Name: 식물 반응 산소 종에서 Vivo에서 음이온 세 륨 산화물 나노 입자의 촉매 청소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 배우세요 산화세륨 나노입자를 활용한 식물 반응 산소 종 촉매 제거 기법을 Arabidopsis thaliana에서 적용하는 방법입니다. 이 프로토콜은 식물 산화 스트레스 신호 전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 캘리포니아 대학, 리버 사이드와 미국 농 무부 식품 및 농업, 해치 프로젝트 1009710 J.P.G.에 의해 지원 되었다 이 자료는 J.P.G.에 보조금 번호 1817363에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반

1. A. thaliana 식물 성장
<ol><li>5 cm x 5 cm 일회용 냄비에 뿌리 다 A. thaliana 씨앗 표준 토양 혼합 가득. 32 이러한 냄비의 물으로 채워진 플라스틱 쟁반에 넣어 (~ 0.5 c m 깊이)는 식물을 가진 플라스틱 트레이 식물 성장 챔버로 전송.<ol>
<li>다음과 같이 성장 챔버 설정을 설정: 200 µ / ms 광합성 활성 방사선 (파), 24 ± 1 ° C 일 및 21 ± 1 ° C 밤, 습도 60%, 및 14/10 h 주/야간 라이트 정권, 각각.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발 아의 1 주 후 하나의 개별 공장을 두고 각 냄비 얇은. 각 냄비에서 비슷한 크기와 묘를 계속 기록해 둡니다.</li>
	<li>물이 냄비 플라스틱 쟁반에 직접 붓는 수도 물으로 한 번 매 2 일. 4 주에 대 한 식물을 성장. A. thaliana 식물 추가 사용 하기 위해 준비가 되었습니다.</li>
</ol>2. 합성 및 PNC의 특성화
<ol><li>세 륨 (III) 질산염의 1.08 g 무게 그리고 분자 생물학 학년 물 50 mL 원뿔 튜브에서 2.5 mL에 용 해.</li>
	<li>50 mL 원뿔 튜브에 분자 생물학 학년 물 5 mL에 용 해 및 폴 리 (아크릴) 산의 4.5 g 무게.</li>
	<li>디지털 소용돌이 믹서를 사용 하 여 15 분 동안 2000 rpm에서 철저 하 게 이러한 두 가지 솔루션을 혼합.</li>
	<li>수산화 암모늄 솔루션 (7.2 M)의 15 mL 50 mL 유리 비 커에 전송.</li>
	<li>500 rpm에서 교 반 하면서 dropwise 수산화 암모늄 솔루션에 혼합 단계 2.3에서 추가 하 고 증기 두건에서 24 시간 동안 실 온에서 500 rpm에서 저 어.</li>
	<li>동안을 피하기 위해 솔루션의 상당한 손실 하룻밤 반응 종이의 조각으로 비 커를 커버.</li>
	<li>24 시간 후 결과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에 전송 하 고 모든 가능한 파편 및 큰 응집 체를 제거 하는 1 h 3900 x g에서 원심.</li>
	<li>표면에 뜨는 솔루션의이 22.5 mL 3 15 mL 10 kDa 필터에 전송 하 고 분자 학년 물 45 mL의 총 희석 수 있도록 필터의 나머지를 입력 합니다.</li>
	<li>무료 고분자에서 표면에 뜨는 솔루션을 정화 하 고 15 mL 10 kDa 필터와 15 분에 3900 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한을 추가 하 여 벤치탑 원심 분리기와 다른 시 약 6 번 이상이 단계를 반복.</li>
	<li>아니 무료 고분자를 위해 220-700 nm에서 대 일 분 광 광도 계를 각 주기에서는 eluent의 흡 광도 측정 하 고 다른 시 약은 최종 PNC 솔루션에 존재.</li>
	<li>5 mL 주사기로 수집한 PNC 솔루션을 20 nm 기 공 크기 주사기 필터에 대 한 필터링. 필터링 된 PNC 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>플라스틱 베트에 희석된 최종 PNC 솔루션을 대 일 분 광 광도 계 220-700 nm에서의 흡 광도 측정. PNC 흡 광도 피크는 271 nm.</li>
	<li>맥주 Lambert 법률을 사용 하 여 그것의 농도 계산: A = εCL. A는 주어진된 샘플에 대 한 피크 값의 흡 광도, ɛ PNC (c m-1 M-1)의 어 금 니 흡수 계수, L 광학 경로 길이 (베트 폭,이 방법에서는 1 cm) 이며 C는 측정 된 나노 입자의 어 금 니 농도.</li>
	<li>유체역학 직경 및 분석기를 사용 하는 입자 크기와 제타 잠재적인 (그림 1) 합성된 PNC의 제타 전위를 측정 합니다.</li>
	<li>추가 사용까지 냉장고 (4 ° C)에서 최종 PNC 솔루션을 저장 합니다. 참고: 우 외를 참조 하십시오. PNC 특성화에 대 한 더 많은 프로토콜 세부 정보에 대 한 8 .</li>
</ol>3. 라벨 DiI 형광 염료와 PNC
<ol><li>학년 물 20 mL 유리 유리병에 분자 생물학의 3.6 mL와 5 m m (58 mg/L) PNC의 0.4 mL를 혼합 하 고 500 rpm에서 저 어.</li>
	<li>24 µ L 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 염료 솔루션 추가 (DiI, 2.5 mg/mL; DMSO에 희석) DiI 염료 솔루션 DMSO (디 메 틸 sulfoxide)의 176 µ L로.</li>
	<li>PNC 솔루션, 주위 온도에 1 분 동안 1000 rpm에서 교 반에 dropwise DiI 염료를 추가 합니다.</li>
	<li>15 mL 10 kDa 필터에이 결과 혼합물을 전송 하 고 분자 생물학 학년 물 총 희석을 가기로 튜브를 채울 15 mL.</li>
	<li>5 분 동안 3900 x g에서 15 mL 10 kDa 필터와 DMSO 및 모든 가능한 무료 DiI 염료에서 PNC (DiI-PNC) 솔루션 벤치탑 원심 분리 하 여 표시 하는 DiI를 정화.<ol>
<li>단계 3.5 5 번 이상 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 nm 기 공 크기 주사기 필터를 통해 최종 DiI PNC 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>대 일 분 광 광도 법에 의해 최종 DiI-PNC의 흡 광도 측정 하 고 맥주 Lambert 법률 (그림 2)의 농도 계산. 자세한 내용은 단계 2.13를 참조 하십시오.</li>
	<li>추가 사용에 대 한 4 ° C에서 냉장고에 보관.</li>
</ol>4. 식물의 침투 PNC와 나뭇잎
<ol><li>침투의 0.1 mL를 추가 그것은 0.5 m m PNC 또는 DiI PNC 솔루션 및 소용돌이의 0.9 mL에 (100 mM TES, 100 m m MgCl2, pH 7.5, HCl에 의해 조정)를 버퍼. 부정적인 통제로 10mm TES 침투 버퍼의 솔루션을 사용 합니다.</li>
	<li>1 mL 균 needleless 주사 통에 PNC 또는 DiI PNC 침투 솔루션의 0.2 mL를 전송. 가능한 모든 기포를 제거 하려면 누릅니다.</li>
	<li>식물 성장 챔버 룸 라이트 조건에서 가능한 stomata 폐쇄를 피하기 위해 나노 입자와 침투 직전에서 검색 합니다.</li>
	<li>침투 하기 전에 엽록소 측정기를 사용 하 여 비슷한 크기와 A. thaliana 잎에서 엽록소 콘텐츠 측정. 측정 3 복제와 각 리프 (3 개 이상 측정의 구성 된 각 복제)14. A. thaliana 나뭇잎 침투 실험에 대 한 비슷한 엽록소 콘텐츠를 선택 합니다.</li>
	<li>부드럽게 리프 lamina (abaxial 쪽)의 하단에 대 한 needleless 주사기의 끝을 누르면 천천히 최근 준비 PNC 또는 DiI PNC 솔루션으로 잎에 침투 하 고 플런저 (그림 3A)를 누릅니다.</li>
	<li>부드럽게 닦아 내는 섬세 한 작업 퍼그림 3(C)를 사용 하 여 리프 lamina (그림 3B)의 표면에 남아 있는 과잉 솔루션 및 공장 레이블. 새로운 섬세 한 작업 잎사귀를 사용 하 여 잎의 각 그룹에 대 한.</li>
	<li>계속 침투 A. thaliana 식물 잎 적응 및 3 h에 대 한 PNC와 DiI PNC 보육에 대 한 벤치에. 참고: 침투 A. thaliana 식물은 더 사용 (그림 3D)에 대 한 준비 다음.</li>
</ol>5. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 리프 샘플의 준비
<ol><li>롤은 완두콩 크기의 관찰 1 ㎝ 반경(그림 4)에 대 한 하 젤 양과 다음 1mm 얇은 유리 슬라이드 (그림 4B) 될 때까지 밖으로 확산.</li>
	<li>코르크 송곳을 사용 하 여 (직경 0.3 c m) 유리 슬라이드 (그림 4C)에 관찰 젤의 중심에 원형 부분을 잘라.</li>
	<li>채워 컷 잘 완전히 perfluorodecalin (PFD) 잎 조직에 깊이 및 더 나은 confocal 영상 확인.</li>
	<li>코르크 송곳을 사용 하 여 (직경 0.2 c m) 적응된 DiI PNC에서 잎 디스크 수집 하 침투 A. thaliana 식물 (그림 4D).</li>
	<li>가득 PFD에 리프 디스크 탑재 잎의 침투 (abaxial) 쪽 얼굴.</li>
	<li>잎 디스크 위에 사각형 coverslip 넣고 조심 스럽게 관찰 젤 잘 밀봉 하 고 아무 공기 방울 갇혀 (그림 4E) 유지를 균등 하 게 슬라이드 coverslip에 누릅니다.</li>
</ol>6. 이미징 DiI-PNC Confocal 현미경 검사 법에 의해 잎 조직에
<ol><li>40 X 객관적 렌즈는 거꾸로 레이저 confocal 현미경 검사에 사용 합니다.</li>
	<li>2 3 드랍 스 ddH2O 40 X 객관적 렌즈 상단에 드롭.</li>
	<li>객관적인 렌즈 거꾸로 40 위에 준비 된 DiI PNC 침투 잎 샘플 슬라이드를 놓습니다.<ol>
<li>Coverslip 편이지만 렌즈에 ddH2O와 직접 접촉을 슬라이드 유리 하지 있는지 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이저 빛 또는 밝은 분야 현미경 샘플에 관심 영역을 찾아.</li>
	<li>현미경 소프트웨어를 시작 하 고 (20% 설정) 아르곤 레이저를 켭니다.</li>
	<li>광학 슬라이스 2 µ m 및 4 선 평균 미만 수집 pinhole을 설정 합니다.</li>
	<li>Confocal 현미경 설정을 샘플 이미지: 514 nm 레이저 여기 (30%); Z-스택 섹션 두께: 2 µ m; PMT1: 550-615 nm (대 한 DiI PNC 영상); PMT2: 700-800 nm (엽록체 영상)에 대 한.</li>
	<li>다른 개인에서 리프 샘플의 대표적인 confocal 이미지, 3 생물의 최소 복제.</li>
</ol>7. 이미징 PNC에서 vivo에서 Confocal 현미경 검사 법에 의해 청소 선생님
<ol><li>준비 25 µ M 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, 일반 선생님을 나타내는 염료)와 10 µ M dihydroethidium (DHE, superoxide 음이온을 나타내는 염료) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 TES 침투 버퍼 (pH 7.5)에 염료 별도로.</li>
	<li>코르크 송곳을 사용 하 여 (직경 0.2 cm) 잎을 수집 하는 적응된 PNC에서 디스크 A. thaliana 식물 침투.<ol>
<li>염료 로드 프로세스를 가속 화 하기 위해 잎 디스크에 3 ~ 4 구멍을는 집게의 날카로운 팁을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이동 잎 디스크 microcentrifuge 튜브 H2DCFDA 및 DHE 별도로 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 린스 잎 ddH2O 3 번 디스크와 유리에 관찰 슬라이드 마운트 (프로토콜 섹션 5를 참조) 젤.</li>
	<li>Confocal 현미경에 슬라이드를 넣고 수동으로 리프 mesophyll 셀의 지역에 초점. 자세한 내용은 프로토콜 섹션 6을 참조 하십시오.</li>
	<li>UV-a 잎 디스크 노출 (405 nm) 레이저 3 분 선생님을 생성 하 고 시계열 ("xyt") 잎 디스크 당에 선생님 신호 강도 변화를 기록.</li>
	<li>Confocal 현미경 설정으로 리프 디스크 이미지: 40 X 물 목표; 496 nm 레이저 여기; PMT1: 500-600 nm (DHE 및 DCFDA 염료 검출);에 대 한 PMT2: 700-800 nm (엽록체 감지)에 대 한. 부정적인 컨트롤로 침투 버퍼 솔루션에 침투 하는 식물을 사용 합니다.</li>
</ol>8. PNC 청소의 H2O2체 외
<ol><li>이전 간행물3,,815 에 방법에 따라 합성 PNC에는 생체 외에서 의 고양이 (catalase) 모방 활동을 수행
</li>
	<li>45.4 추가 1 x TES 침투의 µ L 버퍼 (10 m m TES, 10 m m MgCl2, pH 7.5, HCl에 의해 조정), 피츠버그 (60 nM, 3 µ L), 및 H2O2 (2 µ M, 1 µ L) 잘 (흰색 둥근 바닥 96 잘 접시)에 pipetting으로 부드럽게 섞는다.</li>
	<li>추가 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine (작업 농도 100 µ M, 0.5 µ L) 및 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP; 작업 농도 0.2 U/mL, 0.1 µ L) 우물에 부드럽게 pipetting, 그것을 혼합 하 고 30 분 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine에 대 한 그것을 품 어 H2O2 와 반응 하 고 HRP의 resorufin로 변환 됩니다.<ol>
<li>랩는 인큐베이션 기간 동안 빛을 피하기 위해 알루미늄 호 일로 접시.</li>
		<li>H2O2를 대체 하기 위하여 물 또는 반응 버퍼를 사용 하 여 부정적인 제어를 준비 합니다.</li>
		<li>재고 솔루션을 제외한 주위 온도에 다른 모든 솔루션을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플레이트 리더를 부 화 후 560에서 흡 광도 모니터링 nm resorufin를 사용 하 여 H2O2의 수준을 나타냅니다. 0, 2, 5, 10, 20, 및 30 분에서 시간 체제를 설정 합니다.</li>
</ol>

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<li>Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-mediated+abiotic+stress-induced+programmed+cell+death+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).</li>
<li>Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthesis+under+drought+and+salt+stress%3A+regulation+mechanisms+from+whole+plant+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell.</a> Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에 우리 PNC 합성, 특성, 형광 염료 라벨, 및 그들의 비보에 선생님 청소 활동을 전시 식물 mesophyll 세포 내에서 나노 입자의 confocal 영상 설명 합니다. PNC는 세 륨 질산염 및 PAA 솔루션에서 수산화 암모늄의 혼합물에서 합성 됩니다. PNC 흡수 spectrophotomery와 맥주 Lamberts 법을 사용 하 여 결정 하는 농도 의해 특징. 제타 잠재적인 측정 엽록체8납품을 강화 하기 위한 PNC의 부정적으로 위탁 된 표면을 확인 했다. 형광 DiI 염료와 PNC의 라벨은 나노 엽록체와 colocalization의 높은 레벨을 보여 리프 mesophyll 셀 내에서 confocal 현미경 검사 법에 의해 vivo에서 화상 진 찰을 수 있습니다. DHE 고 DCF 형광 염료를 사용 하 여, 우리 superoxide 음이온과 비보에선생님의 강력한 폐품으로 PNC 역할을 확인 했다.
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세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria) 생물 공학 능력1,,23청소의 독특한 촉매 반응성 산소 종 (선생님) 때문에 기초 연구에서 널리 사용 됩니다. Nanoceria는 두 산화 상태 (Ce3 + 및 Ce4 +) 4,,56사이 대체 표면 산소 공석의 큰 숫자 때문에 능력을 청소 하는 선생님. Ce3 + 매달려 유대는 nanoscale에 격자 긴장 redox 반응7자전거를 통해 이러한 결함 사이트의 재생을 촉진 하는 동안 선생님을 효과적으로 청소. Nanoceria는 또한 최근 사용 되었습니다 공부 하 고 엔지니어링 공장 기능8,9. Abiotic 스트레스 식물 선생님, 지질, 단백질 및 DNA10산화 손상의 축적 경험. A. thaliana 식물, 높은 빛, 열, 및 재미 스트레스8에서 향상 된 식물 광합성에 리드 nanoceria 촉매 vivo에서 선생님의 청소. 토양도 밀 (Triticum aestivum)11;의 증가 촬영 바이오 매스 및 곡물 수율 적용 nanoceria nanoceria로 치료 하는 canola (브라 시카 napus) 식물 소금 스트레스12에서 더 높은 식물 바이오 매스에 있다.
Nanoceria는 bioengineers를 제공 하 고 식물 생물학 abiotic 스트레스 응답을 이해 하 고 식물 abiotic 스트레스 내성을 강화 하는 나노기술 기반 도구. 선생님 청소 기능 vivo에서 Nanoceria의 식물 종의 독립적인 있으며 식물 조직에 손쉬운 배달 모형 유기 체 이상으로 광범위 한 응용 프로그램을 사용 하도록 가능성이 있다. 다른 유전자 기반 메서드와 달리 nanoceria 청소 능력13높은 선생님에 대 한 항 산화 효소의 overexpression 공장 라인을 생성 필요 하지 않습니다. Nanoceria 식물의 잎 lamina 침투 연구소 기반 연구에 대 한 실용적인 접근 방법입니다.
이 프로토콜의 전체 목표 1) 합성 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)의 특성화, 2) 납품 및 리프 셀에 걸쳐 PNC의 추적 및 3)의 모니터링 PNC 기반 선생님 청소 에서 설명 하는 vivo. 이 프로토콜에서 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)는 합성 하 고 그들의 흡수 스펙트럼, 유체역학 직경, 및 잠재적인 제타 특징. 식물으로 잎 조직 PNC를 제공 하는 간단한 잎 lamina 침투 방법을 설명 합니다. 이미징에 대 한 vivo에서 mesophyll 셀 내에서 나노 분산의, 형광 염료 (DiI) 레이블을 PNC (DiI-PNC)과 공초점 형광 현미경 검사 법을 통해 나노 입자 관찰에 사용 되었다. 마지막으로, 우리는 vivo에서 confocal 현미경 검사 법을 통해 PNC 선생님 청소 모니터링 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>세륨 (III) 질산염 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238538-100G</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 물, Corning</td><td>VWR</td><td>45001-044&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>폴리(아크릴산) 1,800 mw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 디지털 볼텍스 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 디지털 볼텍스 믹서 액세서리, 인서트 리테이너</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-391</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 디지털 보텍스 믹서 액세서리: 폼 삽입 세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-395</td><td></td></tr><tr><td>수산화 암모늄 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05002-1L</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Griffin Beakers, 졸업, Corning</td><td>VWR</td><td>13912-149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic</td><td>IKA</td><td>3810001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge 5424</td><td>VWR</td><td>80094-126</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛</td><td>Millipore-Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30 시리즈 벤치탑 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06314</td><td></td></tr><tr><td>UV-2600 Sptecrophotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2600 120V</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 주사기 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA68091102</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok 팁이 있는 BD 일회용 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano S</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zen 1600</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42364-100MG</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>선샤인 믹스 #1 LC1</td><td>Green Island Distributors, Inc</td><td>5212601.CFL080P</td><td></td></tr><tr><td>Adaptis 1000</td><td>Conviron</td><td>A1000</td><td></td></tr><tr><td>TES, >99% (적정</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375-100G</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite All-Plastic Norm-Ject 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Carolina Observation Gel</td><td>Carolina</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Corning microscope slides, frosted one side, one end</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer 핸들 세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50166A</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9900-25G</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경, 정사각형, No. 1</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Leica 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorofluorescin diacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883-250MG</td><td></td></tr><tr><td>디하이드로에티듐</td><td>시그마-알드리치</td><td>D7008-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 마이크로원심분리기 튜브: 1.5 mL</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>에펜도르프 Uvette 큐벳</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z605050-80EA</td><td></td></tr><tr><td>엽록소 미터&nbsp;</td><td>코니카 미놀타</td><td>SPAD-502</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 반응 산소 종에서 vivo에서 음이온 세 륨 산화물 나노 입자의 촉매 청소

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

반응성 산소 종 (ROS) 축적 식물 abiotic 스트레스 반응의 특징 이다. 선생님 신호 수준 낮은 분자 및 높은 수준에서 분자를 손상 하 여 식물에는 이중 역할을 재생 합니다. 스트레스 식물에 선생님의 축적 대사, 효소, 지질, 및 식물 성장과 수확량의 감소를 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 수 있습니다. 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 능력을 촉매로 선생님에서 vivo에서 청소는 독특한 도구 이해를 bioengineer 공장 abiotic 스트레스 관용을 제공 합니다. 여기, 선물이 합성 및 폴 리 (아크릴) 산 성 코팅된 nanoceria (PNC) 특성화, 식물 잎 lamina 침투를 통해 나노 인터페이스 및 그들의 분포와 선생님에서 vivo에서 confocal 사용 하 여 청소 하는 프로토콜 현미경 검사 법입니다. 식물에 선생님 축적을 조작 하기 위한 현재 분자 도구 모델 종으로 제한 하 고 힘 드는 변환 방법이 필요로. Vivo에서 선생님 청소에 대 한이 프로토콜 애기 thaliana같은 잎 구조와 넓은 잎 야생 타입 식물에 적용 될 가능성이 있다.

PNC 합성 및 특성 . PNC 종합 되었다 하 고 정화 방법을 프로토콜 섹션 2에서 설명 하는 다음 특징. 그림 1 A 세 륨 질산염, PAA, 세 륨 질산염 및 PAA, PNC의 혼합물의 솔루션의 채색을 보여 줍니다. PNC 합성 후 흰색에서 밝은 노란색 색상 변화를 볼 수 있다. 10 kDa 필터 정화, 후 피츠버그 대 일 분 광 광도와 특징 이었다. PNC에 대 한 흡 광도의 피크 271에서 관찰 되었다 (그림 1B) nm. 최종 eluent 또한 자외선에 대 한 비 반응 화학 물질 정화 동안 씻 겨 했다 확인 하로 측정 되었다. 유체역학 직경 및 합성된 PNC의 제타 전위는 입자 크기 조절기와 제타 잠재적인 분석기 ...

여기, 선물이 vivo에서confocal 현미경 검사 법, 그리고 비보에 의해 식물 조직에서 이미징 nanoceria 청소 합성 및 선생님 (반응성 산소 종)에 대 한 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 특성에 대 한 프로토콜 nanoceria 선생님 confocal 현미경 검사 법에 의해 청소의 모니터링.

식물 반응 산소 종에서 Vivo에서 음이온 세 륨 산화물 나노 입자의 촉매 청소

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

생체 내에서 활성 산소 종을 촉매적으로 제거하는 산화세륨 나노 입자의 능력은 식물 신호 전달 메커니즘과 스트레스에 대한 내성을 이해하고 엔지니어링하는 고유한 도구를 제공합니다. 활성 산소 종은 낮은 수준에서는 신호 분자로 작용하고 높은 수준에서는 분자를 손상시킴으로써 식물에서 중요한 역할을 합니다. 이 기술의 주요 장점은 애기장대 탈리아나(Arabidopsis thaliana)와 같이 넓은 잎과 잎 구조를 가진 다양한 야생형 식물 종에 적용할 수 있다는 것입니다.애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(thaliana) 식물을 키운 후 질산세륨 1.08g의 무게를 잰 후 50ml 원추형 튜브에 2.5ml의 생물학 등급 물에 녹입니다. 4.5g의 폴리산의 무게를 달아 다른 50ml 원뿔형 튜브에 5ml의 생물학 등급 물에 녹입니다. 이 두 가지 솔루션을 결합한 다음 디지털 와류 믹서를 사용하여 2, 000rpm에서 15분 동안 완전히 혼합합니다.흄 후드에서 15ml의 7.2몰 수산화암모늄 용액을 50ml 유리 비커로 옮깁니다. 500rpm과 실온에서 교반을 시작합니다. 질산 세륨과 폴리산 혼합물을 현명하게 첨가하십시오.용액의 실질적인 손실을 방지하기 위해 비커를 종이 한 장으로 덮고 24시간 동안 저어줍니다. 그런 다음 결과 용액을 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 3, 900 회 g에서 1 시간 동안 원심 분리기를 사용하여 파편이나 큰 응집체를 제거합니다.그런 다음 상층액을 3개의 50밀리리터, 10킬로달톤 필터로 옮깁니다. 각 필터의 나머지 부분을 분자 등급의 물로 채우면 총 45ml가 희석됩니다. 3, 900 회 g에서 15 분 동안 원심 분리기.이 과정을 최소 6회 반복합니다. UV-vis 분광 광도계를 사용하여 220나노미터에서 700나노미터까지 각 용리액의 흡광도를 측정하여 최종 PNC 용액에 유리 폴리머 또는 기타 시약이 존재하지 않는지 확인합니다. 5ml 주사기를 사용하여 수집된 PNC 용액을 흡수합니다.다음으로, 20나노미터 공극 크기의 주사기 필터에 용액을 여과하고 여과된 용액을 50ml 원추형 튜브에 수집합니다. 희석된 최종 PNC 용액을 플라스틱 큐벳으로 옮기고 220나노미터에서 700나노미터의 흡광도를 측정합니다. 입자 사이저를 사용하여 합성된 PNC의 유체역학적 직경을 측정한 다음 최종 PNC 용액을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도의 냉장고에 보관합니다.PNC를 DiI 형광 염료로 라벨링한 후 PNC 용액 또는 DiI-PNC 용액 중 0.5밀리몰을 포함하는 용액 0.9ml를 튜브로 옮깁니다. 0.1ml의 침투 완충액을 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 10밀리몰 TES 침투 완충액을 음성 대조군으로 준비합니다.다음으로, 0.2ml의 샘플과 완충액 혼합물을 1mL의 멸균 바늘 없는 주사기로 옮깁니다. 가능한 기포를 제거하려면 누릅니다. 침투하기 직전에 성장실에서 식물을 회수하십시오.엽록소 측정기를 사용하여 A.thaliana 잎의 엽록소 함량을 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 3개의 반복으로 각 리프를 측정합니다. 엽록소 함량이 비슷한 잎을 선택하십시오.바늘 없는 주사기의 끝을 잎 층의 바닥에 부드럽게 누르고 플런저를 눌러 잎에 침투합니다. 섬세한 작업용 와이퍼를 사용하여 잎 얇은 판 표면에 남아 있는 여분의 용액을 부드럽게 닦아낸 다음 식물에 라벨을 붙입니다. 침투한 식물을 벤치에 두어 3시간 동안 부화시킵니다.먼저 완두콩 크기의 관찰 젤을 유리 슬라이드에 놓고 젤을 굴려 직경 약 2cm, 두께 1mm가 될 때까지 펴 바릅니다. 직경 0.3cm의 코르크 천공을 사용하여 젤 중앙의 원형 부분을 잘라내어 우물을 만듭니다. PFD로 웰을 완전히 채우면 더 깊고 더 나은 컨포칼 이미징 해상도를 제공할 수 있습니다.그런 다음 직경 0.2cm의 코르크 천공을 사용하여 이전에 침투한 A.thaliana 식물에서 잎 디스크를 수집합니다. 침투된 면이 위를 향하도록 PFD가 채워진 웰에 각 리프 디스크를 장착합니다. 그런 다음 리프 디스크 위에 사각형 덮개 슬립을 놓습니다.덮개를 부드럽고 균일하게 누르고, 관찰 젤 슬립을 밀어 넣고, 기포가 갇힌 상태로 남아 있지 않은지 확인합니다. 시작하려면 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 TES 침투 완충액에 H2DCFDA 염료 25마이크로몰과 DHE 염료 10마이크로몰을 준비합니다. 직경 0.2cm의 코르크 천공을 사용하여 적응된 PNC 침투 A.thaliana 식물에서 잎 디스크를 수집합니다.집게의 날카로운 끝을 사용하여 각 잎 디스크에 3-4개의 구멍을 만들어 염료 로딩 과정을 가속화합니다. 다음으로, 각 염료 튜브에 동일한 양의 잎 디스크를 로드합니다. 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 이중 증류수로 잎 디스크를 세 번 헹굽니다. 관찰 젤을 사용하여 앞에서 설명한 대로 각 잎을 유리 슬라이드에 장착합니다. 컨포칼 현미경에 슬라이드를 로드하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 잎 중소 세포 영역에 수동으로 초점을 맞춘 다음 잎 디스크를 405나노미터의 UVA 레이저에 3분 동안 노출시켜 ROS를 생성합니다.리프 디스크당 시계열의 ROS 신호 강도 변화를 기록합니다. 40X water objective와 여기에 표시된 컨포칼 현미경 설정을 사용하여 잎 디스크를 이미지화합니다. 침투 완충 용액만 침투한 식물을 음성 대조군으로 사용합니다.정제 후, 합성된 PNC는 UV-vis 분광 광도계를 사용하여 특성화되며 271나노미터에서 최대 흡광도를 갖는 것으로 보입니다. 정제 공정은 최종 용리액을 측정하여 확인합니다. 그런 다음 PNC 샘플을 형광 DiI 염료로 표시하여 생체 내 나노 입자의 분포를 결정합니다.DiI 표지된 PNC에 대해 세 개의 피크가 관찰되며, 최종 용리액을 측정하면 정제 중에 반응하지 않은 화학 물질이 씻겨 나갔음을 확인할 수 있습니다. 잎 메소필 세포에서 DiI-PNC의 분포는 컨포칼 이미징을 통해 결정됩니다. 대조군 샘플에서 DiI 염료 신호가 감지되지 않는 반면, DiI-PNC는 침투된 잎에서 엽록체와 함께 국한되어 관찰됩니다.PNC에 의해 활성화된 생체 내 ROS 소거는 DHE 및 DCF 염료의 형광 강도 변화를 측정하여 잎 디스크에서 모니터링됩니다. 3분간의 UV 스트레스 후, PNC 침투 잎은 나노입자가 없는 완충액 대조군과 비교할 때 두 염료 유형 모두에서 현저히 낮은 강도를 보입니다. CAT 모방 활성 분석은 PNC를 함유하는 혼합물에서 레소루핀 수치의 감소를 보여줍니다.이 수준은 과산화수소 수준을 나타내므로 이 수준도 감소하고 있으며 합성된 PNC의 CAT 모방 활성을 확인합니다. 나노세리아를 합성하기 위한 이 프로토콜은 크기, 전하 및 ROS 소거 능력이 제어된 산화세륨 나노입자를 생성하는 간단하고 단계적인 절차입니다. in vivo ROS 조작을 위한 식물 유전자 변형 방법은 현재 식물 모델 종에 국한되어 있습니다.대조적으로, nanoceria ROS 소거는 실험실과 현장 모두에서 다양한 야생형 식물 종에 적용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

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