Name: 제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 중추신경계 전기생리학 기록 방법을 통해 곤충 독성학 및 살충제 작용 기전을 연구하세요. 이 기법은 고효율 신경생리학 실험을 가능하게 합니다.

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우리는 해 부와 초파리 는 그림에 표시 된 CNS의 이미지에 대 한 양 루이 첸을 감사 하 고 싶습니다.

1. 장비 및 재료
<ol><li>전기 생리학 장비 초파리 CNS의 흡입 전극 녹음을 수행의 필수 구성 요소 ( 재료의 테이블에에서 나열 된)를 준비 합니다. 참고: 이전에 실험, 필요는 초파리 CNS의 해 부에 대 한 챔버를 구성 하 고 녹음 동안 염 분에 중추를 입욕 하는 데 사용할. 챔버 건설의 단계별 개요는 아래 제공 됩니다.</li>
	<li>애벌레 챔버를 준비 합니다.<ol>
<li>뜨거운 접시를 사용 하 여 블랙 왁 스를 녹여.</li>
		<li>최대 볼륨의 2-2.5 mL 챔버로 녹 인된 왁 스의 2 개 mL를 붓으십시오.</li>
		<li>왁 스 쿨 하 고 약 2 시간에 대 한 강화.</li>
		<li>면도날을 사용 하 여 약 0.5 c m2 의 표면적과 약 0.25 cm의 깊이 500 µ L의 볼륨을 개최 한다 강화 된 왁 스에 구멍을 개척.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 장비 및 소프트웨어 구성
참고: 세포 외 기록의 설치 아래 간략하게 설명 되어 있습니다.
<ol><li>해 부와 녹음 장비를 준비 합니다.<ol>
<li>조직 준비, 현미경, 흡입 전극, micromanipulators, 소음을 줄이기 위해 외부 전기 분야 (그림 2)를 패러데이 새 장 안에 광원을 배치 합니다.</li>
		<li>연결 (솔더 선호) 지상과 긍정적인 와이어에 차폐 된 악어 클립 목욕 및 microelectrode 홀더에 각각 연결 됩니다. 참고: 납땜 및 노출 전선 노이즈를 줄이기 위해 알루미늄 호 일로 덮여 수 있습니다.</li>
		<li>지상과 긍정적인 와이어 입력 1 ac/DC 차동 증폭기. 의 연결
</li>
		<li>데이터 수집 시스템 을 앰프의 채널 1 출력 데이터 수집 시스템의 입력된 1에서 고정 닐-Concelman (BNC) 케이블을 연결 하 여 ac/DC 차동 증폭기에 연결할. 참고: 데이터 수집 소프트웨어와 증폭기 사이 50/60 Hz 노이즈 제거 기를 통합 하기 위하여 추천 된다. BNC T-커넥터의 사용이 필요 합니다.</li>
		<li>원하는 경우, 데이터 수집 소프트웨어의 1 입력 오디오 모니터의 입력된 1을 연결 하 여 설치 프로그램에 오디오 모니터를 포함 합니다.</li>
		<li>식 염 수와 10 mL 주사기를 전극 홀더의 압력 포트에 연결. 주: 아무 공기 방울 주사기, Ag/AgCl 펠 릿 및 전극 오프닝 사이 존재 확인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해 부 및 기록을 위한 소프트웨어를 준비 합니다. 참고: 소프트웨어 설치에 대 한 방법의 개요 원시 전기 출력을 디지털화 하 고 주파수 스파이크를 데이터 변환 재료의 테이블에 에서 나열 된 수집/분석 소프트웨어에 기반. 그러나, 다른 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 그리고 다중 녹음 변환을 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>수집/분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>주 도구 모음에서 "설정"에 클릭을 선택 "채널 설정" 대화 상자가 열립니다.</li>
		<li>3 전체 채널의 수를 줄입니다.</li>
		<li>100의 범위를 선택 하는 채널 1에 대 한 mV.</li>
		<li>채널 2에 대 한 드롭 다운 메뉴를 열 것 이다 "계산" 탭 클릭. 선택 "순환 측정," 두 번째 대화 상자가 열립니다.</li>
		<li>원본으로 채널 1을 선택 합니다. 드롭다운 메뉴 측정 단위 스파이크에서 이벤트를 선택 합니다. 마지막으로, 검색 설정 영역에서 드롭 다운 메뉴에서에서 선택 간단한 임계값.</li>
		<li>에 변환 하려면 전기 활동 헤르츠 표현 속도 플롯, 3rd 채널 산술 모드로 설정 해야 합니다: 입력된 창에 "1000*smoothsec(ch2,2)"에 입력. 단위 메뉴 헤르츠 드롭다운으로 선택 합니다. 참고: 성공적인 녹음 여러 다른 녹음 설정을 수행할 수 있습니다 하지만 "이벤트 및 간단한 임계값에서 단위 스파이크" 가능성이 가장 쉬운, 그것은 각 개인에 대 한 백그라운드 작업 위에 임계값의 조정에 대 한 수 있기 때문 녹음입니다. "사용자 정의-소스 입력"의 설정에서 녹음 하는 백그라운드 작업은 기록 사이 다른 가정 데이터의 재현성 증가.</li>
		<li>메인 화면으로 돌아가려면 대화 상자를 닫습니다. Y 시간에 Hz와 x 축에 표현 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 해 부 고 애벌레 초파리 CNS 준비
참고: 애벌레 CNS 절 개 방법 Hafer 및 Schedl27, 명확 하 게 설명 되어 있지만 이러한 이전 게시 방법 스파이크 주파수를 측정 하기 위한 중요 한 하강 뉴런의 길이 줄일. 여기, 유지, 그대로 내림차순 뉴런 애벌레 CNS 소비 세를 추가 하는 방법 요약.
<ol><li>염 분 준비입니다.<ol>
<li>해 부 및 m m28에 다음에 염 분 녹음 준비: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES); 7.25 pH 적정</li>
	</ol>
</li>
	<li>CNS 애벌레 초파리 해 부.<ol>
<li>식별 하 고 식 염 수 (그림 3A)의 200 µ L로 방황 3 탈피 초파리 melanogaster 문화 유리병 및 장소에서 추출.</li>
		<li>미세 집게의 쌍을 가진 입 고리를 잡고 집게 (그림 3B)의 두 번째 쌍은 구 더 기의 복 부를 파악. 참고:이 구 더 기의 cuticular 박막의 끊어지고 발생할 수 있는 복 부에 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다.</li>
		<li>부드럽게 당겨 입 후크 및 복 부 머리 지역에서 구 더 기의 꼬리 끝을 분리 하 고 구 더 기 (그림 3C)의 내장을 노출 하는 서로 다른 방향으로. 참고: CNS 됩니다 될 고리로 기관지 및 소화 관. 하강 주변 신경 절단을 방지 하기 위해 어떤 조직에서 CNS를 잘라 하지 마십시오.</li>
		<li>집게 (그림 3D)와 소화 기관에서 CNS를 애타게.</li>
		<li>필요한 경우 수동으로 욕실이 봄이 위 CNS 뇌 돌출부에 후부를 transecting 하 여 혈액 두뇌 방 벽을 방해. 참고:이 행해져야 한다 사용 되 고 화학의 physiochemical 속성에 따라. 그림 4A 에 빨간색 라인 제안된 transection 포인트 이며 그림 4B에서 표시 된 그대로 내림차순 주변 신경 줄기와 transected CNS. Transected CNS 3.2.5 단계의 완료 후 실험에 대 한 준비가 되어있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 외 기록 초파리 CNS의.
<ol><li>녹음에 대 한 CNS를 준비 합니다.<ol>
<li>5-15 m ω 저항에 붕 규 산 유리 모 세관에서 유리 피 펫 전극 당겨.</li>
		<li>염 분의 200 µ L을 포함 하는 왁 스 챔버에 transected CNS를 삽입 합니다. 접지 와이어를 납땜 하는 악어 클립 uncoated 곤충 핀을 클램프 하 고 회로 완료 하려면 식 염 수에 핀을 삽입 합니다.</li>
		<li>micromanipulators을 사용 하 여, 동양 transected CNS의 꼬리 끝에 전극. 주변 신경 줄기를 문의 하기 전에 수집/분석 소프트웨어에서 임계값을 조정 하 여 기록의 배경 잡음을 제거 합니다.</li>
		<li>주사기에 약간의 부정적인 압력을 적용 하 여 흡입 전극에 어떤 편리한 주변 신경을 그립니다. 참고: 주파수를 발사 초기에 더 신경 자주 발생할 증가 저항 전극의 전극으로 당겨 뉴런의 수에 상관 된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CNS 하강 하는 신경 활동의 extracellular 녹음을 시작 합니다.<ol>
<li>데이터 수집 소프트웨어에 녹음을 시작 하 고 주파수를 발사 하는 기준선을 모니터링 합니다. 초기 발사 속도 데이터를 수집 하기 전에 5 분 동안 equilibrate를 발사 속도 허용 합니다.</li>
		<li>없으면 제어 치료의 발사의 패턴 그림 5A에 표시 된 것과 유사한 붕괴 패턴 준비 및 녹음을 삭제 합니다. 참고: 변경된 패턴 발사의 신경 기능을 변경할 수 있는 중앙 패턴 발생기의 비정상적 이거나 불안정 한 활동을 제안 합니다.</li>
		<li>5 분 후 식 염 수 + 챔버의 총 볼륨 녹음 제어 속도 발사 하려면 400 µ L을가지고 차량 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>기준선 설립된 (3-5 분) 후 식 염 수의 200 µ L를 철회 하 고 염 분에서 solubilized 실험 에이전트의 200 µ L를 추가 합니다. 참고: 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 질 성 화합물에 대 한 권장된 용 매 이며 0.1% v/v를 초과 해서는 안됩니다.</li>
		<li>직렬 방식 (높은 농도 낮은) 약물 농도 적용 하 고 각 농도 (약29의 화학적 특성에 따라 조사에 의해 결정) 선택 기간에 대 한 기록. 약물과 최종 농도 포함 하는 코멘트를 포함 하 여이 시간 포인트 획득/분석 소프트웨어에서 약물 응용 프로그램의 레이블을 지정 합니다. 참고: CNS의 활동을 발사 거절 됩니다 약 10-20%로 30 ~ 50 분 후 해 부 후 따라서 적절 한 치료 컨트롤 실행 되어야 한다, 그리고 약물 치료는이 기간을 초과 하지 않아야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터를 분석 합니다. 참고: 여러 분석 활동 전위 버스트29, 스파이크 파형 진폭 및 시간 코스, 그리고 약물 치료26,30 후 평균 스파이크 주파수 결정의 변화와 같은 수집 된 데이터에 수행할 수 있습니다. , 31 , 32. 가장 일반적인 마약 아래 설명 하는 시간의 지정된 된 기간 동안 평균 스파이크 주파수는 영향 결정 이다.<ol>
<li>(즉, 약물 치료 기간)의 전체 영역을 선택 하 여 평균 스파이크 주파수 평면 및 자동으로 수집/분석의 주요 도구 모음에 있는 "Datapad" 통해 의미 스파이크 주파수 결정 소프트웨어입니다.</li>
		<li>차량 제어 (초기)의 평균 스파이크 주파수에 약물 치료 후 CNS의 평균 스파이크 주파수를 결정 합니다. 수식으로 약물 치료 후 속도 발사 비율 변경 계산: (주파수/기준 주파수 처리) × 100.</li>
		<li>각 농도 대 한 제어의 평균 스파이크 주파수 또는 퍼센트 발사를 사용 하 여 그래프 소프트웨어 표준 농도 응답 곡선을 건설 하기 위하여.</li>
		<li>통계 분석을 수행 (예: 짝이 없는 t-테스트) 의미 시간 포인트, 농도, 또는 약물 치료를 결정 하. 참고: 생성 농도 응답 곡선을 분석 하기 위한 두 가지 기본 방법이 있습니다. 첫 번째 방법은 개별 준비 당 한 농도 이다. 여기, 단일 농도의 스파이크 속도 각 준비에 대 한 초기 스파이크 속도 정규화 됩니다. 혜택 감소 때문에 준비의 아래로 실행 기록 시간 단축, 함정 증가 하는 동안 해 부 시간이 있기 때문에이 방법의 농도, 당 5-7 개별 CNS 준비 구성 됩니다 및 평균된 데이터에 더 큰 오류 막대 설정 합니다. 두 번째 방법은 개별 준비 당 여러 농도입니다. 여기, 각각 3-5 농도의 스파이크 속도 같은 초기 스파이크 속도 정규화 됩니다. 장점은 적은 해 부 시간 고 함정 후속 화학 치료에 이전 약물 농도 처리의 빠른 행동 약물 및 알 수 없는 영향의 요구는 더 적은 가변성 사이 약물 농도 대 한 복제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

관련된 비디오에 세부 사항을 제공 하 고 활동 및 스파이크를 기록 하기 위해 주요 단계 방전 주파수 비보 전 초파리 CNS의 텍스트를 제공. 해 부 효능은 짧은 또는 몇 하강 신경 초기 발사 속도 큰 차이 복제를 줄일 것입니다 때문에 방법의 가장 중요 한 측면 이다. 그러나, 일단 절 개 기술을 마스터 되었습니다,이 분석 결과와 수집 된 데이터는 매우 재현 가능 하 고 다양 한 분야에 대 한 amendable. 설명된 방법에 한 수정 필요가 수동으로 염 분 및 화학 솔루션 CNS 챔버로 플라스틱을 막을 것 이다 자동화 된 대량 시스템의 포함 이다. 풍부 시스템의 포함 가끔 수동 펫 약물의 응용 프로그램 동안 발생 하는 녹음 하는 동안 CNS의 소요를 줄일 것입니다.
이 electrophysiological 메서드 약/살충제 검색 연구 위한 준비의 유틸리티를 이용 한다. 또한,이 준비는 의무가 신경 생리학의 기본 개념의 데모에 대 한 교실 이다. 메...

이 방법의 전반적인 목표는 신속 하 게 모델 곤충, 초파리 melanogaster에서 중앙 신경 조직 (CNS)의 electrogenesis를 측정 하는 연구자 수 있도록입니다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는, 빠르고, 비용 효율적인 생리 및 독성에 관한 실험. 을 수행 하 CNS 신경 기능 이해 하거나 신경 기능을 수정 하기 위해에서 광범위 하 게 탐험 되어 대 한 삶과 중요 한 생리 적 경로 따라서,에 대 한 필수적입니다. Arthropod CNS 내의 신호 통로의 특성은 오프 대상 결과 제한 하는 동안 사망을 유발 하는 무척 추 동물 신경 기능을 방해 하는 살충제의 여러 화학 클래스의 검색을 활성화 하 고 있다. 따라서, 신 경계 이기 때문에 대상 조직 배포 된 살충제1의 대부분의 곤충 독성 학 그리고 생리학의 분야에 상당한 관심의 곤충의 신경 활동을 측정 하는 능력이 이다. 그러나, 곤충 신 경계에 관한 기본 지식과 적용된의 성장 필요 때문에 현재 기술 노동 집약 높은 비용을 요구 타당성에서 제한 된 고급 신경 생리학 기술을 계속 곤충 신경 세포는 제한, 및/또는 대부분 절지동물의 중앙 시 냅 스에 대 한 제한 된 액세스입니다. 현재, 대부분 곤충 신경 단백질의 특성 필요 해야 복제 및 heterologously에 대 한 표현 후속 약물 발견 및 electrophysiological 녹음, 곤충 안으로 정류기 칼륨 채널2 설명 했다 대상 , 곤충 ryanodine 수용 체3, 모기 전압에 민감한 K+ 채널4, 그리고 다른 사람. 분리 식에 대 한 요구와 낮은 기능 식에 대 한 가능성을 완화 하기 위해 Bloomquist와 동료에 신경 표현 형을 유도 하는 목적으로 경작 Spodoptera frugiperda (Sf21) 셀에 대 한 새로운 방법으로 살충제 발견5,6. 새로운 화학의 발전에 대 한 유효한 접근을 제공 하는 이러한 방법은 아직 그들은 자주 약리학 대리인, 살충제 저항, 및 특성의 메커니즘을 식별 특성에 대 한 극복 병목을 만들 기본적인 생리 적 원리. 여기, ex vivo 메서드는 전성 유전학7,,89 모델 곤충에서 전기 활동의 기록 및 신경의 알려진된 식 패턴 설명 단지10,,1112 신경, 새로 개발된 된 약물의 행동의 모드 및 기타 독성 학적 연구의 수준에서 저항 메커니즘의 특성을 사용 하도록.
과일 파리 D. melanogaster, 곤충의 신경 시스템 또는 행동의 살충제 메커니즘을 정의 하기 위한 일반적인 모델 유기 체 이며14 독물학13, 약리학의 연구에 대 한 적절 한 모델 생물으로 설립 되었습니다. ,15, 신경 생리학16및 척추 동물의 병 태 생리17,18,19,20 프로세스. D.melanogaster 는 완전 변 태, 애벌레 및 번데기 단계를 포함 하 여 생식 성인 무대에 도달 하기 전에 수행 하는 holometabolous 곤충. 발달 과정을 통해 신 경계 다른 생활 단계에서 중요 한 개장 겪 습 하지만 애벌레 CNS이이 방법론의 초점이 될 것입니다. 완전 개발된 애벌레 CNS와 융합 되 고 반복 하 고 거의 동일한 neuromeric 단위21,22의 배열을 나타내는 복 부 신경 절을 형성 하는 흉부와 복 부 세그먼트 해부학 간단 하다. 하강 하는 모터 신경 subesophageal 신경의 꼬리 끝에서 시작 하 고 몸 벽 근육과 내장 기관 애벌레의 자극 하. 그림 1 에서는 애벌레 초파리 CNS의 심한 해부학을 설명합니다.
Drosophila 혈액-뇌 장벽 (BBB) embryogenesis의 끝에 발전 하 고 subperineurial glial 세포 (SPG)21에 의해 형성 된다. SPG 셀 전체 초파리 CNS23를 포함 하는 연속, 단조로운, 내 피 같은 시트를 확립을 밖으로 확산 하는 수많은 filopodia 같은 프로세스를 형성 합니다. Drosophila BBB CNS21에 영양분과 xenobiotics의 항목을 조절 하 여 신경 microenvironment의 항상성 유지 포함 척추 BBB에 유사점이 있다. 이것은 신뢰할 수 있는 신경 전송 및 기능에 대 한 필수 아직 합성 마약, 대부분 펩 티 드, 그리고 다른 xenobiotics24,25, 소개 하는 잠재력의 침투를 제한 하는 BBB로 CNS의 보호 potencies 작은 분자 변조기를 특성화 하는 때 문제. 메서드를 사용 하 여 간단한 transection이이 장벽이 고 준비 약리 액세스 중앙 시 냅 스를 제공. 설명된 하는 방법론의 가장 큰 힘은 단순, 재현성, 및이 시스템에 내재 된 상대적으로 높은 처리 능력. 프로토콜은 상대적으로 마스터 하 게 쉬운, 설치 작은 공간을 필요로 하 고 초기 금융 입력만 필요는 시 약 및 소모품을 줄일 수 있다. 또한, 설명 방법은 완전히 집 파리, 파리 자리 부채26. 의 중앙 하강 신경 활동을 기록 하는 amendable

<table><tbody><tr><td>Drosophila melanogaster (strain OR)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2376</td><td></td></tr><tr><td>Vibration isolation table</td><td>Kinetic Systems</td><td>9200 series</td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>Kinetic Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope on a Boom</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>Multiple scopes can be used able; boom stand is critical</td></tr><tr><td>AC/ DC 차동 증폭기</td><td>ADInstruments</td><td>AM3000H</td><td>모델 1700은 모델 3000 오디오 모니터 대신 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>AM3300</td><td></td></tr><tr><td>Hum Bug Noise Eliminator</td><td>A-M Systems</td><td>726300</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition System (PowerLab)</td><td>ADInstruments</td><td>PL3504</td><td>Multiple PowerLab 모델을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Lab Chart Pro Software</td><td>ADInstruments</td><td>N/A - 온라인 다운로드</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 조명</td><td>Edmund Optics</td><td>89-740</td><td>다양한 광원을 사용할 수 있지만 광섬유가 가장 적응력이 뛰어난</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH715</td><td>다양한 모델을 사용할 수 있습니다</td>.</tr><tr><td>BNC 케이블</td><td>세계 정밀 기기</td><td>크기에</td><td></td>따라 다중</tr><tr><td>유리 모세 나무</td> 세계 <td>정밀 기기</td><td>PG52151-4</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td>또한 Narashige PC-100</td></tr><tr><td>블랙 왁스</td><td>캐롤라이나 생물학적 공급</td><td>974228</td><td></td></tr><tr><td>코팅 되지 않은 곤충 핀, 크기 # 2</td><td>Bioquip</td>을 사용할 수 있습니다.<td>1208S2</td><td></td></tr><tr><td>핀스 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15000-03</td><td></td></tr></tbody></table>

제 3-탈피 초파리 melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

현재 사용할 수 있는 살충제의 대부분 신 경계 대상 고 무척 추 동물 신경 단백질의 유전자 변이 자주 해로운 결과, 아직 개인의 신경 활동을 기록에 대 한 현재 메서드 동물 비용과 힘 드는입니다. 이 흡입 초파리 melanogaster 의 제 3 탈피 애벌레 중앙 신경의 전극 준비는 neuroactive 에이전트, 다양 한 신경의 생리 적 역할을 결정의 생리 적 효과 테스트 하기 위한 세공 시스템 신경 기능을 유전자 변이의 영향으로 CNS 활동 경로 이 비보 전 준비 필요 생성 곤충 신경 활동의 재현 녹음 하만 보통을 electrophysiological 지식과 기술 해 부 합니다. 다양 한 화학 변조기, 펩 티 드를 포함 하 여 다음 CNS 활동에 영향을 측정 하기 위해 생리 식 염 수 솔루션의 신 경계에 직접 적용할 수 있습니다. GAL4/UAS 시스템 등 추가, 유전자 기술, 독립적으로 또는 특정 이온 채널, 전송기, 또는 arthropod CNS 기능 수용 체의 역할을 결정 하기 위해 약리 작용에 적용할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 여기에 설명 된 분석 실험 살충제 독물학, 곤충 생리학, 발달 생물학자는 D. melanogaster 설립된 모델 유기 체는 중요 한 관심입니다. 이 프로토콜의 목표는 다양 한 과학적 테스트를 위한 유용한 모델 곤충, 초파리 melanogaster에서 중앙 신경 시스템의 electrogenesis의 측정 수 있도록 electrophysiological 메서드를 설명 하는 가설입니다.

일관 된 재현성 extracellular 흡입 전극을 사용 하 여 초파리 중추 신 경계에서에서 발생 하는 하강 주변 신경의 자발적인 활동을 기록할 수 있습니다. 삭제 및 transected 초파리 CNS의 자발적인 활동 생산 발사의 약 1 1-2 s와 붕괴의 주기적 패턴 무부하 활동 근처의 s. 예를 들어 CNS는 무부하 (1 ~ 2 Hz) 0.5-1 근처 뒤 약 1 s, 그리고 근처 무부하 상태 (1 ~ 2 Hz) 다음 반환에 대 한 버스트 (100-400 Hz)에 0.5-1 s s (그림 5A). 이 발사 패턴 반복은 모든 2-3 s. CNS는 초파리 의 평균 스파이크 방전 주파수 임계값 기준 잡음 위에 설정 된 경우 3-5 분 동안 약 20 ~ 50 Hz에서 범위. 발사 주파수 기준 전극에 주변 신경 및 전극 구멍 그리고 복 부 신경 사이 형성 하는 인감의 수에 상...

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

이 방법은 Drosophila 멜라노가스터 중추 신경계의 전기 발생을 측정하여 곤충 독성학 및 곤충 생리학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 1개의 과학적인 가설의 넓은 범위를 시험하고 행동의 새로운 살충제 모드의 발견에 원조하는 것을 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 Drosophila의 신경계를 연구하기 위해 최소한의 재정적 입력으로 간단하고 재현 가능하며 상대적으로 높은 처리량 시스템을 제공한다는 것입니다.시작하려면 수집/분석 소프트웨어를 엽니다. 기본 도구 모음에서 설정을 클릭하고 대화 상자가 열리는 채널 설정을 선택합니다. 총 채널 수를 3개로 줄입니다.채널 1은 앰프의 범위100 밀리볼트로 원시 신호를 기록합니다. 채널 2는 지정된 임계값보다 높은 채널 1의 이벤트 수를 계산하는 데 사용됩니다. 이를 위해 계산 탭을 클릭하여 채널 2의 드롭다운 메뉴를 엽니다.두 번째 대화 상자를 여는 순환 측정값을 선택합니다. 채널 하나를 소스로 선택합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴 측정에서 이벤트에서 단위 스파이크를 선택합니다.마지막으로 드롭다운 메뉴에서 검색 설정 영역에서 간단한 임계값을 선택합니다. 임계값 수준은 배경 노이즈 위에 설정될 감지 조정 창에 입력됩니다. 전기 활동을 헤르츠에 표현된 속도 플롯으로 변환하려면 세 번째 채널에서 산술을 선택합니다.새 창에서 입력 1000 배 smoothsec, 괄호 채널 2 쉼표 2. 그런 다음 단위 드롭다운 메뉴에서 주파수 단위 hertz를 선택합니다. 대화 상자를 닫고 메인 화면으로 돌아갑니다.채널 3의 y축은 헤르츠와 x축으로 제 시간에 표현되어야 합니다. 처음 식별하고 문화 유리병에서 방황 세 번째 별 Drosophila 멜라노가스터를 추출하여 애벌레 Drosophila CNS를 해부하고 식염수의 200 마이크로 리터에 배치. 그런 다음, 미세 한 개의 포셉으로 입 후크를 잡고, 얇은 큐티큘러 층을 찢어 방지하기 위해, 가벼운 압력, 집게의 두 번째 쌍으로 구더기의 복부를 잡아.구더기의 코달 끝을 머리 부위에서 분리하고 구더기의 내장을 노출하기 위해 입 후크와 복부를 다른 방향으로 부드럽게 당깁니다. CNS는 기관및 소화관과 얽혀있을 것입니다. 분개로 소화관과 기관에서 CNS를 애타게합니다.구더기에서 드로소필라 중추 신경계의 해부는 성공을위한 중요한 단계입니다. 해부된 신경은 내림차순 모터 신경에 큰 손상없이 그대로해야합니다. 신경리에 부착 된 모터 신경의 큰 숫자는 기준선 발사 주파수를 증가시킬 것이다.필요한 경우, 수동으로 반나스 봄 가위로 뇌 엽에 CNS 후방을 위장하여 혈액 뇌 장벽을 중단. 편절제술은 사용되는 화학 물질의 생리적 특성에 기초하여 수행되어야한다. 레드 라인은 제안된 트랜섹션 포인트와 여기에 표시된 말초 신경 트렁크가 있는 방제 된 CNS입니다.먼저 유리 파이펫 전극을 보로실리케이트 유리 모세혈관에서 5~15메가옴의 저항성으로 끌어당깁니다. 200 마이크로리터의 식염수를 포함하는 왁스 챔버에 간질 CNS를 삽입합니다. 코팅되지 않은 곤충 핀을 접지 와이어로 납땜한 악어 클립으로 고정하고 핀을 식염수에 삽입하여 회로를 완성합니다.마이크로 조작기를 사용하여, 전극을 과기 CNS의 caudal 끝으로 방향을 지정합니다. 주변 신경 트렁크를 연결하기 전에 획득/분석 소프트웨어의 임계값 수준을 조정하여 배경 잡음제거합니다. 흡입 전극에 말초 신경을 그리려면 주사기에 약간의 음압을 가하십시오.데이터 수집 소프트웨어에서 레코딩을 시작하고 기준 발사 속도는 기준 발사 속도 데이터를 수집하기 전에 5분 동안 평형화합니다. 5분 후, 식염수와 차량의 200 마이크로리터를 추가하여 챔버의 총 부피를 400 마이크로리터에 가져와 제어 발사 속도를 기록합니다. 대조군 처리의 발사 패턴이 여기에 표시된 예와 유사하지 않은 경우 준비 및 기록을 폐기한다.3~5분 동안 기준선이 설정된 경우 식염수 200마이크로리터를 인출하고 식염수로 용해된 실험제의 마이크로리터 200을 추가합니다. 약물 및 최종 농도를 포함하는 코멘트를 포함시킴으로써 취득/분석 소프트웨어에서 약물 응용의 이 시간 지점에 레이블을 지정합니다. 여기에 DMSO에 노출되기 전과 후에 대표적인 신경 방출 흔적이 있습니다.화살표는 응용 프로그램의 시간을 나타냅니다. DMSO에 대한 제한된 응답이 보입니다. 프로톡소르의 투여량이 증가함에 따라 주사된 드로소필라 CNS의 스파이크 배출 빈도가 농도 의존적인 방식으로 증폭되는 반면, 신경우울제 GABA는 농도 의존적 방식으로 스파이크 배출 빈도를 감소시켰다.이 절차를 시도하는 동안, 그것은 전 생체 내 실험임을 기억하는 것이 중요합니다, 따라서 pH와 온도와 같은 식염수의 조건은 중추 신경계 준비의 장기간 된 활동에 중요하다. 마찬가지로, 외부 전기 활동의 부족, 효과적인 패러데이 케이지, 그리고 60 헤르츠 소음의 감소는이 분석의 성공에 매우 중요합니다. 이 분석서를 통해 수집된 데이터는 살충제의 특정 행동 모드를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.전압 클램프 전기생리학, 생화학 분석 및 추가 약리학적 분석과 같은 다른 방법을 통해 이러한 데이터의 후속 검증을 수행할 수 있다.

electrophysiological-recording-central-nervous-system-activity-third

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

거대한 섬유 시스템은 성인의 간단한 회로의...

의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster</em

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

이 비디오는 움직이지 못하는 초파리의 눈에서 광수용체 활동의 전기생리학적 기록을 위한 프로토콜을 간략하게 설명하여 광 자극에 대한 반응으로 전압 변화를 정밀하게 측정할 수 있도록 합니다.

빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

이 비디오는 초파리 유충의 중추신경계(CNS)에서 신경 세포 활동을 세포 외로 기록하는 것을 보여줍니다. transection된 CNS는 기록 챔버에 배치되고 하행 신경의 전기 활동을 기록하여 기준선 발사 빈도를 설정합니다. 그런 다음 테스트 에이전트를 도입하고 발사 빈도의 변화를 기록하여 에이전트의 흥분 또는 억제 효과를 결정합니다.

초파리 중추신경계의 전기적 활동에 대한 세포외 기록

이 프로토콜은 초파리에서 labellar 맛 뉴런에 의해 트리거되는 액션 잠재적 인 반응의 세포 녹음을 설명합니다.

에서 전기 생리학 기록<em&gt; 초파리</em&gt; Labellar는 Sensilla 맛

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.

에서 전기 생리 학적 기록<em&gt; Drosophila</em&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

배우세요 Drosophila melanogaster 중추신경계 전기생리학 기록 방법을 통해 곤충 독성학 및 살충제 작용 기전을 연구하세요. 이 기법은 고효율 신경생리학 실험을 가능하게 합니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

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