Name: Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB40 펩 티 드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 배우세요 MUB40 펩티드를 활용한 호중구 검출 및 활성화 상태 평가 방법을. 이 기술은 살아있는 세포와 고정된 조직에서 염증 반응 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.)에 의해 지원 되었다 고 ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.)를 부여 합니다.

여기에 설명 된 모든 방법을 검토 되었고 CoRC (위원회 회의 드 Recherche 크리니크), CPP (위원회 회의 드 보호 des Personnes), 및 CNIL 프랑스 조직에 의해 승인 (위원회 국립 사회 외 리).
1. 얼룩과 Histopathology 조직에 호 중구 붙일 MUB40 개
<ol><li>Histopathology 위한 조직을 얻기 위해 30 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA)의 적합 한 볼륨에 조직/생 섹션 최대 4 샘플의 두께 따라 h 수정. 고정 동안 4 ℃ 냉장고에서 샘플을 놓습니다. 참고: 다른 고정 방법/타이밍 교체하실 수 있습니다 사용자의 고유한 요구에 따라.<ol>
<li>제거는 PFA 16% 자당 솔루션 샘플, 표지에 충분 한 볼륨을 추가 하 고 하룻밤까지 h 4 4 ° C에서 샘플을 놓습니다.</li>
		<li>16% 자당 해결책을 제거 하 고 완전히 커버 샘플, 충분히 큰 볼륨에서 30% 자당 해결책을 추가 4 하룻밤까지 h 4 ° C에서 그것을 배치.</li>
		<li>30% 자당 해결책을 제거 하 고 종이 타월로 조직에서 솔루션을 초과 떨어져 되 리. 조직 섹션 최적의 절삭 온도 (10 월) 미디어에서 장소와 스냅-2-methylbutane 드라이 아이스-에탄올 목욕 (-72 ° C) 냉각에 동결. (~ 2 분) 후 꽁꽁 얼어, 일단 2 methylbutane에서 블록을 제거 하 고 모든 블록 완료 하 고 장기 보관을 위해 준비 될 때까지 드라이 아이스에 넣어. 장기 저장을 위한-80 ° C에서 냉동된 블록을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>밤 전에 조직 블록 컷,-80 ° C 냉장고에서 그들을 제거-20 ° C 하룻밤 equilibrate에서 그들을 배치 하는.<ol>
<li>cryostat 사용 하 여, 10 월 임베디드 조직 10 ~ 30 μ m 두꺼운 조각으로 잘라내어 높은-품질의 유리 슬라이드에 흡착. 참고: 두꺼운 또는 얇은 조각 실험 요구 사항에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>왁 스 펜 또는 다른 소수 성 방법, 유리 슬라이드에 조직 조각 주위에 상자를 그려와 건조 하자.</li>
		<li>얼룩 솔루션 MUB40의 1:1,000 희석을 수행 하 여 준비-Cy5 (또는 다른 형광 MUB40버전 1 mg/mL 재고 솔루션) 0.1% 사포닌 PBS 솔루션에서. 최적의 최종 MUB40 농도 1 μ g/mL 이어야 한다. 참고: 낮은 최종 농도 사용할 수 있습니다 (0.1-0.01 μ g/mL) 하지만 낮은 신호 강도 발생할 수 있습니다. 주의: 사포닌 분말 호흡 자극을 일으킬 수 있습니다. 캐비닛 또는 보호 지역에서 사포닌의 무게에 있는지 확인 합니다. 트리톤 등 대체 permeabilization 메서드를 사용할 수 있습니다. 제조업체 권장 농도에서 추가 마커를 추가 (예., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, 형광 항 체).</li>
		<li>부드럽게 0.1% 사포닌-PBS의 솔루션으로 유리 슬라이드 3 번 찍어.</li>
		<li>신중 하 게 조직 섹션 주위 멀리 초과 액체 얼룩을 완전히 조직 단면도 커버에 충분 한 얼룩 솔루션을 추가 합니다. 증발을 방지 하 여 실 온에서 1 h에 그것을 품 어 습도 챔버로 슬라이드를 놓습니다. 빛 으로부터 보호 유지.</li>
		<li>부드럽게 0.1% 사포닌 PBS 솔루션 3으로 슬라이드를 찍어 x. 그런 다음, 부드럽게 찍어 PBS 솔루션 3으로 슬라이드 x. 마지막으로, 부드럽게 찍어 소 주 H2O로 슬라이드 3 배. 신중 하 게 슬라이드에서 과잉 액체를 건조.</li>
		<li>장착 매체 (20 mM Tris pH 8.0, 0.5 %N 틸 gallate 90% 글리세롤) 조직 슬라이스 옆의 작은 금액 (~ 20 μ)을 추가 하 고 부드럽게 유리 슬라이드 위에 유리 coverslip 내려 놓 아 라. 부드럽고 고르게는 coverslip 조직 섹션에 누르고는 coverslip의 가장자리 돌출 하는 설치 미디어를 제거 조심 스럽게 종이 타월을 사용 하 여.</li>
		<li>공고히 장착 미디어 있도록 24 h에 대 한 어두운 캐비닛에 탑재 된 슬라이드를 배치 합니다. 또는 1 시간 동안 37 ° C에 탑재 된 슬라이드를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 인수 방법에 따라 형광 현미경에서 조직을 조각 이미지.</li>
</ol>2. 복고풍 링크 MUB40호 중구 활성화의 시각화-Cy5 펩 티 드
<ol><li>인간의 호 중구는 다음 프로토콜을 사용 하 여 얻을. 다음 솔루션을 준비 하 고 무산 소 캐비닛 하룻밤에 그들을 배치. 산소에 노출 호 중구 활성화 하 고 더 유도 세포 죽음16,17시작 됩니다. 참고: 호 중구 수 있습니다 또는 정화 "벤치"에 MUB40-라벨 실험; 그러나, 산소 노출 호 중구 활성화에 영향을 미칠 시작 됩니다 유의 하십시오.<ol>
<li>다음과 같은 솔루션을 준비: 해결 방법 1 [0.9% 염화 나트륨 (NaCl)]: NaCl의 4.5 g H2o. 필터 솔루션의 500 mL를 추가. 해결 방법 2 (dextran 6%): 100 ml 6 g dextran의 NaCl 0.9% 솔루션에 추가. 해결 방법 3 (세척 버퍼): PBS pH 7.2 m m 2의 최종 EDTA 농도에 있는 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 분해. 사용 직전 마지막 BSA 농도 10 %w / v를 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS/EDTA 솔루션에서을 디졸브.</li>
		<li>혈액 컬렉션 튜브 휴식 없이 20 분 650 x g에서 원심</li>
		<li>분리 된 혈액을 방해 하지 않고 무산 소 캐비닛 및 수집 플라즈마 분수 (맨 위) 50 mL 원뿔 튜브에 혈액 컬렉션 튜브를 전송 합니다.</li>
		<li>무산 소 캐비닛 및 작은 공의 혈소판을 휴식 20 분 2900 x g에서 원심 분리기에서 포함 하는 플라즈마 튜브를 제거 합니다.</li>
		<li>수송과 혈소판을 방해 하지 않고 부드럽게 전송할 플라즈마 튜브 다시 무산 소 캐비닛 및 피펫으로 (이 하 "플라즈마"에 게 불리는) 신선한 50 mL 튜브에 혈소판 가난한 플라스마.</li>
	</ol>
</li>
	<li>백혈구에서 붉은 혈액 세포의 분리<ol>
<li>적혈구 (Rbc) 단계 2.1.3에서에서 포함 된 튜브를 사용 하 여., 50 mL 원뿔 튜브 (5 혈액 컬렉션 튜브 내용 50 mL 튜브 당)으로 Rbc를 결합.</li>
		<li>0.9 %NaCl 추가 총 볼륨 44 mL에 도달할 때까지. Dextran 6% (마지막)의 6 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드럽게 반전 튜브 시간 10-20 여 혈액/dextran 혼합물을 혼합. 적어도 30 분 동안 튜브 앙금을 하자.</li>
		<li>침전을 수행 하는 동안 Percoll 솔루션의 4.2 mL 15 mL 원뿔 튜브에 플라즈마의 5.8 mL을 추가 하 여 Percoll 그라데이션을 준비 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합.</li>
		<li>Pipetting 붉은 혈액 세포를 방지 하는 동안는 dextran의 최고 분수를 수집 합니다.</li>
		<li>나사 모자를 강화, 무산 소 상공에서 dextran 튜브를 제거 하 고 10 분 휴식 x 300g에 튜브 원심.</li>
		<li>조심 스럽게 수송과 세포를 방해 하지 않고 무산 소 상공에 다시 튜브를 배치 하 고 pipetting 통해 액체를 제거.</li>
		<li>부드럽게 플라즈마의 1 ml에서에 다시 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 매우 느리게 Percoll 솔루션의 상단에 추가 합니다. 수 위에 셀 pipetting 때 레이어의 혼합을 유도 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
		<li>무산 소 상공 (피하 혼합), 그리고 휴식 없이 20 분 800 x g에서 원심 분리기에서 Percoll 솔루션 튜브를 조심 스럽게 제거. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) Percoll 솔루션 표면에 남아 있을 것 이다 고 호 중구는 Rbc와 작은 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rbc 오염 제거<ol>
<li>버퍼를 세척의 14 ml 700 μ PBS + 10 %BSA 추가 하 여 버퍼 솔루션을 세척의 14 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>무산 소 상공에 다시 Percoll 솔루션 튜브를 놓습니다. Pipetting 통해 Percoll와 PBMCs를 제거 하 고 다시 세척 버퍼 솔루션의 1 mL에 수송과 셀을 일시 중단. 다시 일시 중단 되도록 펠 릿 오염 Rbc 인해 빨간색이 있을 것 이다.</li>
		<li>다시 일시 중단 된 셀 안티-CD235a (glycophorin) 자석 구슬의 200 μ를 추가 하 고 부드럽게 혼합, 최소 15 분의 품 어. 이 단계 그들은 제거 될 수 있도록 자석 구슬 가진 오염 RBCs를 로드 합니다.</li>
		<li>워시 세척의 2 mL와 함께 분리 열 버퍼 3 배.</li>
		<li>분리 열 아래 15 mL 원뿔 튜브를 잡고, 천천히 열 상단의 neutrophil/RBC 혼합 플라스틱. 그들은 통해 흐름 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다. 통해 흐름 해야 흐린 고 때문에 열에 바인딩된 남아 있는 Rbc의 붉은 색을 잃고.</li>
		<li>버퍼는 칼럼의 상단에 세척의 2 개 mL를 추가 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 수집. 2 mL 워시 말까지 흐름 통해 명확 해야 한다, 모든 호 중구 수집 된 상징.</li>
		<li>부드럽게 믹스 하 호 중구의 동등한 배급을 보장 하 고 셀 카운팅을 위한 10 μ를 수집 튜브. 목적을 계산 하는 셀에 대 한 최종 볼륨 note 계산 방법 모든 표준 셀 셀의 총 개수를 열거 합니다.</li>
		<li>무산 소 상공에서 호 중구 튜브를 제거 하 고 원심 휴식 20 분에 대 한 300 x g에서 호 중구.</li>
		<li>무산 소 상공에 다시 sedimented neutrophils 놓고 pipetting 통해 세척 버퍼를 제거 합니다. 다시 10의 최대 셀 밀도 플라즈마에 호 중구 펠 릿을 중단7 PMN/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>순화 된 호 중구 및 시각화 MUB40 을 사용 하 여 열거<ol>
<li>추가 리 MUB40의 1 μ-Cy5 (1 mg/mL)의 페 놀 레드 없이 Rosewell 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 1 ml. 잘 pipetting으로 혼합.</li>
		<li>이 프로토콜의 목적을 위해 결과 마치 강력한 neutrophil 활성화 시, N-formylmethionyl-leucyl-페닐알라닌 (FMLP) 추가 개설 되었습니다. 1 μ m의 FMLP RPMI/RI-MUB40추가-Cy5 튜브 및 pipetting 통해 믹스 고 아래로. 참고: 각 실험 절차가이 시점에서 해결 되 고 질문에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>1 mL RPMI/RI-MUB40전송-유리 하단 현미경 요리 Cy5/FMLP 혼합물. 이 접시에 순화 된 셀 106 총 호 중구에의 볼륨을 추가. 부드럽게 pipetting으로 혼합.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경에 접시를 놓고 이미지 수집을 시작 합니다. 예를 들어 FMLP 또는 박테리아 같은 neutrophil 활성화 시 약의 추가 이전 초기 이미지를 수집 하는 것이 좋습니다. 이 예제에서는 시작 RPMI/RI-MUB40의 수집-Cy5/호 중구, 나중 timepoint neutrophil 활성화 시 유리 그릇에 플라스틱 그리고 이미지 수집을 계속. 참고: 다음이 단계를 수정 할 수 있다 기반으로 과학적 요구에.</li>
		<li>프로세스는 이미지/시간 lapse 영화로 특정 현미경 사용에 관련 된 인수.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

B.S.M.는 MUB40 특허에 발명자로 표시 됩니다.
MUB40: 유럽 특허 EP11290403.2, 09/09/2011.
RI MUB40: 유럽 특허 EP no. 17306746.3, 11/12/17.

여기, 두 분석 MUB40 펩 티 드 호 중구 염증 및 활성화 연구에 사용 되는 설명 합니다. 우리는 어떻게 MUB40 neutrophils histopathology 섹션에 제시 하거나 라이브 정화 중 성구를 사용 하 여 그들의 활성화 상태를 밝힐 수 있습니다 보여줍니다. 착 색 시 약으로 MUB40 을 사용 하는 중요 한 단계는 다른 형광 탐지 방법으로 동일 합니다. 형광 신호 호환성 및 적절 한 세척 단계 배경 얼룩 제거 내용이 되도록 주의 해야 합니다. 좋은 착 결과 달성 하기 위해 가장 중요 한 고려는 현미경, 유리 슬라이드/커버 전표 그리고 조직 단면도의 품질. 라이브 정화 중 성구를 볼 때 가장 중요 한 단계는 자체 정화 과정에 있습니다. 호 중구 민감합니다 그리고 다양 한 다른 신호에 의해 활성화 될 수 있다. 실험 의미 있는 결과가 있도록 해야 주의 사용 될 준비가 될 때까지 비활성 정제 호 중구를 유지 하. 이 호 중구 산소 노출을 제한 하는 무산 소 ...

호 중구는 타고 난 면역 시스템의 주 무기 중 하나 이며 정기적으로 시체 주위 염증의 사이트에 보충. 호 중구의 연구는 그들의 짧은 수명에은 생체 외에서 (8 h 미만) 및 제한 된 검색 도구 기저 조건 또는 활성화 후 크게 손상 되었습니다. 여기, 우리 고정/permeabilized 샘플에 포유류 호 중구의 광범위 하 고 구체적인 검색 잘 테스트 프로토콜을 제시. 우리는 또한 라이브 neutrophils MUB40얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 라이브 호 중구 얼룩 프로토콜을 사용 하는 타이밍 및 호 중구 활성화의 위치 수 수 정확히 지적. 이 프로토콜은 호 중구 활성화 또는 립 출시를 공부 하고자 연구에 이상적입니다. 넘어 그들의 항균 기능, 호 중구 지금 immunomodulatory 셀 다양 한 질병 및 면역 반응 (타고 난 및 적응형)1,2에 참여 감사 합니다. 호 중구는 가장 염증 성 조직, 감염 된 조직, 염증 성 종양3, IBS, Crohn의 플레어4, 그리고 류 마티스 관절염 (synovia 등 비 감염 성 염증의 지역에서 높은 숫자에 RA) 환자5. 호 중구 미리 형성 된과 립 명명 된 azurophil (α), 특정 (β1), 차 (β2)과 립 분 비 소포 (γ)6의 4 개의 클래스를 포함 합니다. 염증 성 사이트에 마이그레이션, 채용된 호 중구 활성화 되 고 순차적으로 분 비과 립 내용 (접착, 항균 성 화합물 및 immunomodulatory 분자 구성), 추가 모집을 추진 하 고 있으며에 기여 감염 확인 (뿐만 아니라 호스트 조직 손상)7. 호 중구는 간주 하는 동안 거기까지 타고 난 면제의 중요 한 측면은 공부, 사용할 수 있는 몇 가지 탐지 시 약 그리고 생활 호 중구의 활성화 상태를 평가 하기 위해 사용할 수 있는 적은.
Ly-6 G2 등 특히 기저 조건 (예: myeloperoxidase 호 중구과 립에 저장 된 단백질 세포 표면 노출 된 항 원에 대해 생성 하는 단일 클론 항 체에 의존 하는 중 성구 검색의 현재 방법 lactoferrin). 단일 클론 항 체의 장점에는 그들의 강한 바인딩, 감도, 및 다양 한 분석 결과 조건 다양성 포함 됩니다. 그러나, 특히 단일 클론 항 체 및 안티-Ly-6 G을 사용 하 여 여러 가지 단점이 있습니다. 이러한 단점은 포함 특이성, Ly-6 G은 골에 호 산 구는;를 포함 하 여 모든 granulocytes 골수성 세포의 대부분에 존재 따라서,이 표시와 함께 호 중구 호 산 구는에서 해독 더 많은 단지8에 접근 해야 합니다. 단일 클론 항 체와 다른 자주 있 네 개 이상의 동물 종 비교 연구를 어렵게 하 그들의 자주 제한 호스트 특이성 범위입니다. 항 체 탐지 방법, 라이브 셀 또는 vivo에서 사용 하는 경우에 특히의 세 번째 단점은 세포의 기능을 방해 하거나 세포 활성화로 이어질 그들의 잠재력 이다. 예를 들어 관리의 안티-Ly-6 G 마우스 호 중구 감소 및 일시적인 호 중구 감소 증9에 일반적으로 적용 됩니다. 그것은 또한 항 체 주입 호 중구 antitumor 기능10을 자극 수 있습니다 입증 되었습니다. 마지막으로, 호 중구의 항 체 탐지는 셀의 활성화 상태를 공개 하지 않습니다.
우리는 40-아미노 산 펩 티 드 라는 MUB40, 생체 외에서 또는 vivo에서 조건 호 중구 라벨 라이브 neutrophils11의 활성화 상태를 시험 하 수 분석 실험에서에서 사용 될 수 있는 확인 했습니다. MUB40 MUB7012, 원래 점액13,14바인딩할 능력에 대 한 설명 유산 균 reuteri 표면 점액-바인딩 단백질 도메인에서에서 파생 됩니다. MUB40 당화 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 높은 농도에서 존재 하는 상호 작용 합니다. MUB40 histopathology 또는 형광 활성화 된 세포 (FACS) 프로토콜 고정된 호 중구의 강력한 얼룩에 대 한 정렬에 표준 permeabilization 단계를 통해이 립에 노출 될 수 있습니다. 라이브 neutrophils 비활성 상태로 유지 됩니다, MUB40 펩 티 드과 립 내용에서 제외 하 고 셀 할 하지는 표시와 함께 긍정적인 얼룩. 활성화, MUB40 노출된 lactoferrin 바인딩할 하 고 펩 티 드와 강력한 얼룩으로 이어질 수 있습니다. 따라서, MUB40 감염 과정을 따라 매력적인 마커 만들기 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 활성화 된 호 중구 살 바인딩할 수 또한 MUB40 라이브 동물 모델 (예를 들어, 마우스 관절염 모델15)에서 호 중구 염증의 영역을 감지 하는 도구로 사용할 수 있습니다. 이 원고 자세히 어떻게 놓여있는지 MUB40 라는 프로토콜 neutrophils 조직학 조직 및 시험의 시험관에라이브 순화 된 호 중구의 활성화 하는 방법에 공개 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>형광 MUB40 펩타이드(다른 공액 형광단과 함께 사용 가능)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Retro-inverso 형광 MUB40 펩타이드. D-아미노산과 합성되고 프로테아제에 내성(다른 공액 형광단과 함께 사용 가능)</td></tr><tr><td>파르포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>조직학용 고정제</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td> 과도한 PFA 최적 절단 온도 화합물(OCT)<td>을 제거하는 데 사용되는 용액</td></tr><tr><td>Sakura</td> <td>Finetek USA</td><td>4583</td><td>저온 유지 절편 전 조직을 동결하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td>저온 유지 장치 절단 전에 조직을 동결하는 데 사용</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00974</td><td>조직을 동결하기 위해 드라이 아이스 목욕에 사용</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>조직 절단에 사용</td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>하이 정밀 커버슬립</td></tr><tr><td>다코 펜&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>조직 염색 중 액체 손실을 방지하는 데 사용됩니다</td></tr><tr>.<td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>IF 염색을 위한 세포를 투과화하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>Stains DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>알렉사 플루오르 488 팔로이딘&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>결합 액틴</td></tr><tr><td>연장 금 퇴색 방지 마운트제</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>IF 신호 및 광표백 내성 연장</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>다양한</td><td></td><td>IF 슬라이드를 이미지화하는 데 사용</td></tr><tr><td>다양한 Anoxic Cabinet</td><td>다양한</td><td></td><td>살아있는 불활성화 호중구의 정제에 사용</td></tr> 염화<tr><td>나트륨 NaCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>세척 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>MACS BSA 완충액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>세척 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>호중구 정제용 구배</td></tr><tr><td>CD235a 글리코포린 마그네틱 마이크로비즈</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>오염 된 적혈구 LS를 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td> 페놀이없는 호중구 RPMI-1640에서 <td>적혈구 제거에 사용</td></tr><tr><td>Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8755</td><td>호중구 분석에 사용</td></tr></tbody></table>

neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 mub40 펩 티 드

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

여기, 우리 MUB40, 호 중구의 특정 및 3 차과 립에 높은 농도에서 저장 하는 당화 lactoferrin 바인딩 수와 합성된 펩 티 드의 사용을 포함 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이 호 중구 활성화 및 탈과 립에 대 한 분석 결과를 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 방법 뿐만 아니라 고정/permeabilized 조직에 호 중구 얼룩 어떻게 MUB40 는 fluorophore에 직접 활용이 프로토콜 세부 정보를 사용할 수 있습니다. 호 중구 탐지 방법 항상 특정 응용 프로그램에 적합 하지 않은 종의 단일 클론 항 체로 제한 됩니다. MUB40 세포 막 침투 하지 않습니다 하 고 따라서 lactoferrin 비-활성화/비-permeabilized 호 중구에 저장에서 제외 됩니다. MUB40 는 그것을 여러 연구 모델을 포함 하는 연구에서 결과 비교 하는 데 특히 유용 하 게 만드는 광범위 한 호스트 범위에서 lactoferrin 인식의 추가 혜택 중복 시 약의 수를 줄이고 프로토콜을 단순화 통해 단일 단계 얼룩.

MUB40의 결과-얼룩진된 조직 histopathology 슬라이드에서 일반적으로 조직에 걸쳐 흩어져 개별 셀을 공개. MUB40 얼룩 lactoferrin, 호 중구과 립에 존재 하 고로 한정. 따라서, 일반적으로 본 punctate 얼룩 또는 신호의 여러 큰 분리 한 지역에서에서 오고 있다 개별 neutrophils (그림 1). 공동 스테인드 셀 MUB40 신호를 지역화할 수 있도록 DAPI 같은 두 번째 셀 표식 추가 도움이 됩니다. 검색 된 셀의 총 수 시야에 호 중구의 수에 의존 하 고 극적으로 소스 및 면역 반응의 강도에 따라 다를 수 있습니다. 여기은 순화 고정된 인간 호 중구 (그림 1A)와 (그림 1<str...

여기, 선물이 조직학 고정/permeabilized 섹션에서 호 중구의 존재를 감지 하 고 라이브 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 평가 하는 프로토콜. 특히, MUB40 펩타이드 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 바인딩합니다. Permeabilization 또는 호 중구 활성화 통해과 립 내용의 노출 호 중구의 마킹 할 수 있습니다.

Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB40 펩 티 드

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40은 유당페린에 결합하고 지금까지 테스트된 인간 및 모든 포유류 조직 샘플에서 특정 검출을 허용하는 새로운 호중구 마커입니다. MUB40을 가진 호중구를 라벨링은 쉽고 빠르며 구체적입니다. 그것은 지금 우리의 실험실에서 널리 사용 하 고이 기술의 의미는 염증 성 질병의 진단으로 확장.먼저 텍스트 프로토콜에 따라 1, 2, 3개의 솔루션을 준비하고 밤새 해부학 캐비닛에 배치합니다. 그런 다음, 혈장 분획에서 세포를 분리하기 위해 20 분 동안 650g에서 수집 된 혈액의 튜브를 원심 분리합니다. 분리된 혈액을 방해하지 않고 튜브를 무산소 캐비닛으로 옮기고 혈장 분획을 50 밀리리터 원내 튜브로 옮길 수 있습니다.이 후 무산소 캐비닛에서 플라즈마의 튜브를 제거하고 원심 분리기2900 g에서 20 분 동안. 펠렛 혈소판을 방해하지 않도록주의하고, 관을 무산소 캐비닛으로 옮기고 혈소판이 가난한 혈장을 신선한 50 밀리리터 튜브로 피펫합니다. 혈액 수집 관을 사용하여 적혈구를 원추형 50 밀리리터 튜브에 결합합니다.그런 다음 총 부피가 44 밀리리터에 도달할 때까지 0.9%의 염화 나트륨 용액을 추가하고 6밀리리터를 6%dextran으로 추가합니다. 튜브를 10~20회 반전하여 혈액과 덱스네 혼합물을 부드럽게 섞고 튜브가 적어도 30분 동안 퇴적물을 허용합니다. 튜브 퇴적물 동안, 4.2 밀리리터의 퍼콜 용액을 5.8 밀리리터의 플라즈마에 추가하여 퍼콜 그라데이션을 준비하고 튜브를 혼합하는 것을 반전시다.다음으로, 적혈구를 피펫하지 않도록 주의하여, dextran의 최고 분획을 포함하는 호중구를 수집합니다. 나사 캡을 조이고, 무산소 캐비닛에서 덱스네 튜브를 제거하고, 튜브를 300g에서 10분간 원심분리합니다. 펠릿 세포를 방해하지 않도록주의하고, 관은 무산소 캐비닛에 다시 놓습니다.그런 다음 파이펫팅으로 액체를 제거합니다. 플라즈마 의 1 밀리리터에 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 다시 일시 중단된 셀을 Percoll 용액의 상단에 천천히 추가합니다.중성구에서 PBMC를 분리하기 위해 20 분 동안 800g에서 Percoll 용액 튜브를 조심스럽게 제거하고 원심 분리하십시오. 다음으로 텍스트 프로토콜에 따라 14 밀리리터의 세척 버퍼 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 퍼콜 튜브를 해부학 캐비닛에 놓습니다.파이펫을 사용하여 Percoll 및 PBMC를 제거하고 세척 완충액의 1 밀리리터에 펠릿이 함유 된 호중구를 다시 일시 중단하십시오. 다음으로, 재중단된 세포에 자기 구슬 200 마이크로리터를 추가합니다. 셀과 구슬을 15분 이상 부드럽게 혼합하고 배양합니다.그 후, 분리 열을 두 번 씻고, 두 밀리리터의 세척 버퍼를 세척합니다. 기둥 아래 15밀리리터 원뉴얼 튜브를 새로 들고 있는 동안, 열을 통해 호중구 적혈구 혼합물을 천천히 피펫한다. 열에서 의 흐름은 흐리고 붉은 색을 잃어야하며, 남아있는 적혈구에서 호중구의 총 분리를 확인합니다.두 밀리리터의 세척 버퍼를 컬럼 상단에 추가하고 동일한 튜브에서 흐름을 수집합니다. 이 세척이 끝날 때까지 흐름통과가 명확해야합니다. 수집 튜브를 부드럽게 혼합하여 호중구가 고르게 분포되도록 합니다.그런 다음 셀 계수로부터 유량의 10 마이크로리터를 수집했다. 그 후, 무산소 캐비닛에서 호중구 튜브를 제거하고 20 분 동안 300g에서 튜브를 원심 분리하십시오. 퇴적한 호중구를 무산소 캐비닛에 다시 넣고 파이펫팅을 통해 세척 버퍼를 제거합니다.그런 다음 플라즈마에서 펠릿을 다시 중단합니다. PHENol 레드 없이 RPMI-1640 배지의 1밀리리터에 RI-MUB40-Cy5의 마이크로리터 1개를 추가하고 파이펫팅을 통해 혼합합니다. 그런 다음 FMLP 솔루션과 파이펫의 마이크로리터 를 추가하여 혼합합니다.혼합물을 유리 바닥 현미경 접시에 옮김합니다. 그런 다음 접시에 정제 된 세포의 적절한 볼륨을 추가합니다. 마지막으로, 접시를 반전형 형광 현미경으로 놓고 이미지 수집을 시작합니다.이 프로토콜에서, MUB40은 FMLP를 이용한 시뮬레이션 시 호중구 분비를 검출하기 위해 살아있는 세포에 사용되었다. 락토페린을 포함한 과립 함량의 방출의 역학은 시간이 지남에 따라, 여기에 마젠타에서 시각화될 수 있다. MUB40은 고정 호중구에 추가로 사용될 수 있다.여기, 시간 조정 된 시리즈에서 phagocytizing 형광 구슬. 호중구 과립의 내용은 여기에 파란색으로 표시됩니다. 호중구는 초기 시점에서 세포 염색이 거의 또는 전혀 없는 것으로 나타났으며, 점차적으로, RI-MUB40 라벨링은 혈장 막과 비드 표면 모두에서 시간이 지남에 따라 증가하였다.MUB40은 또한 텍스트 수치에 도시된 바와 같이 호중구를 구체적으로 검출하기 위해 고정 염증 조직에 사용될 수 있다. 우리는 여기에 호중구 정화 절차를 설명, 우리의 실험실에서 일상적으로 적용. 다른 모든 방법이 적합, MUB40-Cy5 라벨은 여전히 작동합니다.호중구는 정제 후 MUB40으로 구체적으로 표지될 수 있으며, 또는 환자 또는 동물 모델에서 염증이 있는 조직에 직접 부착될 수 있다. 여러 MUB40 유도체는 사용을 확대하도록 설계되었습니다. 개발 후, 이 기술은 염증 분야의 연구원이 염증 성 질환의 호중구 모집 및 활성화를 탐구할 수있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 마우스 호중구에서 호중구를 자극하여 골수페록시다아제를 함유한 친화성 과립을 방출하는 것과 관련된 흡혈성 과립의 탈과립 분석을 보여줍니다. 후속 효소 반응은 골수과산화효소 수준을 정량화하는 데 사용되어 호중구 활성화에 대한 통찰력을 제공합니다.

An Assay to Monitor Degranulation of Azurophilic Granules in Neutrophils following Activation

우리는 염증 단계를 구별하기위한 비 침습 이미징 방법을 설명합니다. 루미놀의 전신 배달 호중구의 MPO 활동에 의존 급성 염증의 영역을 보여준다. 대조적으로, lucigenin의 주입은 대 식세포에서 Phox 활동에 의존 만성 염증으로 시각화 할 수 있습니다.

생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

여기에서, 우리는 생체외 및 시험관내 둘 다 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3개의 방법을 제시합니다. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료법을 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.

마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지

본 명세서에 설명된 프로토콜은 인간 가래에서 호중구 프로테아제의 활성을 시각화하고 정량화하는 가이드를 제공한다. 이러한 분석의 적용은 항염증제 치료의 평가에서부터 바이오마커 검증, 약물 스크리닝 및 대형 코호트 임상 연구에 이르기까지 지속됩니다.

인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활동 모니터링

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

이 프로토콜은 종양 관련 단백질 분해 효소 활성의 생체 외 분석을 통해 현장 암 진단을 가능하게 하는 CRISPR-Cas 매개 다중 분석물 합성 소변 바이오마커 검사에 대해 설명합니다.

휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

배우세요 MUB40 펩티드를 활용한 호중구 검출 및 활성화 상태 평가 방법을. 이 기술은 살아있는 세포와 고정된 조직에서 염증 반응 연구에 활용됩니다.

Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB₄₀ 펩 티 드

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