Name: Polycystic 난소 증후군 연구 Hyperandrogenic 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 학습하세요 다이하이드로테스토스테론 펠릿을 이용한 다낭성 난소 증후군 마우스 모델 제작 방법을. 이 기법은 일관된 호르몬 방출로 생식 내분비학 및 모자 간 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회 (보조금 R00-남서에 HD068130)와 볼티모어 당뇨병 연구 센터에 의해 지원 되었다: 조종사와 (남서)에 타당성 부여.

여기, 상세한 프로토콜 DHT 펠 릿 준비 및 삽입, 및 생식 하 고 신진 대사 테스트를 위해 선물이. 쥐가이 연구에 사용 된 혼합된 배경 (C57/B6, c d 1, 129Sv) 그리고 음식과 함께 유지 되었다 광고 libitum 24 ° c의 존스 홉킨스 대학에서 브로드 웨이 연구 건물 동물 시설에서 14/10 h 명암 주기 물 의학입니다. 모든 절차는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. PCOS 같은 마우스 모델 만들기
<ol><li>
DHT 펠 릿 준비
	<ol>
<li>오토 클레이 브 소독 실리콘 튜브입니다. 실리콘 튜브 면도날; 15 mm의 길이로 잘라</li>
		<li>20 G 무딘 바늘 3 mL 주사기에 부착 된 튜브에 의료 접착 실리콘을 주입 하 여 한쪽을 봉인. 플런저는 주사기 그리고 저수지에 삽입 하는 접착제에서 철수 해야 합니다. 플런저를 다시 삽입 하 고 바늘에서 등장 하기 시작 때까지 접착제 밀어. 무딘된 바늘 어떤 강한가 위 20 G 바늘의 날카로운 끝 쪽을 절단 하 여 이루어집니다. 실리콘 튜브에서의 길이 포스트 프로덕션 트리밍; 수 있도록 2 m m 이상 이어야 한다</li>
		<li>하룻밤 건조; 봉인 된 측에 공기 방울을 확인 합니다. 그 아무 공기 방울 DHT 펠 릿 사용 됩니다. 다른 사람 없는 DHT 제어 알 약에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>피부에 DHT 노출을 피하기 위해 후드에서 DHT-펠 릿을 하기 전에 장갑, 마스크, 고글 및 실험실 외 투를 착용.</li>
		<li>플라스틱으로 부 어 DHT 분말 무게 보트와 접착제의 오픈 사이드 DHT 분말으로 튜브 (A1.1에서 생산) 출장 보도.</li>
		<li>DHT 분말 정리는 큰 종이 클립 tamped 수 있습니다.  DHT 4 m m (또는 원하는 길이)의 높이 도달할 때까지 계속 합니다. 통치자와 DHT의 길이 확인 하 고 하룻밤 건조 실리콘 오픈 사이드 인감.</li>
		<li>실리콘 길이가 2 mm의 길이 만들기 위해 봉인된 양쪽을 잘라. 펠 릿의 총 길이 8 m m 될 것입니다.</li>
		<li>제어 (no-DHT) 펠 릿으로 빈 실리콘 튜브의 양쪽을 봉인.</li>
		<li>사용까지 실내 온도에 (빛 노출 방지)를 호 일로 포장 50 mL 원뿔 튜브에 펠 릿을 유지. DHT 펠 릿 저장의 적어도 3 개월에 대 한 전체 효능을 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DHT 삽입 및 교체
	<ol>
<li>20 DHT까지 펠 릿 또는 제어 알 약은 침수 별도로 염 분 0.9%를 37 °C 삽입 직전 평형에 대 한 24 시간에 대 한 살 균 30 mL 50 mL 원뿔 튜브에.</li>
		<li>수술 전에 표면 및 장갑 clidox로 소독 하 고 작업 표면 흡수 성 종이 깨끗 한 플라스틱 백업된 (외과 패드)으로 덮여 있다.  동물을 접촉 하는 모든 악기는 압력가 마로 소독 하 여 동물 시설에 들어가기 전에 소독.  악기는 건조 하 고 차가운 사용 이전에 허용 됩니다.</li>
		<li>2 개월 된 여성 마우스 사용 (4-5 마우스/케이지). 마우스는 Xylazine intraperitoneally 주사 (3.5 mg/kg bw)와 케 타 민 (78.8 mg/kg bw) 인슐린 주사기를 사용 하 여. 혼합 및 주입 마 취에 대 한 계산 표 1에 있다.</li>
		<li>적절 한 마 취 달성, 발가락 반사의 손실에 의해 측정 된 호흡 둔화 후 마우스 수술을 위해 준비 됩니다.</li>
		<li>멸 균 거 즈를 사용 하 여 betadine와 영역의 피부를 소독 하 고 70% 에탄올으로 청소.  지역은 betadine로 다시 그린 것입니다.</li>
		<li>목 근처 피부 아래가 위는 약 5 m m 길이와 구멍을 잘라. 10 G trochar를 사용 하 여, rostral 방향으로 작은 터널 (15 m m)를 확인 합니다. 펠 릿 dorsally는 trochar와 함께 삽입 됩니다.</li>
		<li>오프닝은 다음 외과 접착제로 봉인 됩니다. 수동으로 대략적인 상처 가장자리 집게와 근접된 상처 가장자리에 액체 접착제의 얇은 필름을 적용할 부드러운 칫 솔 선. 상승 3 접착제 상처에 고르게 분포 되어 있도록 접착제의 얇은 층. 접착제는 apposed 상처 가장자리의 각 측에 1 cm를 연장 해야 합니다. 치료 또는 수술 클립 구멍을 사용할 수 있습니다. 으로, 개별적으로 보관, 복구에 대 한 열 패드와 마우스를 다시 넣어. 안 드로 겐 노출의 일정 수준을 유지 하기 위해 펠 릿 매 4 주를 교체 합니다. 원래의 펠 릿을 제거 될 것 이다 하 고 비슷한 위치에 A1.15에 설명 된 대로 새로운 펠 릿 삽입 됩니다.</li>
		<li>DHT 삽입의 3 일 후 estrous cyclicity를 테스트 합니다. Estrous 주기 단계입니다 질 세포학에 의해 평가 됩니다.  질 세포 p10 pipettor 멸 균 식 염 수 (약 10 µ L) 질 구멍에 물 총을 사용 하 고 다음 동일한 살 균 피 펫 팁과 염 분 철수 여 16 일 연속 수집 됩니다.  질 벽에서 벗겨진 질 세포는 식 염 수와 혼합 하 고 수집.</li>
		<li>레이블이 지정 된 슬라이드에 세포와 식 염 수를 확산. 각 슬라이드는 6 개의 샘플을 포함할 수 있습니다. 슬라이드는 샘플 6 위치에 배치 하는 표시 되어 있습니다.</li>
		<li>후에 식 염 수는 완전히 건조 밖으로 셀을 해결 하기 위해 100% 에탄올 용기에 슬라이드를 넣어 슬라이드에서. 슬라이드 적어도 5 분 동안 고정 해야 하지만 더 사용 될 때까지 무기한 정착 액에 남아 있을 수 있습니다.</li>
		<li>각 버퍼 B에 대 일 분 동안 얼룩 솔루션 및 수돗물와 실 온에서 건조 C. 세척 슬라이드에 슬라이드를 넣어.</li>
		<li>10 X 객관적인 가벼운 현미경 세포 형태를 검사 합니다.  셀 형태학 diestrus (D), metestrus (M), 발 정기 (E), proestrus (P)을 구별 하는 참조27,,2829에서 설명 되어 있습니다.</li>
		<li>각 일 단계 및 각 단계에서 % 시간을 계산 하는 일의 총 수로 나눈 수입니다.</li>
		<li>밤새 쥐 (16 h) 금식과 intraperitoneally 2g/kg 몸 무게의 20% 포도 당을 주입 하 여 DHT 삽입 후 21 일에 포도 당 포용 력을 테스트 합니다. 예를 들어 마우스 몸 무게 25 g 인 경우에,이 마우스 것입니다 주입의 20% 포도 당 250 µ L와 50 cc (0.5 mL) 인슐린 주사기. 포도 당 수준에서 0, 15, 30, 60, 90, 꼬리 정 맥에서 혈액을 샘플링 하 여 glucometer 및 테스트 스트립에 의해 평가 120 분. 이것은 설명에 다른30세부.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈액 컬렉션
	<ol>
<li>바소와 출혈 submandibular 정 맥에 의해 9 그리고 10 분 사이 DHT 삽입 (스테로이드에 대 한 100 µ L을 LH/FSH 분석 결과 대 한 30ul 컬렉션 볼륨 제한) 후 다양 한 일에 혈액을 수집 합니다. 이것은11에 설명 되어 있습니다.</li>
		<li>4 ˚C 10 분에서 6000 x g 에서 혈액을 원심을 분석 결과까지-80 °C에 저장 될 수 있는 또 다른 1.5 mL 튜브에 혈 청 레이어를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 평가 생식 만성 DHT에서 여성 자손의 프로필 삽입 댐
<ol><li>
짝짓기
	<ol>
<li>여성 마우스 테스트를 펠 릿 삽입 다음 15 일에서 입증 된 비옥한 남성 (그 여성 마우스 새끼 이전 했다)와 새 장으로 이동 합니다.</li>
		<li>매주 마우스 임신 인지 확인 하려면 댐의 몸 무게를 문서화 합니다. 일주일에 3 세대 이상의의 댐 체중 증가 임신을 나타냅니다.</li>
		<li>2 주 후에 우리가 관찰 댐 증가 체중 전에 주 3 세대 보다 큰 댐의 피를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
사춘기 질 및 첫 발 정기에 의해 평가
	<ol>
<li>질 검사 새끼는 투약를 중단 시킨 후 매일 체크 21 출생 일 (PND)에서 anogenital 거리를 측정 하 고 기록 질의 나이.</li>
		<li>일단 질 열리면, 매일, 확인 estrous cyclicity 1.2.8–1.2.11에 설명 된 대로 질 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>설명된 1.2.12로 세포 형태를 관찰 하 고 첫 발 정기 날짜로 정의 모든 세포는 cornified 상피 세포.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
몸 무게와 귀 펀치
	<ol>
<li>랜 싯 팁 문신 붙여넣기로 및 참조12 7 PND에에서 설명 된 대로 각 강아지 문신 발가락에 마크와 무게 쥐 나이의 70 일까지 7 일 마다.</li>
		<li>귀 펀치 쥐 그들에 12 ~ 16 PND 사이 그림 1 에 사용 하는 시스템. 섹스 구별, 신체의 복 부 측면을 검토, 여성 젖꼭지를 볼 수 있을 것 이다.</li>
		<li>21, 26, 70에서 혈액 수집 PND 1.3.1에서 위에서 설명한 대로 출산 후</li>
	</ol>
</li>
	<li>
호르몬 분석 결과
	<ol>
<li>DHT 수준 혈액 혈 청에서 두 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 측정 하 고 액체 크로마토그래피 탠덤에 의해 질량 분석 (LC-MS)23,24,,3132. T는 LC-MS, 또는 쥐/마우스 복제23,24에 연구를 위한 센터에 버지니아의 대학 Ligand 분석 결과 코어로 검증 된 ELISA에 의해 측정 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

아무것도 공개입니다.

Hyperandrogenism은 PCOS의 핵심 기능입니다. 혈 청 DHT (두 배 높은 아니 DHT 마우스에 비해 DHT 쥐)이이 프로토콜에 사용 되는 이전 연구에서 다른 조사자에 의해 보고 그 보다 낮은 및 비례 PCOS5,19, 여성 모방을 보정 20,21. 다른 모델과 달리이 2-fold DHT 모델 몸 무게와 DHT 삽입23,24후 최대 3.5 개월 아니 DHT 쥐에 비해 몸 전체 구성 변경 되지 않습니다. 이러한 성인 DHT 이식 마우스 지속적인 exogenous DHT에 의해 유지 됩니다. 몸 전체 구성 변경 되지 있지만 구조 변경 및 함수는 adipocytes의 마른 PCOS 여자<...

Hyperandrogenism 안 드로 겐 과잉 및 PCOS (애 PCOS) 사회와 NIH 기준에 따라 polycystic 난소 증후군 (PCOS)의 특징 이다. PCOS 가진 여자 임신 어려움이 있고 임신 합병증1의 위험을 증가 했다. 그들은 임신 하는 경우에 그들의 여성 자손 불리 한 건강 결과2,3있다. 다양 한 전략4,5,6,7,,89,10,11 을 사용 하 여 동물 모델 개발 되었습니다. , 12 그리고 체중 증가와 비만 확장된 adipocyte 크기 및 증가 체형 무게와 관련 된 (무 배 란, 나 장애인된 포도 당 및 인슐린 내성) PCOS의 많은 기능을 전시. PCOS를 공부 하는 데 사용 되는 동물 모델을 생산 하는 두 가지 주요 전략을 확인 하 고 있습니다. 하나는 출생13후 높은 수준의 androgens 직접 (외 인 안 드로 겐 주입/삽입) 또는 직접 (예: 안 드로 겐 변환할 aromatase 억제제와 에스트로겐 차단) 치료입니다. 다른 연구는 자손을 임신14,15 동안 androgens의 태아 hyperexposure입니다. 예를 들어 붉은 털 원숭이16,17, 양18, 그리고 자궁내 기간 안 드로 겐의 남성 수준에 노출 하는 설치류에서 여성 자손 PCOS 같은 특성 나중에 인생에서에서 개발. 이 모델은 크게 높은 안 드로 겐 효과, 그리고 태아 프로그래밍, 그리고 자 궁 환경에 미치는 영향에 대 한 우리의 이해를 향상. 그러나,이 모델은 그들의 자신의 제한: 1) 동물 개발 비만 이며 따라서 어려운 비만 유발 생식과 대사 부전;에서 hyperandrogenemia의 효과 분리 하 2) 하기 전에 임신 PCOS 가진 여자는 이미 안 드로 겐의 상부를 전시, 따라서 oocytes 수정; 전에 초과 androgen에 노출 되었을 3) 스토 (T) 또는 dihydrotestosterone (DHT) 출생 후 또는 임신 중 사용의 약리학 복용량 PCOS의 안 드로 겐 환경을 반영 되지 않을 수 있습니다. 난소 follicular 액체 또는 혈 청에서 측정 되었습니다 테 스토 테 론과 DHT 수치가 되며 남성 호르몬 DHT 수준과 PCOS5,,1920,21 여성에서 더 높은 1.5 3.9 배 ,,2223 영향을 받지 않는 여성에 비해. 우리는 성인 마우스 모델23,24,25 의 4 m m 길이와 펠 릿의 삽입에서 만성 DHT 노출의 개시의 2 주 이내 생식 및 대사 기능 장애를 개발 하 고 만든 크리스탈 DHT 분말 (펠 릿의 총 길이 8 m m). 이 모델 DHT 치료 없이 통제 쥐 보다 2-fold 높은 (2xDHT 라고도 함)에 대 한 혈 청 DHT 수준을 생성 합니다. 2xDHT 마우스 기저 혈 청 estradiol, 남성 호르몬, LH의 변경을 전시 하지 않습니다 하지 비만, 개발 하 고 유사한 난소 무게, 콜레스테롤, 자유로운 지방산, leptin의 혈 청 수준 표시 TNFα과 일리노이-623,24, 25 상대적으로 제어도 최대 3.5 개월 DHT 삽입23,,2425후. 또한, 이미 PCOS의 기능 개발 여성 짝짓기, 우리 자손15의 대사 및 생식 건강에 hyperandrogenic 모성 환경의 영향을 공부할 수 있습니다.
이 새로운 패러다임 (NIH와 AE PCOS 사회 기준에 관련 된)는 상대적으로 비슷한 수준의 androgens 그 여자와 PCOS 2-3 더 높은 남성 호르몬에 영향을 받지 않는 여성에 비해 DHT 수치를 생산 하 여 질병을 모델링 합니다. 그러나,이 모델은 유지 지속적인 exogenous DHT에 의해 프로그래밍 된 생 hyperandrogenism에서 DHT 철회 되 면. 이 글의 전반적인 목표 1에 초점을 하는) 어떻게 DHT 펠 릿; 2) 마우스 모델; 처럼 엎드려 서 PCOS를 생성 하는 방법 3)이이 댐에서 여성 자손을 평가 하는 전략. 다른 측정 및 고기의 평가이 원고에서 해결 되지 않습니다 하지만5,15,23,,2425,26에서 찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>결정질 5&alpha;-DHT 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8380-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Silastic 튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15D</td><td>0.04in/1mm 내경 x0.085in/2.15mm 외경</td></tr><tr><td>의료용 접착 실리콘</td><td>팩터 II, InC.</td><td>A-100</td><td></td></tr><tr><td>고글, 실험복, 장갑 및 마스크.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 & 마이크로; 필터가 없는 L 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>11113700</td><td></td></tr><tr><td>번짐용 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr> 세포 <tr><td>염색을 위한 Diff Quik</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9979740</td><td></td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9416572</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),</td><td>30985</td><td></td></tr><tr><td>부속 바늘 : 20G</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>눈금자 : 밀리미터 눈금이있는 10cm 이상의 길이.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise</td><td>NDC13985-704-10</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>수술용 스테이플</td><td>AutoClip&reg; 시스템, Fine Science Tool</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329461</td><td>1/2 CC, 저용량 U-100 인슐린 주사기</td></tr><tr><td>투관침</td><td>미국</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Carl Zeiss Primo Star</td><td>415500-0010-001</td><td>독일</td></tr><tr><td>귀 펀치</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>테스토스테론 쥐/쥐 ELISA 키트</td><td>IBL</td><td>B79174</td><td></td></tr><tr><td>DHT ELISA 키트</td><td>알파 진단 국제</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>원터치 울트라 혈당계</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원터치 울트라 테스트 스트라이프</td><td>스캔 (Life Scan, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>클리독</td>스 <td>Fisher Scientific</td><td>NC0089321</td><td></td></tr><tr><td>외과용 언더패드</td><td>Fisher Scientific</td><td>50587953</td><td>제조사: Andwin Scientific 56616018</td></tr><tr><td>Betadine 방부제 솔루션</td><td>Walgreens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond (n- 부틸 시아 노 아크릴 레이트)</td> <td>3M 과학. 생활</td><td></td><td></td>에 적용</tr></tbody></table>

polycystic 난소 증후군 연구 hyperandrogenic 마우스 모델

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia 여성에서 생식 및 대사 기능에 중요 한 역할을 담당 하 고 다낭 성 난소 증후군의 특징 이다. PCOS 가진 여자를 모방 하는 마른 PCOS 같은 마우스 모델을 개발 하는 것은 임상적으로 의미가 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 이러한 모델을 설명합니다. DHT (dihydrotestosterone) 크리스탈 분말 펠 릿의 4mm 길이 삽입 하 여 (펠 릿의 총 길이 8 m m), 매월 교체, 하지 DHT (no-DHT)으로 이식 하는 쥐 보다 더 높은 혈 청 DHT 레벨 2 배와 PCOS 같은 마우스 모델을 생성할 수 있습니다. 우리는 체중과 신체 구성을 변경 하지 않고 생식 및 대사 장애를 관찰. 불모의 높은 학위를 전시, 이러한 PCOS 같은 여성 쥐의 작은 하위 집합 임신 얻을 수 그들의 자손 성인 지연된 사춘기 및 증가 남성 호르몬을 표시 하는 동안에. 이 PCOS 같은 마른 마우스 모델 PCOS와 이러한 PCOS 같은 댐에서 자손의 이상 공부를 유용한 도구입니다.

혈 청 DHT 수준 및 포도 당 내성 검사
DHT 수준은 측정 했다 수집 된 혈 청에서 두 ELISA와 LC-MS 프로토콜 1.24-1.25, 그리고 2.9, 3.0. 그러나 DHT 절대 값은 질량 분석 및 ELISA,, DHT 대 아니 DHT 삽입 두 분석에서 유사 이며 전체 실험15,,2324 ( 의 상대 배 (약 2-fold) 사이 다른 그림 2A).  그러나 DHT 수준을 크게 DHT와 노-DHT 쥐에서 임신을 통해 선입견에서 증가,, DHT 수준을 2-fold (1 일 짝짓기 전에) 둘 다 pregestational no-DHT 쥐에 비해 D...

우리는 PCOS와 이러한 PCOS 같은 댐에서 자손의 이상 공부 dihydrotestosterone 펠 릿 마른 PCOS 같은 마우스 모델의 개발을 설명 합니다.

Polycystic 난소 증후군 연구 Hyperandrogenic 마우스 모델

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

이 방법은 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 내분비학. 그리고 다낭성 난소 증후군 또는 PCOS 및 hyperandrogenism의 연구에 적용 할 수 있습니다.이 기술의 장점은 비용이 많이 드는 효과적인 방법으로 호르몬의 일관된, 균일한, 장기 방출을 용이하게한다는 것입니다. 절차를 치료하는 JHUs는 내 실험실에서 기술자 인 Ping Xue가 될 것입니다. 디하이드로테스토스테론 또는 DHT 펠릿 준비를 위해 면도날을 사용하여 15mm 크기의 실리콘 튜브를 자른다.또한 무딘 20 게이지 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기를 사용하여 2~5밀리미터의 의료용 접착제 실리콘을 튜브의 한쪽 끝에 주입합니다. 하룻밤 사이에 튜브를 건조시키십시오. 그리고 밀봉 된 끝에 기포를 확인합니다.적절한 개인 보호 장비를 착용하면 흐름이 플라스틱 웨이보트에 DHT 분말을 붓습니다. 접착제 캡 튜브의 열린 끝을 파우더에 감동. 큰 스트레이트 페이퍼 클립을 사용하여, DHT가 적절한 실험 깊이에 도달 할 때까지, 튜브에 분말을 탬핑.그런 다음 하룻밤 동안 실리콘으로 튜브의 열린 측면을 밀봉합니다. 다음 날 아침, DHT양쪽에 2밀리미터 길이의 실리콘을 얻기 위해 밀봉된 측면을 잘라내고 DHT 제어 펠릿을 분리하지 않았다. 그런 다음 펠릿을 실온에서 호일로 감싸는 50 밀리리터 원내 튜브에 최대 3개월 동안 보관하십시오.PCOS 마우스 모델 생성의 경우 최대 20개의 DHT 또는 대조군 펠릿을 별도의 50밀리리터 원물 튜브에 함유하고 있으며 37°C에서 24시간 동안 0.9% 식염수의 30밀리리터를 함유하고 있습니다. 다음 날, 마취 된 2 개월 된 여성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고 순차적 포비도네 요오드및 70 % 에티놀 스크럽을 수술 부위에 투여하기 위해 멸균 거즈를 사용합니다. 다음으로 목 근처의 피부를 통해 5밀리미터 절개를 합니다.그리고 10 게이지 트로카를 사용하여 장밋빛 방향으로 15mm 터널을 만듭니다. 트로카를 사용하여 펠릿을 터널에 삽입하고 수술 접착제로 절개를 밀봉하십시오. 손동포면으로 상처 가장자리를 수동으로 근사화하고 부드러운 칫솔질 스트로크를 사용하여 상대상처 가장자리의 각 면에서 1센티미터 떨어진 액체 접착제의 세 개의 박막 층을 적용합니다.그런 다음 마우스를 열 패드에 케이지에 혼자 두면 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링합니다. 안드로겐 노출의 일정한 수준을 유지하기 위해 4 주마다 펠릿을 교체. 펠릿 삽입 3일 후, p10 파이펫을 사용하여 멸균 식염수 10마이크로리터를 질 구멍에 분출하고 파이펫 팁을 사용하여 식염수를 즉시 회수합니다.질 세포 식염수 샘플을 표지된 슬라이드에 퍼감습니다. 그리고 식염수들이 실온에서 건조하도록 합니다. 말린 슬라이드를 100% 에티놀의 용기에 5분 이상 고정합니다.그런 다음 슬라이드를 버퍼 B로 1분 동안 염색하고 DIF 빠른 염색 키트에서 C를 버퍼링합니다. 완충C인큐베이션의 끝에서 는 슬라이드를 수돗물로 3초 동안 세척하고 실온에서 건조시다. 경현미경의 10배 목표 하에서 슬라이드를 볼 수 있는 에스스트러스 사이클리시티를 결정한다.각 단계의 일수를 계산하고 각 단계에서 백분율 시간을 계산하기 위해 총 일수로 나눕니다. 포도당 내성을 테스트하기 위해, 20 일 DHT 삽입, 하룻밤 마우스를 빨리. 다음 아침 마우스의 무게를 측정하고, 꼬리 정맥 혈액의 바질 포도당 수준을 측정하기 위해 글루코프터와 테스트 스트립을 사용합니다.20%의 덱스트로스트로즈의 킬로그램 당 2 그램의 마우스를 주입하십시오. 그런 다음 15, 30, 60, 90, 120 분 후 덱스트로스 투여에서 꼬리 정맥 혈액 샘플의 포도당 수준을 측정합니다. DHT 삽입 된 여자에서 여성 자손을 취득하려면, 펠릿 삽입 다음 15 일에 입증 된 비옥한 남성과 케이지에서 테스트하는 여성 마우스를 이동합니다.마우스가 임신여부를 결정하기 위해 매주 여성의 체중을 문서화합니다. 산후 7일째에, 랜싯 팁을 문신 페이스트에 담그고 발가락에 문신으로 각 새끼를 표시하십시오. 70일까지 7일마다 표시된 마우스의 무게를 측정합니다.산후 날짜 12에서 16 사이, 귀는 그림에 도시된 바와 같이 시스템에 따라 그(것)들을 번호하는 마우스를 펀치합니다. 성별을 구별하려면 태그가 지정된 각 마우스의 복부 면을 검사합니다. 암컷은 눈에 보이는 젖꼭지를 가질 것입니다.다양한 다운스트림 분석을 위한 혈액 샘플을 수집하기 위하여는 하부 정맥 출혈에 의해 9와 10 am 사이 혈액의 대략적인 실험적인 양을 수집하는 랜싯을 이용합니다. 그리고 세럼 수집을 허용하기 위해 샘플을 원심 분리합니다. 그런 다음 혈청 샘플을 분석 할 때까지 섭씨 영하 80도에서 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 저장합니다.DHT 여성 자손의 사춘기를 평가하기 위해, 산후 21일에 짜낸 후 매일, 육안 검사에 의하여 질 개구부를 확인하십시오. 그리고 구경을 사용하여 아노 생식기 거리를 측정하십시오. 혈청 DHT의 절대 값은 질량 분석과 엘리사 분석 사이에 다르지만 DHT대 DHT 삽입의 상대적 포크 변화는 분석과 실험 전반에 걸쳐 유사합니다.DHT 수준은 DHT와 노 DHT 마우스 모두에서 임신을 통해 임신전에서 크게 증가한다. 그러나, DHT 수준은 전 개념화 및 임신 시간 지점에서 DHT 마우스가 없는 것과 비교하여 DHT 마우스에서 2배 더 높습니다. 성인 DHT 딸은 생식 기능에 있는 다름을 전시합니다.예를 들어, 자궁 에서 상당히 긴 시간을 경험 하는 성인 NO DHT 딸에 비해 심 즙이 많은 사이클리시티를 중단 하 고 프로 에스테우스와 에스테르에서 더 적은 시간. 이 절차를 시도하는 동안 그들은 호르몬의 균일 한 방출에 사용 되기 전에 24 시간 동안 펠 릿을 배양 하는 것을 기억 하는 것이 중요 하다. 이 절차에 따라, DHT 노출의 생식 및 신진 대사 결과 또한 검사될 수 있습니다.그것은 개발 후, 이 기술 PCOS와 여성 마우스에 낮은 수준의 hyperandrogenism의 영향을 공부 하는 엔로크로노학 및 모계 태아 상호 작용의 분야에서 연구원에 대 한 길을 포장. DHT와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑과 마스크및 고글을 착용하고 바이오 안전 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 기사에서는 마우스에서 다낭성 난소 증후군(PCOS)을 모델링하기 위해 디하이드로테스토스테론(DHT) 펠릿을 준비하고 삽입하는 방법을 설명합니다. 예제 프로토콜은 생식 및 대사 연구에 사용되는 마우스의 절차를 보여줍니다.

피하 디하이드로테스토스테론(DHT) 치료: 다낭성 난소 증후군(PCOS)의 마우스 모델

자궁내막증의 많은 설치류 모델은 기술적 복잡성, 재현성 및/또는 면역 손상된 동물 또는 특수 리포터 마우스에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 우리는 독립적으로 검증 가능하고 객관적인 점수 매기기 시스템을 갖춘 실험용 마우스를 사용하여 병변 유도의 단순화 된 시스템을 제시하며, 난소 절제술 이나 생존 수술에 대한 요구 사항이 없습니다.

자연적으로 사이클링 마우스를 사용하는 자궁내막증의 신제닉 뮤린 모델

이 연구는 다낭성 난소 증후군 마우스 모델에서 간 포도당 생산의 직접적인 측정을 설명하며, 꼬리 정맥을 통해 안정적인 동위 원소 포도당 추적자를 사용하여 단식과 포도당이 풍부한 상태 모두에서 함께 한다.

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

다양한 성선외 조직과 장기의 난포 자극 호르몬(FSH)은 여러 질병의 발병과 관련이 있습니다. 난소 절제술 및 난포자극호르몬 처리 마우스 모델(OVF)을 사용하여 난포자극호르몬의 성선외 작용을 탐색할 수 있습니다.

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model (생쥐 모델에서 모낭 자극 호르몬의 생체 내 독립 효과 탐색)

이 연구는 임상적으로 중요한 자궁내막증의 하위 유형인 자궁내막종을 시뮬레이션하도록 특별히 설계된 새로운 마우스 모델을 소개합니다. 이 모델은 C57BL/6J 마우스를 활용하여 자궁내막종 관련 불임의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하며, 현재 생식 의학의 지식 격차를 해소할 수 있는 정교한 도구를 제공합니다.

자궁내막종과 관련된 불임을 연구하기 위한 실험적 마우스 모델 수립

이 프로토콜은 미니 펌프를 사용하여 제어된 레트로졸 방출을 통해 마우스에서 다낭성 난소 증후군(PCOS) 모델을 유도하는 기술을 소개합니다. 적절한 마취 하에 미니 펌프를 피하 주사하고, 미니 펌프 방출 일정 기간 후에 마우스에서 PCOS를 성공적으로 유도하였다.

생쥐에서 다낭성 난소 증후군을 유도하기 위한 수정된 기술

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

이 프로토콜 절연, 문화, 및 석 회화의 쥐 파생 밸브 중간 셀의 calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD)의 높은 생리 적 체 외에서 모델에 설명합니다. 이 쥐 모델의 착취 셀 및 분자 메커니즘이 복잡 한 병 적인 과정을 기초에 CAVD 연구를 촉진 한다.

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

학습하세요 다이하이드로테스토스테론 펠릿을 이용한 다낭성 난소 증후군 마우스 모델 제작 방법을. 이 기법은 일관된 호르몬 방출로 생식 내분비학 및 모자 간 상호작용 연구에 활용됩니다.

Polycystic 난소 증후군 연구 Hyperandrogenic 마우스 모델

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