Name: 블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 식물 틸라코이드 막 단백질 복합체의 구성과 동적 조직을 분석하는 블루 네이티브 PAGE와 2D-SDS-PAGE 기법을 활용한 방법입니다. 이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana에 최적화되어 있으며 광합성 연구에 활용됩니다.

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이 연구 바이오 매스 (SE2B) 마리 Skłodowska 퀴리 부여 계약 (675006)로 핀란드의 아카데미 (프로젝트 번호 307335 및 303757) 및 태양 에너지에 의해 재정적으로 지원 되었다. 프로토콜 참조3를 기반으로 합니다.

1. 준비 비 엔 젤1,2,3
<ol><li>0.75 m m의 스페이서를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 cm x 10 cm 플레이트 (직사각형 유리 및 노치 알 루미나 판)와 젤 캐스터를 설정 합니다.</li>
	<li>그라데이션 믹서를 저 어 접시에 놓고는 배관에 의해 연동 펌프와 연결 합니다. 주사기 바늘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 하 고 유리 및 알루미늄 격판덮개 사이 바늘을 배치. "무거운" (H)에 장소 자력-챔버.</li>
	<li>대비 3.5% (v/v) 및 12.5% (v/v) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 아크릴 (AA) 솔루션 분리 젤 그라데이션 (참조 표 1에). 불의 중 합을 방지 하기 위해 솔루션을 준비 하는 동안 얼음에 원심 분리기 튜브를 유지. 주의: 아크릴은 신경 및 발암 성, 마모 보호 옷과 장갑.</li>
	<li>그라데이션 믹서에 대 한 해결책을 pipetting 전에 5 %APS TEMED 오른쪽을 추가 합니다. 피펫으로 H-챔버에 12.5% 솔루션.<ol>
<li>L-챔버를 입력 하는 솔루션을 수 있도록 두 개의 챔버를 연결 하는 밸브를 열어 "빛" (L)과 H-챔버를 연결 하는 채널에서 기포를 제거 합니다. 밸브 및 피펫으로 솔루션의 H-챔버를 다시 닫습니다.</li>
		<li>마지막으로, 피펫으로 L-약 실에 3.5% 솔루션.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스위치는 자력에 (는 저 속도가 중요 하지만 무 겁 고 가벼운 솔루션의 적절 한 혼합 되도록 해야), 밸브를 열고 연동 펌프에 전환. 유리 및 알루미늄 판 사이에 젤 솔루션을 허용, flowrate는 대략 0.5 mL/min. 바늘 해야 액체 위에 모든 시간, 그것은 테이프와 함께 유리 접시의 위쪽 부분을 연결할 수 있습니다.</li>
	<li>H와 L 챔버는 비운 초순 그들을 채울 고 부드럽게 오버레이 젤 표면 물 허용. 젤 중 합 실시간에 약 1-2 시간 소요</li>
	<li>3% 아크릴 솔루션 준비 (참조 표 1제조 법)는 스태킹에 대 한 생산 분리 젤 위에 겹쳐 쌓이는 젤에 실시간 피펫으로 젤 (겹쳐 쌓이는 젤을 주조 하기 전에 제거 젤 표면 overlaying 물) 배치 샘플 젤 빗 사이는 유리와 알루미늄 플레이트 피하 공기 방울.<ol>
<li>30-60 분 실시간 제거 초순에서 부드럽게 빗에 유해 하실 수 있습니다. 젤 + 4 ˚C에 저장 합니다. 일시 중지 포인트입니다. 젤은 몇 일 동안 + 4 ˚C에 저장할 수 있습니다. 젤은 우물과 젤 표면의 건조를 피하기 위해 습 한 조건에서 보관 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thylakoid 가용 화1,2,3
참고: 모든 단계는 매우 희미 한 빛 속에서 수행 되어야 합니다. 샘플 및 버퍼 얼음에 계속.
<ol><li>얼음 처럼 차가운 25BTH20G 버퍼 1 mg/mL의 최종 엽록소 농도를 가진 고립 된 thylakoids를 희석. 엽록소의 µ g 2D BN SDS 페이지 분석 약 4-8에 대 한 샘플은 적합 /. 참고: thylakoids는 실험에 사용 되는 (thylakoid 절연, 참조3프로토콜)에 대 한 신선한 잎에서 격리 되어야 합니다.</li>
	<li>세제 버퍼, 즉, 2% β-DM (w/v) 또는 2%의 동일한 볼륨 추가 digitonin (w/v). 부드럽게 피펫으로 팁 thylakoid 샘플에 세제를 혼합 하 고 기포를 만들기 방지. 세제의 최종 농도 1%와 thylakoids 0.5 mg Chl/mL 이다.<ol>
<li>얼음 (β-디 엠) 또는 로커/통 (digitonin)에 연속 부드러운 혼합과 RT에서 10 분 2 분 thylakoids solubilize 참고: thylakoid 단백질 복합물의 가용 화에 대 한 Digitonin 및 β-DM 사용 일반적으로 됩니다. 다른 비 이온 세제 사용 하는 경우 세제 농도 및 가용 화 시간 해야 합니다 먼저 최적화. 일반적으로 세제 농도 범위에서 0.5%-5% (v/v). 주의: Digitonin은 독성 보호 옷을 입고, 장갑</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insolubilized 자료 + 4 ˚C에서 20 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플을 CBB 버퍼의 1/10 (v/v)를 추가 합니다. 참고: thylakoid 막 단백질 복합물의 전체적인 구성, 시험 수확량 및 solubilized 분수의 대표 thylakoid 도메인 확인 것이 좋습니다. Solubilized 자료의 수익률을 확인 하려면 (CBB 추가) 하기 전에 새로운 튜브는 상쾌한의 5 µ L을 하 고 측정 Chl 내용과 Chl a / b 비율5.</li>
</ol>3. 비-페이지1,2,3
<ol><li>수직 전기 시스템 (예: Hoefer SE 250) 젤을 설정 합니다. 위의 버퍼 챔버 블루 음극 버퍼 채우기 ( 표 1참조) 양극 버퍼는 더 낮은 버퍼 약 실에 붓는 다.</li>
	<li>우물에 thylakoid 샘플 (엽록소의예를 들어, 5 µ g)를 로드 합니다.</li>
	<li>전기 이동 법을 시작 하 고 서서히 전압을 증가: 75 V 30 분, 30 분 동안 100 V, 30 분 125 V, 150 V 1 h와 V는 단지까지 175 완전히 분리 되었다. 에 젤 + 4˚C, 차가운 룸을 사용 하거나 냉각 시스템 젤 온도 조정 실행 합니다. 참고: 샘플 전면 젤의 1/3 정도 마이그레이션한 때 블루 음극 버퍼 분명 음극 버퍼에 변경 합니다.</li>
	<li>전기 이동 실행 후 이미지 보관에 대 한 photoscanner와 젤 스캔.</li>
</ol>4입니다. 2D SDS 페이지
<ol><li>수직 전기 시스템 (젤 크기 16 cm x 20 cm)를 조립 한다. 1mm 스페이서를 사용 합니다.</li>
	<li>2D-빗 (스트립 및 분자량 표식에 대 한 하나의 표준 잘 큰 단일) 표준 SDS 젤 (12% 아크릴, 6 M 요소, 표 2제조 법 참조)를 준비 합니다.</li>
	<li>BN 젤에서 차선을 잘라내어 (5 mL) 튜브에. Laemmli 버퍼 (5% β-mercaptoethanol 포함)의 2 개 mL를 추가 하 고 실시간에 부드러운 진동으로 45 분 동안 스트립을 품 어</li>
	<li>예를 들어, 기포 방지 젤 위에 스페이서의 도움으로 레인을 놓습니다.</li>
	<li>피펫으로 5 종이 필터와 장소를 잘 표준 종이의 좁은 조각에 분자량 마커의 µ L.</li>
	<li>BN 젤 스트립 및 마커 종이 인감, (실행 버퍼)에 0.5 %agarose 젤 스트립 위에 부 어 하 고 공고히 하 허용.</li>
	<li>전기 이동 법 프로토콜 표준에 따라 수행 합니다. 전기 이동 실행, 예를 들어, Sypro 루비 얼룩과 단백질 또는6에 따라 얼룩은 시각화.</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

광합성 에너지 변환 기계 thylakoid 막에 포함 된 큰 multisubunit 단백질 복합물으로 구성 된다. 이 프로토콜 애기 thaliana 2D SDS 페이지와 결합 된 BN 페이지에서 식물 thylakoid 단백질 복합물의 분석을 위한 기본적인 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 또한 담배와 시금치 thylakoids에서 thylakoid 단백질 복합물의 분석에 적합 하지만 작은 조정 해야 할 수도 있습니다.
막 단백질 복합물의 가용 화에 대 한 비 세제는 일반적으로 그들의 능력에 대 한 그들의 기본 형태로 단지를 보존 하기 위해 사용 됩니다. 여기, 두 가지 일반적으로 사용 되 세제 β-DM 및 digitonin 적용 했다. 라우릴 maltoside solubilizes 개별 단백질 복합물, 반면 더 큰 단백질 복잡 한 어셈블리10의 분석에 대 한 digitonin를 사용할 수 있습니다. 부피가 큰 구조적된 di...

큰 multisubunit 단백질 복합물 photosystem PSI과 PSII, Cyt b6f와 ATPase 광합성 빛 반응에서 ATP와 NADPH의 생산 조정. 더 높은 식물의 엽록체에는 단지는 구조적으로 다른 유형의 막 구조, appressed grana 및 appressed 비 기질 thylakoids thylakoid 막에 있습니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 생물학적 활성 형태로 큰 multisubunit 단백질 복합물의 분석에는 광범위 하 게 사용 되는 방법 이다. 방법1, 미토 콘 드 리아 멤브레인의 단백질 복합물 해 부에 대 한 설립 되었다 하지만 나중 thylakoid 막 네트워크3에서 단백질 복합물의 분리에 대 한 사용자 지정 된. 방법은 (i) 구조 분석, (ii) 단백질 복합물 사이 기본 상호 작용을 결정 하 고 (iii) 단백질 복합물의 전체 조직 분석에 대 한 개별 thylakoid 단백질 복합물의 정화에 적합 시 환경 큐를 변경 합니다.
이전에 분리, 단백질 복합물 신중 하 게 선택한 비 세제는 일반적으로 온화 하 고 단백질 복합물의 기본 구조를 보존 막 으로부터 격리 됩니다. 세제 소수 포함 하 고 친수성 사이트 및 특정 농도, 위의 형태 안정 micelles 라는 중요 한 micellar 농도 (CMC). CMC 결과 지질-지질 상호 작용의 고 단백질 복합물의 가용 화에 세제 농도 증가. 세제의 선택에는 세제의 가용 화 능력 및 관심사의 복잡 한 단백질의 안정성에 따라 달라 집니다. 일상적으로 사용된 세제 α/β-라우릴-maltoside 및 digitonin을 포함합니다. 그들의 네이티브 국가에서 단백질 복합물의 가용 화에 따라 불용 성 물질은 원심 분리에 의해 제거 됩니다. 더 높은 식물에서 thylakoid 막 구조에 매우 heterogenic 이며 일부 세제 (예: digitonin)는 선택적으로 막3의 특정 부분만 solubilize. 따라서, 단백질 복잡 한 조직 또는 단백질 복합물 사이 상호 작용의 특성, 그것은 항상 엽록소 콘텐츠, 엽록소 a/b를 확인 하 여 선택한 세제의 가용 화 능력을 결정 하는 중요 한 상쾌한 solubilized 분수의 수익률 및 대표 thylakoid (하위) 도메인을 각각 평가 비율. 엽록소 a/b 비율 성장 빛 풍토 식물의 그대로 thylakoids에는 일반적으로 약 3, 반면는 chl는 thylakoid 분수의 b 값 grana에 농축 또는 기질 thylakoids (~ 2.5) 미만으로 떨어지면 (~ 4.5) 총의 값 보다 thylakoids, 각각.
단백질 복합물에 부정적인 요금을 제공 하려면 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 염료 solubilized 샘플에 추가 됩니다. 충전 시프트 인해 단백질 복합물 양극 쪽으로 이동 하 고 그들의 분자 질량과 모양에 따라 아크릴 (AA) 그라데이션에 구분 됩니다. 효과적이 고 고해상도 분리 선형 아크릴 아 미드 농도 기온 변화도 사용 하 여 이루어집니다. 전기 이동 법, 동안 그들의 크기에 종속 기 공 크기 제한에 도달할 때까지 단백질 복합물 양극 쪽으로 마이그레이션합니다. Polyacrylamide 젤의 기 공 크기 (i) 총 아크릴에 따라 달라 집니다 /두번째-아크릴 아 미드 농도 (T) 및 (ii) cross-linker 두번째-아크릴 모노 머 농도에 (C) 총 단위체4를 기준으로. BN 페이지와 분리 후 단백질 복합물 수 수 더 세분화 그들의 개별 단백질 소 단위 2 차원 (2D)-SDS-페이지. 여기, 우리는 BN-페이지/2D-SDS-페이지 thylakoid 막 단백질 복합물의 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>6-아미노카프로산(ACA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>비스트리스</td><td>시그마-알드리치</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드(AA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9099</td><td>주의: 신경독성!</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>불화나트륨 (NaF)</td><td>J.T. 베이커</td><td>3688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 염</td><td>J.T. 베이커</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>칼비오켐</td><td>300410</td><td>주의: 독성!</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva Coomassie Blue G</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS(과황산암모늄)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED(테트라메틸에틸렌디아민)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>(N,N'-메틸렌)-비스-아크릴아미드</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 원추형 원심분리기 튜브 15 ml</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>10 x 8 cm 플레이트가 있는 듀얼 젤 캐스터</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>그라디언트 메이커 SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.75mm T-스페이서</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>샘플 젤 빗, 0.75mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Mighty Small SE250 수직 전기영동 시스템</td><td>Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td>IPC-펌프</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치, PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Rocker-Shaker</td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

광합성 전자 전송 체인 (등) NADPH와 ATP의 형태로 화학 에너지로 태양 에너지를 변환합니다. 4 개의 큰 단백질 복합물 NADP+ photosystems 통해 두, 물에서 전자를 드라이브 하 고 생성된 된 양성자 기온 변화도 사용 하 여 ATP의 생산을 위한 thylakoid 막 수확 태양 에너지에 포함. Photosystem PSII, PSI, 시 토 크롬 b6f (Cyt b6f) 및 ATPase는 뚜렷한 방향과 thylakoid 막에서 역학으로 모든 multiprotein 복합물. 온화한 세제의 기본 젤 전기 이동 별거 다음으로 막 무결성에서 단지 solubilizing 여 구성과 thylakoid 막에서 단백질 복합물의 상호 작용에 대 한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다는 단지입니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 기능 형태로 단백질 복합물의 분리에 사용 되는 분석 방법 이다. 자세한 구조 분석을 위해 단백질 복잡 한 정화에 대 한 메서드를 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 또한 단백질 복합물 간의 동적 상호 작용을 해 부를 도구를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 미토 콘 드리 아 호흡 단백질 복합물의 분석을 위해 개발 되었다 하지만 이후 되었습니다 최적화 있으며 thylakoid 단백질 복합물의 해 부에 대 한 개선. 여기, 우리가 정한 광합성 단백질 복합물 및 애기 thaliana에서 그들의 상호 작용의 분석에 대 한 상세한 최신 프로토콜을 제공합니다.

그림 1 에 대표적인 2D BN/SDS 페이지 시스템 digitonin 및 β-DM solubilized thylakoid 단백질 복합물의 분리 및 그들의 상세한 단백질 소 단위 구성 방법을 보여 줍니다. PSII-LHCII-PSI megacomplex, 2 개의 큰 PSII LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI 단량체 (m), PSII m/Cyt solubilized digitonin thylakoids ( 그림 1A상단 위에 가로 젤)의 단백질 복잡 한 패턴 포함 b6f, 느슨하게 바운드 (L)-LHCII 삼합체 (그림 1A). 약간 강한 세제, β-DM, 전체 thylakoid 막 ( 그림 ...

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

이 방법은 식물 틸라코이드 막에서 광합성 단백질 복합체의 조성 및 동적 조직에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 토착 단백질 복합체 간의 기능적 상호 작용을 분석할 수 있고 다양한 환경 조건에서 단백질 복합 조직의 가소성을 해명한다는 것입니다. 0.75밀리미터 스페이서를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 젤 캐스터 8센티미터를 10센티미터 플레이트로 설정합니다.교반 판에 그라데이션 믹서를 놓고 튜브를 통해 연동 펌프와 연결합니다. 튜빙의 다른 쪽 끝에 주사기 바늘을 부착하고 유리와 알루미늄 플레이트 사이에 바늘을 놓습니다. 무거운 챔버에 자기 교반기를 놓습니다.분리 젤 그라데이션에 사용하기 위해 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 3.5% 및 12.5%의 아크릴아미드 솔루션을 준비한다. 적시에 중합을 방지하기 위해 용액을 준비하는 동안 원심 분리관을 얼음 위에 유지합니다. 그라데이션 믹서에 솔루션을 피펫하기 직전에 5%APS와 TEMED를 추가합니다.파이펫 무거운 챔버에 12.5 %의 솔루션. 두 챔버를 연결하는 밸브를 열어 빛과 무거운 챔버를 연결하는 채널에서 기포를 제거하여 용액이 라이트 챔버에 들어갈 수 있도록 합니다. 밸브를 닫고 용액의 흔적을 무거운 챔버로 다시 닫습니다.마지막으로, 3.5%의 용액을 광챔버에 파이펫으로 바합니다. 자기 교반기켜 보입니다. 밸브를 열고 연동 펌프를 켭타보틱 펌프를 켭타보합니다.젤 솔루션이 분당 약 0.5 밀리리터의 유량으로 유리판과 알루미늄 플레이트 사이를 흐르도록 합니다. 바늘은 항상 액체 위에 있어야합니다. 무겁고 가벼운 챔버가 비워지면 초순수물로 채웁니다.그리고 물이 젤 표면을 부드럽게 오버레이할 수 있도록 합니다. 젤 중합은 실온에서 약 1 ~ 2 시간이 걸립니다. 실온에서 스태킹 젤을 위한 3%아크릴아미드 용액을 준비합니다.파이펫은 중합 분리 젤 위에 스태킹 젤을 하고 기포를 피하는 유리판과 알루미늄 판 사이에 샘플 젤 빗을 놓습니다. 실온에서 30~60분 동안 젤을 중합할 수 있게 한 후, 초순수 수중에서 빗을 부드럽게 제거합니다. 이 시점에서 젤은 며칠 동안 습한 조건에서 섭씨 4도 의 양수로 보관할 수 있습니다.얼음 차가운 25BTH20G 버퍼로 격리된 틸라코이드를 밀리리터당 1밀리그램의 최종 엽록소 농도로 희석합니다. 각 틸라코이드 샘플에 대해 두 개의 튜브를 준비하여 베타-DM및 디지토닌 용윤화를 모두 수행합니다. 이제 동일한 양의 세제 버퍼를 추가합니다.세제와 틸라코이드 샘플을 파이펫과 부드럽게 섞어 기포를 만들지 마십시오. 베타-DM 용해화를 위해 얼음 위에 2분 동안 틸라코이드를 용해시합니다. 또는 실온에서 10 분 동안 디지토닌 용해화를 위해 로커 또는 셰이커에 연속 부드러운 혼합이 있습니다.인큐베이션에 따라, 양수 섭씨 4도에서 20분 동안 18, 000g에서 원심분리에 의한 불용성 물질을 제거한다. 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 옮기고 샘플에 1/10 볼륨의 쿠마시 브릴리언트 블루 버퍼를 추가합니다. 수직 전기 전광 시스템에 젤을 설정합니다.상부 버퍼 챔버를 파란색 음극 버퍼로 채우고 하부 버퍼 챔버에 양극 버퍼를 붓습니다. 틸라코이드 샘플을 우물에 적재합니다. 전기 전도를 시작하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 전압을 점차적으로 증가시다.차가운 방을 사용하거나 냉각 시스템으로 젤 온도를 조정하는 양수 섭씨 4도에서 젤을 실행합니다. 샘플 전면이 젤의 약 1/3을 마이그레이션할 때 파란색 음극 버퍼를 명확한 음극 버퍼로 변경합니다. 전기 전광 실행 후 이미지 보관을위한 사진 스캐너와 젤을 스캔합니다.2-SDS PAGE를 수행하려면 1mm 스페이서를 사용하여 수직 전기 전도 시스템을 조립한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2D 빗으로 표준 SDS 젤을 준비합니다. BN 젤에서 차선을 잘라 5 밀리리터 튜브에 놓습니다.그런 다음 Laemmli 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 실온에서 부드러운 흔들림으로 스트립을 45 분 동안 배양하십시오. 기포를 피하는 젤 위에 스페이서의 도움으로 차선을 놓습니다. 좁은 필터 용지에 분자량 마커 5마이크로리터를 피펫하여 종이를 표준에 잘 배치합니다.BN 젤 스트립을 밀봉하고 마커 종이는 겔 스트립 위에 있는 완충제에 0.5%의 아가로즈를 부어 고화시킬 수 있도록 한다. 표준 프로토콜에 따라 전기 전도를 수행합니다. 전기 전광 실행 후 SUPRO 루비 얼룩 또는 은 얼룩으로 단백질을 시각화합니다.베타-DM 및 디지오닌 용해성 샘플의 틸라코이드 단백질 복합 패턴의 대표적인 결과가 여기에 나와 있다. 작은 복합체는 전기 전구 실행 중에 더 빨리 이동하므로 겔의 하부에 있습니다. 큰 복합체는 젤의 상부에 있는 반면.Digitonin은 일반적으로 더 큰 어셈블리에서 단백질 복합체를 보존하고 베타 DM은 복합체 간의 음순 단백질 단백질 상호 작용을 방해합니다. 베타-DM 및 디지오닌 용해성 틸라코이드의 단백질 복합체의 서브유닛 조성물은 여기에서 제시된다. 각 복합체의 하위 단위는 정렬된 복합체 아래의 수직 선에서 찾을 수 있습니다.원칙적으로, 2-D 젤의 각 지점은 개별 단백질을 나타낸다. 그러나 실제로, 동일한 분자 질량의 몇몇 단백질은 단 하나 자리에 존재할 수 있습니다. 반점의 식별은 질량 분석 분석을 기반으로합니다.이 절차를 적용한 후 단백질 복합체에 대한 구조적 통찰력을 얻기 위해 블루 네이티브 젤에서 출동된 단백질 복합체의 전자 현미경 검사법과 단일 입자 분석과 같은 다른 방법을 계속할 수 있다. 알 수 없는 단백질 하위 단위를 식별하기 위해 2차원 SDS PAGE에서 개별 단백질 반점을 질량 사양으로 분석할 수 있다. 아크릴아미드와 디지오닌을 사용하면 매우 해로울 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 보호 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

analysis-thylakoid-membrane-protein-complexes-blue-native-gel

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 multiprotein의 단지 (MPCs)의 특성을 설명합니다. 첫 번째 차원에서 dialyzed 세포 lysates은 개별 MPCs을 식별할 BN - PAGE로 구분됩니다. 두 번째 차원 SDS - PAGE에 관심 MPCs은 더욱 immunoblotting하여 성분을 분석하기 위해 세분화됩니다.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

이 비디오에서는 미토콘드리아 호흡 단백질 복합체를 본래 접혀 기능적으로 활성화된 상태에서 분석하기 위해 blue native PAGE라는 전기영동 기술을 시연합니다. 음이온성 Coomassie blue 염료는 단백질 복합체를 음전하로 띠게 하여 크기와 구조에 따라 분리할 수 있습니다.

파란 천연 Polyacrylamide 젤 전기 이동법: 본래 Mitochondrial 호흡 사슬 복합물의 분석을 위한 Non-denaturing 별거 기술

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

이 프로토콜은 다양한 다운스트림 단백질 분석 기술과 호환되는 이종 샘플의 비공유 생체 분자 어셈블리 및 단백질에 대한 네이티브 분리 기술인 투명 네이티브 겔 용리된 액체 분획 포착 전기영동(CN-GELFrEE)을 준비하고 수행하는 방법을 설명합니다.

CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동

TAP(Tandem Affinity Purification) 방법은 단백질체학을 위해 주로 진핵생물인 세포 추출물에서 천연 복합체를 분리하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 구조 연구를 위한 천연 복합체의 정제에 최적화된 TAP 방법 프로토콜을 제시합니다.

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

여기 선물이 solubilized thylakoid 단지 네이티브 그린 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 프로토콜. 녹색 젤 밴드는 이후 여 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 특징 및 데이터 분석을 위한 기본 단계 제공 됩니다.

시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 Time-Correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 Thylakoid 단백질 복합물의 분리

이 프로토콜에서는 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물의 분석을 보여 줍니다. 여기 경작된 한 인간 세포에 적용 하는 방법을 설명 합니다.

경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

단백분해효소는 박테리아 병인에 필수적이며 침입과 면역 회피를 가능하게 합니다. 활성 형태의 박테리아의 세포질 및 막 단백질을 단일 단계 추출하는 것은 끔찍한 일입니다. 이 비디오 기사는 젤라티나제를 검출하고 특성화하기 위한 자이모그래피 분석을 위해 렙토스피라의 전체 세포 단백질을 추출하는 방법을 보여줍니다.

박테리아 젤라티나제의 원스텝 추출 및 자이모그래피 분석

배우세요 식물 틸라코이드 막 단백질 복합체의 구성과 동적 조직을 분석하는 블루 네이티브 PAGE와 2D-SDS-PAGE 기법을 활용한 방법입니다. 이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana에 최적화되어 있으며 광합성 연구에 활용됩니다.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

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