 많은 변화 없이 빠르게, 전체 프로토콜을 수행 하는 한 사람을 허용 하는 물고기 조작 속도를 향상 시킵니다. 우리의 이전 프로토콜의 주요 차이점은 우리 복지에 대 한 동물의 관찰에 의해 뿐만 아니라 구강 삽 관 법 실험의 성공을 평가 하는 (예를 들어, 아무 출혈)와 확인 하 여 뿐만 아니라 관리, 액체의 누설에 대 한 다운스트림 분석 (cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량)를 사용 하 여 대 장의 생리 활성 나노의 이해. 우리는 intubated 붙일 레이블된 나노 입자 소장에서 발견 된 것을 보여줍니다.
실용적인 측면에서 삽 관 법 장비...

이 문서의 목표는 깊이에 유용한 연결 된 다운스트림 절차 함께 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 간단한 방법 설명. 제 브라를 사용 하 여 구강 삽 관 법의 전염병 역학, 구강 백신/immunostimulant, 마약/나노 통풍 관 및 효능, 장내 점 막 면역 연구에 실용적인 모델 되고있다. 예를 들어 zebrafish 구강 삽 관 법 진 균 marinum 고 진 균 peregrinum 감염1의 연구에 사용 되었습니다. Lovmo 외. 또한 나노 입자 및 M. marinum 는 위장 지역 성인 zebrafish2를 제공을 성공적으로이 모델을 사용. 첸 외. 마약, 나노 입자에 의해 캡슐화 보여 zebrafish 구강 삽 관 법을 사용 하는 또한 때 관리를 통해 위장 관의 혈액 두뇌 방 벽3에서 수송 되었다. 이 저자 수행 Collymore 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 gauvage 방법에 따라 삽 관 법 몇 가지 수정 4 . 그러나, 그들은 구두 삽 관 법 절차를 설명 하는 매우 상세한 프로토콜을 제공 하지 않았다. 여기, 우리 Collymore 외 에 성인 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 방법 제시 4 우리는 더 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량 소장 관련 다운스트림 분석에 대 한 준비 포함.
소장 및 특히 그것의 점 막 감염에 대 한 방어의 첫 번째 라인 및 양분 통풍 관5의 주 사이트입니다. 상피 세포와 점 막 장벽 내에서 항 원 제시 세포 위험 신호 인식 때 즉시 타고 난 면역 반응은 트리거됩니다. 다음으로, 매우 구체적인 적합 한 면역 반응 T와 B 림프 톨6,7으로 설정 됩니다. 구강 백신의 개발 백신에 현재 초점 지역 이다. 이러한 백신 노출된 사이트 점 막 관련 림프 조직 (맥 아)8,9에 면역 세포의 특정 응답 때문에 유기 체를 보호 하기 위해 효과적인 도구 것입니다. 양식, 점 막 백신 주사 백신에 비해 분명 장점이 있다. 그들은 보다 적게 노동 집약 대량 예방 접종에 대 한 실용적, 물고기, 보다 적게 스트레스가 많은 있으며 젊은 물고기를 관리할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 점 막 백신 후보자 없이 구강 환경에서 변성 되 고 두 번째 직감 세그먼트를 도달 해야 한다. 그들은 또한 항 원 제시 세포 (Apc) 로컬 및/또는 조직의 응답10유도 하에 액세스 점 막 방 벽을 교차 해야 합니다. 따라서, 후보 구두 항 원 및 그들의 배달 시스템을 함으로써 점 막 통풍 관의 테스트, 갖는, 면역 반응 뿐만 아니라에 필수적입니다 구강 백신의 개발.
생물 의학 맥락에서 후 구강 삽 관 법은 성장 관심사의 이다 화합물의 생물 학적 효과 테스트 하는 모델을 개발. 내장의 해 부 및 생리 기능의 많은 포유류와 나폴레옹 물고기11bilaterian 계보 사이 보존 됩니다. 다운스트림 분석에 연결 하는이 구두 삽 관 법 모델 생물 의약품에 대 한 테스트 땅 뿐 아니라 인간의 생물학으로 통찰력을 제공 하는 도구 일 수 있다 또는 다른 비보에화합물.
구강 삽 관 법 프로토콜 성공적으로 물고기는 높은 생존 율과 무게 1 g, 단백질 나노 입자 현 탁 액의 최대 50 µ L를 관리 예를 들어, 하나의 연산자에 의해 수행할 수 있습니다. 절차는 간단 설정 하 고 빠른; 1 시간에 30 물고기를 intubated 수 있습니다. 내장 준비를 위한 프로토콜은 후속 분석을 위한 질 세포 및 조직 샘플을 제공 하는 열쇠입니다. 다운스트림 결과의 예는 장 통풍 관에 관련 된 데이터를 취득 및 정량에 대 한 품질 RNA 격리 프로토콜의 유용성을 표시 하는 주어진 다. 프로토콜 내장에서 구두 prophylactics의 역학 또는 다른 화합물을 테스트 하는 적합 한 모델을 필요 들을 잘 사용 될 것 이다.

<table><tbody><tr><td>실리콘 튜브</td><td>Dow Corning</td><td>508-001</td><td>0.30 mm 내경 및 0.64 mm</td></tr><tr><td>외경 Luer lock needle</td><td>Hamilton</td><td>7750-22</td><td>31 G, Kel-F Hub</td></tr><tr><td>Luer lock syringe</td><td>Hamilton</td><td>81020/01</td><td>100 &mu; L, Kel-F 허브</td></tr><tr><td>필터링 피펫 팁</td><td>Nerbe Plus</td><td>07-613-8300</td><td>10 &mu; L</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>시그마 알드리치</td><td>E10521</td><td>파우더</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>시그마 알드리치</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>여과지&nbsp;</td><td>Filter-Lab</td><td>RM14034252</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Dulbecco의 변형된 독수리 매체</td></tr><tr><td>페니실린과 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 필터&nbsp;</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326 (Wolflabs)</td><td>30 &마이크로; 2 mL 리저버가 있는 메시 크기 필터</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 화합물</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 금형 냉동 절제용</td><td>SAKURA</td><td>4557</td><td>일회용 비닐 몰드. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>10149870</td><td>SuperFrost Plus 슬라이드</td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Labbox&nbsp;</td><td>COVN-024-200</td><td>24&급성; 24mm</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Atto-488 NHS 에스테르</td><td>시그마-알드리치</td><td>41698</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>맥스웰 RSC SimplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td></td></tr><tr><td>1-티오글리세롤/균질화 솔루션</td><td>Promega</td><td>Maxwell RSC simplyRNA 조직 키트 내부</td><td>20 &mu 추가; l 1-Thioglycerol에서 1 mL 균질화 용액 (2%)</td></tr><tr><td>수직 실험실 회전자&nbsp;</td><td>Suministros Grupo Esper</td><td>10000-01062</td><td></td></tr><tr><td>크라이오스타트</td><td>라이카&nbsp;</td><td></td><td></td>CM3050S</tr><tr><td>Homogenizer</td><td>KINEMATICA</td><td>Polytron PT1600E</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACS Canto</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 라운드 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>흄 후드</td><td>Kottermann</td><td>2-447 BST</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>분광 광도계</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td><td>Agilent</td><td>G2939A</td><td>RNA 바이오분석기</td></tr><tr><td>맥스웰 인스트루먼트</td><td>Promega</td><td>AS4500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 실시간 PCR&nbsp; 감지 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>iTaq 유니버설 SYBR 그린 슈퍼믹스 키트</td><td>Bio-rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>375418 CryoTube 바이알</td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td>Fluoroshield with DAPI</td></tr></tbody></table>

성인 zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

대부분 병원 체 유기 체 그들의 점 막을 통해 침입 한다. 이것은 생선에 특히 사실 그들은 지속적으로 미생물이 풍부한 물 환경에 노출 되는. Immunostimulants 또는 백신, 전염 성 질병에 대 한 면역 시스템을 활성화 하는 구두 납품을 위한 효과적인 방법을 개발 하는 것이 매우 바람직하다입니다. 예방 도구를 고안, 좋은 실험 모델의 성능을 테스트 필요 합니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 방법 및 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석에 대 한 소장을 준비 하는 절차의 집합을 보여줍니다. 이 프로토콜, 우리가 정확 하 게 동물을 해치지 않고 약 1 g을 간단 하 고 신속 하 게, 무게 물고기 50 µ L까지 볼륨을 관리할 수 있습니다. 이 방법은 삽 관 법 후 장 점 막 및 로컬 사이트에 같은 생물 의약품의 immunomodulatory 용량 붙일 이라는 화합물의 직접 vivo에서 이해를 탐험 수 있습니다. 장 조직의 confocal 현미경 검사 법, 정량, 조직학, cytometry 등 다운스트림 메서드를 결합해 서, 우리는 immunostimulants 또는 예방 접종 수 있는 방법을 장 점 막 방 벽을 교차, 통과 lamina propria 이해할 수 있다 고 장내 점 막 면역 시스템에 효과 발휘 하는 근육에 도달 합니다. 모델 후보 구두 prophylactics 및 전달 시스템 또는 로컬 효과 있는 구두 관리 생리 활성 화합물의 테스트 사용 될 수 있습니다.

제 브라 (중량 평균: 1.03 ± 0.16 g) 혼합 섹스 했다 성공적으로 intubated 다른 재조합 단백질 나노 입자 (세균 포함 시체)가 우리 집에서 만든 구강 삽 관 법 장치 (그림 1)를 사용 하 여 함께. 우리는 성공 구강 삽 관 법을 수행 하 고 낮은 평균 비율 사망률 (6.8%) (표 1)입니다. Zebrafish 되었고 중 intubated 30 µ L 또는 나노 입자 현 탁 액의 50 µ L 사망률 24 h 게시물 삽 관 법 내에서 산출 되었다. 실험 두 연산자에 의해 수행 되었다, R 작업 제이 보다 zebrafish 구강 삽 관 법을 덜 경험을 했다 심지어 새로운 연산자 독립적으로 수행할 수 없는 구강 삽 관 법을 보여준 결과 실험 쉽게이 프로토콜에 의해 높은 생존 율을 달성. 우리의 경험에서 최적의 물고기 크기 1 g, 하지만 우리는 성공적으로 intubated...

생물 학적;와 intubating 성인 zebrafish를 프로토콜에 설명 합니다. 그리고 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량에 대 한 소장을 준비 합니다. 이 메서드는 관리를 장의 글귀와 로컬 면역 자극을 갖는 생리 활성 화합물의 수 있습니다. 그것은 구두 prophylactics의 장 역학 테스트 관련이 있습니다.

성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

이 방법은 점막 백신학 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 이러한 생물학적은 삽관 후 로컬 사이트에서 면역 체계를 조절하는 방법과 같은 장 점막 이생물을 섭취하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 설정하는 것이 간단하고 빠르며 사망률이 낮다는 것입니다. 이 방법은 점막 백신학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.또한 화학 물질, 독성 또는 병원균과 같은 다른 화합물에 적용 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 구강 삽관 및 장 해부 단계에서와 같이 중요하며, 삽관에서 얼룩말물고기를 다치게하고 사망을 일으킬 수 있기 때문에주의해야합니다. 해부에서, 장의 끝은 매우 훌륭하고 깨지기 쉽습니다.31 게이지 Luer 잠금 바늘에 약 1센티미터의 미세 실리콘 튜브를 놓습니다. 멸균 10 마이크로 리터 필터 파이펫 팁을 잘라 미세 한 끝을 가지고, 칼집으로 실리콘 튜브 위에 배치. 먼저 바늘 장치를 100 마이크로리터 루어 락 주사기에 부착하십시오.먼저, 실험 전날 밤 실험 탱크로 물고기를 이동한다. 준비된 나노입자 용액을 잘 소용돌이시키고, 서스펜션의 원하는 부피를 끌어낼 수 있다. 물고기를 안전하게 마취한 후 그물을 사용하여 물고기를 젖은 플라스틱 트레이로 빠르게 옮기습니다.바늘을 향하도록 동물을 수평으로 향하게 합니다. 한 손으로 물고기를 조심스럽게 지지하고 보호 된 바늘로 입을 엽니다. 그런 다음 입개시 약 1센티미터까지 식도 아래로 바늘을 부드럽게 삽입합니다.바늘이 얼마나 멀리 가야하는지 보기가 어렵고 이것은 연습의 문제입니다. 바늘이 멈출 때 바늘을 느끼고 바늘을 조작하면 장치를 조금 더 삽입할 수 있는 올바른 각도를 찾을 수 있습니다. 나노 입자 현탁액을 물고기에 천천히 주입하여 현탁액이 아가미 나 입을 통해 바깥쪽으로 흐르지 않도록합니다.그 후 바늘을 부드럽게 제거하고 물고기를 복구 탱크에 넣습니다. 물고기가 회복되는 동안, 어떤 이상에 대한 물고기를 모니터링. 물고기가 회복되면 실험 탱크 중 하나로 되돌아갑니다.텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 안락사한 후, 필터 용지에 물고기를 놓습니다. 날카로운 해부 가위를 사용하여 항문에서 오퍼큘럼으로 반원형 절개를 하고 미세 핀셋으로 절개를 엽니다. 그런 다음 장의 양쪽 끝을 자르고 모든 내부 장기를 꺼내 필터 용지에 놓습니다.다음으로, 내장을 내부 장기에서 분리하고, 모든 장을 얻기 위해 주의를 기울여 스트레칭합니다. 마지막으로 핀셋을 사용하여 필터 용지에 내장을 굴려 접착제 조직을 분리합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 혼합 된 성의 제브라피쉬는 성공적으로 다른 재조합 단백질 나노 입자로 삽관했다.수제 구강 삽관 장치를 사용하여 사망률의 낮은 평균 비율을 달성했습니다. 재조합 TNF 알파로 만든 형광 나노 입자 포함 체의 전달을 평가하기 위해, 세포 측정 분석이 수행되었다. 형광 세포의 총 양은 관적 후 5 시간 및 24 시간 모두 대조군에서보다 나노 입자 삽관 된 그룹에서 상당히 높았다.관착 장비는 저렴하고 정확하며 재사용이 가능합니다. 전체 관착 절차는 한 작업자에 의해 매우 신속하게 수행 할 수 있으며, 중요한 것은, 방법은 다른 연산자 간에 일치합니다. 다운스트림 분석과 우리의 삽관 방법의 조합은 경구 백신 개발에 이상적 일 수 있습니다.

oral-intubation-adult-zebrafish-model-for-evaluating-intestinal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal 주사를 보여줍니다. 우리는 Micro4 컨트롤러와 UltraMicroPump III에 의해 통제 10 μl NanoFil microsyringe을 사용합니다. 이 예제는 마취로 찬물의 사용을 포함합니다.

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

본 연구에서는 표준 배아 미세주입 및 실체현미경 장비를 활용한 제브라피쉬 치어의 새로운 미세강제투여(microgavage) 방법을 제시합니다. 우리는 미세강제투여가 다양한 물질을 제브라피쉬 치어의 장관 내로 정밀하게 정량 투여하는 데 유용한 안전하고 효율적인 기술임을 입증합니다.

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

이 비디오는 생체 활성 화합물의 장 흡수를 평가하기 위해 장을 분리하는 기술을 설명합니다. 이 샘플에서는 면역 자극제의 흡수를 분석하기 위해 성체 제브라피시의 장을 분리할 것입니다.

성체 제브라피시 장 해부: 화합물 흡수를 분석하는 기술

이 동영상은 성체 제브라피시를 구강 삽관하여 실험 화합물을 식도에 투여하고 장 흡수를 모니터링하는 기술을 보여줍니다. 이 방법은 장 내 경구 예방제 또는 기타 화합물의 역학을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다.

실험 화합물을 투여하기 위한 성인 제브라피쉬의 구강 삽관

동물 모델로 제브라 피쉬의 사용 증가 화합물 및 솔루션의 알려진 양의 전달을위한 효과적인 방법의 개발이 필요합니다. 아래에 설명 된 위관 절차는 성인 zebrafish의를 안전하고 효율적으로, 안정적으로 솔루션 정확한 양의 경구 제공 할 수 있습니다.

성인 Zebrafish의를 Gavaging

성인 zebrafish (Danio rerio)에서 독 소 루비 유발 심근 모델을 생성 하는 메서드는 여기에 설명 되어 있습니다. 복 주입의 2 개의 다른 방법을 제시 하 고 다른 실험적인 그룹 사이 변이 줄이기 위해 조건을 설명.

성인 제 브라에서 독 소 루비 유발 심근 모델

이 프로토콜의 목표 높은 처리량 패션에 애벌레 zebrafish의 용기를 통해 붙일 레이블 음식의 통과 시간을 측정 하는 것입니다.

애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정

성체 제브라피시에서 새로운 복강내(IP) 주사 방법에 대해 설명합니다. 독소루비신(doxorubicin)과 같은 독성 화합물을 취급할 때 이 절차는 이전에 보고된 두 가지 IP 방법보다 더 효과적입니다. 이 기술은 제브라피시 모델에 대한 경험이 제한된 연구원들이 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었습니다.

성체 제브라피시의 복강 내 주사 기법으로 신체 손상 및 관련 폐사율을 최소화합니다.

여기에서는 성체 제브라피쉬에 세포 또는 약리학적 제제를 정맥 주사하여 세포 생착을 강화하고 치료된 제브라피시의 생존율을 높이기 위한 최적화되고 효과적인 프로토콜을 제시합니다.

성체 제브라피쉬에 최적화된 정맥 주사

이 프로토콜은 행동 실험을 위해 유충 제브라피시에게 휘발성 마취제를 투여할 수 있는 기밀 환경을 조성하기 위한 접근 가능한 방법을 제공합니다.

행동 관찰을 위한 제브라피시 유충에 대한 휘발성 마취제 투여

이 연구는 성체 제브라피시에서 정밀하고 비침습적이며 체질량 기반 경구 약물 전달을 가능하게 하는 젤라틴 기반 급식 방식을 제시합니다. 이 프로토콜은 신뢰할 수 있는 피드 수용과 원리 증명으로서 MK-801의 성공적인 전달을 입증하여 예상한 행동 효과를 가져왔습니다.

어류의 경구 약물 전달을 위한 간단하고 정밀한 사료 기반 접근법

학습하세요 성인 제브라피시의 경구 삽관법을 통해 생리활성 화합물의 장 점막 흡수와 면역 반응을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기법은 점막 백신학 연구에 필수적인 도구입니다.

성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

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