Name: 홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 학습하세요 홀스타인 젖소 간 미토콘드리아에서 산소 소비량과 양성자 누출 속도를 직접 측정하는 방법을. 이 기술은 사료 효율성과 미토콘드리아 기능 연구에 필수적입니다.

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이 연구 센터를 통해 Alltech 및 USDA 해치 자금 음식 동물 건강에 UC 데이비스 수의 학부의 지원 한다.

모든 메서드, 프로토콜 및 여기서 설명 하는 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 캘리포니아 대학, 데이비스 승인 되었다.
1. 홀스타인 낙농 암소에서 간 생 검을 얻기
참고: 간 생 검은 허용한 수 의사에 의해 수행 되어야 한다. 간 생 검 젖소는 유제품 사이트에 수행할 수 있습니다. 일반적으로 젖을 계속 젖이 젖소 그리고 우유 식량 공급 절차 전후에서 철회 될 필요가 없습니다. 적어도 4 명 낙농 소에 간 생 검을 수행 해야 하는 것이 좋습니다: 생 검, 생 검 위치 및 수 의사, 세가에 펜의 외부에 실험실 기술자를 보호 하기 위해 암소의 엉덩이에 서는 동물 처리기를 수행 하는 수 의사 어 도구, 재료와 생 수 의사에서 샘플 고 뒤쪽에 차량 (그림 1), 그리고 간 샘플을 검색 하 여 미토 콘 드리 아 격리 시작 기술 자가 될 수 있는 깨끗 한 영역을 유지.
<ol><li>1 개월 간 생 검 전에 주고 소 clostridia 예방 접종. 압력가 마로 소독 외과 수건, 생 검 계기, 메스 홀더 및 수술 장비 수술 팩을 만듭니다.</li>
	<li>간 생 검 전에 1 일 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight 목에 피하와 암소를 주사. 암소 온도, 입구 및 정상적인 기능에 대 한 기준으로 사용 하 여 배설물로 점수를 모니터링 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 미토 콘 드리 아 격리 미디어 (MIM) containining 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, 및 0.1% (w/v) 지방산 무료 BSA, pH 7.4 만들기 샘플 당 약 30 mL이 필요 합니다.</li>
	<li>제 지 소 필요에 따라 물리적으로 고삐를 놓지를 활용 하 여 (그림 2). 고삐를 사용 하 여 그녀의 머리는 기둥의 왼쪽에 넥타이. 필요한 경우, 화학 구속 (Xylazine 0.010 0.015에서 염 산 100 mg/mL 4 mg/kg 체중) 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>생 검의 영역 오른쪽 10-11 늑 공간 (그림 3)에서 발견 된다. 오른쪽 어깨의 지점에 오른쪽 결 절 coxae에서 직선을 그립니다. 생 검 사이트가이 라인 10-11 늑 공간와 교차 하는 곳입니다. 10 cm의 사각형 영역 (그림 4)를 면도 하 여 biopsied 되도록 암소의 영역을 소독. 10 %providone 스크럽 (그림 5) 원형 모션을 사용 하 여 영역을 씻어. 스프레이 영역 70% 에탄올 용액 (그림 6). 반복 providone 및 에탄올 세척입니다. 참고: 간 쇠고기 가축에 비해 홀스타인 젖소에서 약간 다른 위치에 있다.</li>
	<li>피부와 내부 근육과 결합 조직 (그림 7)의 마 취를 제공 하기 위해 지역에 2% lidocaine HCl (10-15 mL)를 로컬로 주사. Providone 및 70% 에탄올 세척을 반복 합니다. 참고: 피부에 신경 엔딩은 고 하지 내부 장기, anesthestic만 로컬 하지만 근육이 필요 하다. 대부분, 암소만 느껴야 어떤 압력과 고통 생 검 절차 중.</li>
	<li>1-2 cm 자상-절 개를 통해 10-11 늑 공간 (그림 8)의 피부를 확인 합니다. 피부를 통해 Schackelford-코 티 소 간 생 검 계기를 통과 하 고 통해 횡 경 막과 간 (그림 9, 그림 10)에 계속 하는 동안 약간의 두개골 방향에 생 악기를 직접. 간 1 g 샘플을 악기 (그림 11)를 제거 합니다. 피부 봉합 배치 (그림 12)를 닫습니다.</li>
	<li>즉각적인 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 얼음에 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 MIM 원뿔 튜브에 장소 간 샘플</li>
	<li>어떤 빨갛게, 붓기에 대 한 검사 절 개 열, 또는 생 검의 24 시간 이내에 통증 및 주입 암소 목에 피하 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight (그림 13) 다음 3 일 동안 하루에 한 번. 간 생 검 후 1 주 동안 암소의 온도, 섭취 및 배설물 점수 매일 모니터링 합니다. 발열을 개발 하 고, 수 의사의 판단에 따라 항생제를 계속 합니다. 참고: 지금까지 소 간 생 검 후 1 시간 이내 터치 통증, 절 개 사이트, recumbancy, 빨갛게, 열, 또는 반응에서 내보내는 등의 흔적을 전시는 경우에 1 mg/kg bodyweight IV 주입 flunixin meglumine의 통증과 염증을 완화 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 필요한 경우 두 번째 주사를 관리할 수 있습니다.</li>
	<li>생 후 7 일 봉합을 제거 합니다.</li>
</ol>2. 미토 콘 드리 아에서 낙농 소 간 격리
<ol><li>간 샘플 암소에서 제거 후에 가능한 한 빨리 붉은 혈액 세포를 제거 하 고 잘게가 위로 샘플을 말하다 (1.3 단계) MIM에 간 샘플을 씻어. 간 촉촉한 조직 유지에 충분 한 절연 미디어를 포함 하는 냉된 비 커에 다진 합니다.</li>
	<li>0.16 m m 허가 얼음에서 incubated와 MIM (1:4 w/v)를 포함 하는 테 플 론 유 봉 다진된 간 30 mL 유리 유리병에 넣습니다.</li>
	<li>4 선/min 분 500 rpm에 테 플 론 유 봉 간 샘플 균질 참고: 간 homogenate 전체 과정에서, MIM에 얼음 포장 비 커에 보관 됩니다 및 모든 다음 원심 분리 단계 4 ° C에서 완료</li>
	<li>10 분 동안 500 x g에서 homogenate 원심, 펠 릿을 버리고, 냉장된 원심 분리기 튜브에 상쾌한을 전송 및 다음 결과 상쾌한 미토 콘 드리 아 펠 렛을 얻기 위해 10 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>Resuspend 및 지방산 무료 BSA와 MIM의 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.</li>
	<li>Resuspend와 MIM 지방산 무료 BSA 없이 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.</li>
	<li>격리 미디어의 200 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고 산소 소비와 양성자 누출 운동 분석 실험을 위해 사용 될 때까지 얼음에 놓습니다.</li>
	<li>표준으로 BSA와 제조 업체의 프로토콜 당 Bicinchoninic 산 (BCA) 키트를 사용 하 여 펠 렛 서 스 펜 션 (1/100 희석)의 단백질 농도 결정 합니다. 모든 단백질은 미토 콘 드리 아 단백질 간주.</li>
</ol>3. 미토 콘 드리 아 산소 소비 (주 3 주 4) 측정
<ol><li>5 mM Hepes와 1mm EGTA, pH 7.4 0.3 %30 ° C에서 defatted BSA, 120 m m KCl, 5mm KH2포4, 5 mM MgCl2에서 산소 소비 미디어 (OCM)를 만듭니다. 샘플 당 약 3 mL이 필요 합니다. 또한 8 μ g/mL oligomycin 에탄올에서의 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>30 ° c.에 OCM을 품 어 호흡 약 실, 펌프 및 산소 전극 제조 지시 (oxygraph 시스템)를 설정 합니다. Oxygraph 소프트웨어는 이미 컴퓨터에 설치 되어야 한다.</li>
	<li>호흡 챔버로 OCM의 1 mL를 배치 하 고 적극적으로 저 어. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다.</li>
	<li>호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 mg 단백질을 추가 하 고 30 ° c.에 온도 유지</li>
	<li>약 5 분 동안 산소 소비를 기록 합니다. Oxygraph 시스템 레코드 산소 농도 그래서 호흡 증가, 산소 농도 감소합니다. 산소 소비 되 면 상수 (감소 직선), 기록 산소 소비 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 초기 산소 소비입니다.</li>
	<li>1.25 µ L 복잡 하 4 m m로 테 논 솔루션의 추가 나 5mm 호박의 호흡기 실에서 최종 농도 도달 1 M 합성 솔루션의 5 µ L 추가. 이것은 상태 4 호흡 이다.</li>
	<li>100 μ M의 호흡 실에서 최종 농도 도달 100 m m ADP 솔루션의 1 µ L를 추가 합니다. 산소 농도 (증가 한 호흡) 줄어 다음 직선 약 5 분 후. 산소 소비를 기록 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 상태 3 호흡 이다.</li>
	<li>선택 사항: 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 하기 위해 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨) 추가 합니다. (약) 약 5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다. 이것은 극대 산소 소비입니다.</li>
	<li>호흡 제어 비율 (RCR) 방정식 상태 3 산소 소비를 사용 하 여 계산/4 산소 소비 상태.</li>
	<li>호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스.</li>
</ol>4. 미토 콘 드리 아 막 잠재력 (MMP) 및 양성자 동기 힘 (PMF) 측정
<ol><li>에탄올에 80 ng/mL nigericin의 솔루션을 준비 합니다. 참고: 이러한 화학 물질은 에탄올, 해산 하 고 모든 노력 에탄올 전자 교통 시스템 연결을 푸십시오 하 고 mitchondrial 장애를 일으킬 수 있기 때문에 1 μ, 추가 되는 에탄올의 양을 제한 하 여야 한다.</li>
	<li>철저 하 게 rinsing 후 이중 이온된 수와 챔버, 1 mL는 OCM의 호흡 챔버에 놓고 저으 적극적으로 자기 저 어 바. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다. 메 틸-triphenyl-phosphonium (TPMP +) 민감한 전극 설치 챔버를 추가 합니다. TPMP + 전극 pH 미터에 연결 되어야 하 고 값 pH 미터에서 읽혀집니다.</li>
	<li>호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 밀리 그램을 추가 합니다.</li>
	<li>(약) 2-5 분에 대 한 복잡 한 I. 기록 호흡을 억제 하기 위해 4 m m로 테 논 솔루션의 1.25 µ L를 추가 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.</li>
	<li>2.8 µ g oligomycin ADP 사용률을 억제 하기 위해 미토 콘 드리 아 단백질의 /0.35 mg의 최종 농도 대 한 8 μ g/mL oligomycin 솔루션의 0.56 μ를 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.</li>
	<li>미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 pH 기온 변화도 폐지 하 고 0.112 μ 80 ng/mL nigericin 솔루션을 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다. 참고:로 테 논과 oligomycin 전자 수송을 차단 하는 데 사용 됩니다 체인 복잡 한에 어 ATP synthase, 각각. Nigericin 전극으로 측정 될 수 있다 K + 그라데이션 막 횡단 H + 그라데이션 변환에 추가 됩니다.</li>
	<li>미토 콘 드리 아 외피를 10 m m TPMP + 솔루션의 5 µ L을 추가 하 여 TPMP +에 대 한 표준 곡선을 준비 합니다. TPMP + 2.5 μ M의 총 농도 추가 될 때까지이 단계 4 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>실로 1m 호박의 5 μ를 추가 하 여 호흡을 시작 합니다.</li>
	<li>안정 된 추적을 달성 때까지 호흡을 기록 하 고 malonate를 추가 하 여 시스템을 적정 하십시오. Malonate의 추가 0.5 µ L, 1 µ L, 1.5 µ L, 3.0 µ L, 6.0 µ L, 9.0 µ L, 0.1 m m의 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8, 보육 실에서 malonate 농도의 연속 추가 달성 하기 위해 Malonate 솔루션 및 2.5 m m의 다음 12.5 µ L 이어야 한다.</li>
	<li>두 개의 전극 (산소와 TPMP+)에서 데이터를 수집 합니다. 미토 콘 드 리아 산소 소비와 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 동시 측정을 수집 하 여 실시간으로 산소 소비에 변화 관찰 oxygraph 시스템에서 데이터 수집 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 그림 14 oxygraph 시스템 실험 진행으로 산소 소비를 기록 하는 방법을 보여 줍니다.</li>
	<li>Nernst 방정식에 따라 mV에 MMP를 계산: MMP 61.5 로그 = ([TPMP +] 추가-외부 [TPMP +]) x TPMP+ 바인딩 수정 / (단백질/ml 0.001 x mg x [TPMP +]) 미토 콘 드리 아 단백질-1 의 0.4 µ L/mg의 TPMP + 바인딩 수정 사용 됩니다. 예제 계산 프로토콜에 농도에 따라: MMP = 0.4 x 61.5 x 로그 (5 µ M-2 µ M) / (0.001 x 0.35 mg 미토 콘 드리 아 단백질/mL x 2 µ M) MMP 198.9 = mV</li>
	<li>견적 PMF MMP 대 산소 소비 (그림 15)의 그래프를 그려서. PMF 165의 막 잠재력에 산소 소비량으로 보고 mV. 참고: Titrating malonate (0.1 ~ 2.5 m m)와 전자 전송 체인 MMP를 양성자 누출의 운동 응답을 보여 줍니다. 다음, 산소 소비에 대 한 MMP를 플로팅 양성자 누출 속도를 결정 합니다. PMF 일반적인 막 잠재력에 산소 소비를 계산 하 여 결정 (165 mV).</li>
	<li>샘플의 마지막 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 및 릴리스 TPMP + 기준 정정 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨)을 추가 합니다.</li>
	<li>호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스. 하루의 끝에, 챔버 한다 또한 수 씻어 서 몇 번 에탄올과.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

프로토콜에서 가장 중요 한 포인트는 대표 간 조직 샘플을 얻기 이며 생 후 즉시 미토 콘 드리 아의 격리를 시작. 호흡 측정에 변이 실험실으로 암소에서 짧은 전송 시간으로 인해 낮은 (표 1). 전송 시간을 줄이기 위해, 작은 실험실 세워졌다는 유제품의 사무실에서 그리고 각 미토 콘 드리 아 생의 10 분 안에 고립 됐다 있도록 수집으로 간 샘플 사무실 실험실에 기반 했다. 설치 및 사용 기록 차이 양성자 기온 변화도에 하루 전에 수집 하 고 처리 하는 샘플 양성자 누출에서 초기 측정 누락 등 오작동을 방지할 수 있습니다 pH 미터 호흡 챔버 및 전극 (산소, TPMP +)의 테스트 속도 론 (그림 16)입니다.
신선한 간 샘플 및 미토 콘 드리 아의 신속한 격리에 대 한 필요 때문에 수집 되 고 하루에 처리 될 수 있는 샘플의 수는 제한 됩니다. 각 샘플 완료; 약 5-6 시간 걸립니다. 따라서...

미토 콘 드리 아 스트레스에 매우 민감합니다 그리고 그들의 세포질 환경 다양 한 대사 질환에 기여할 수 있다. 산소 소비와 양성자 누출 미토 콘 드리 아에는 미토 콘 드리 아 건강의 지표입니다. 산소 소비와 양성자 누출 없이 RCR을 사용 하 여이 종이 견적 미토 콘 드 리아 에너지 효율에 설명 된 방법을 기반으로 합니다. 이러한 결과 영양소 사용률1에서 손실 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다. 산소 소비와 양성자 누출에 변화는 신진 대사 질환에 기여 하 고 감소 에너지 효율에서 결과 미토 콘 드 리아 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법 또한 미토 콘 드리 아 호흡에 다른 처리의 효과 검사를 사용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 측정의 전반적인 목표는 미토 콘 드리 아 기능 및 에너지 효율 평가입니다.
간 미토 콘 드 리아 기능 장애 젖소에 여러 가지 질병으로 연결 되었습니다. 수 유 초기에 에너지 적자를 직면 하는 때 지질과 탄수화물 연료 전환 세포질 물질 대사 수 숫자 셀2에 미토 콘 드리 아의 기능에 의해 좌우 된다. 에너지와 증가 β-산화에 대 한 증가 수요에 적응 하는 미토 콘 드리 아의 능력에 결함이 인슐린 저항와 관련 된 세포내 지질의 축적으로 이어질 수 있습니다 그리고 젖소 초 유에에서 지방 간의 형성으로 이어질 수 있습니다. 미토 콘 드리 아, 케 톤 체 생산 및 사용의 사이트로 젖소3ketosis에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 또는 미토 콘 드 리아 기능 장애의 부족 주변에 연료 가용성에 영향을 미칠 것이 고 산소 소비 또는 RCR 변화에 반영.
염증 반응의 미토 콘 드리 아 산소 소비 변화입니다. 7-하루-오래 된 브로 일러에 감염 된 Eimeria 맥시 마 와 제어 그룹4그룹에 무작위로 지정 되었다. Coccidiosis 도전 받아야 하지 않았다 broilers 양성자 누출 및 높은 RCR 간 미토 콘 드리 아 증가 양성자 누출에 의해 면역도 전에 대응을 나타내는 낮은 산소 소비를 했다. 양성자 누출 동안 및 반응성 산소 종 생산 미토 콘 드 리아 멤브레인 부전의 상징으로 간주 한 번 했다 고 에너지 효율, 해로운 지금 알려져 있다 미토 콘 드리 아5 으로 단백질과 칼슘의 가져오기에 대 한 중요 하다는 것 열1의 세대에 대 한.
호흡기 체인에서 전자 누출에 게 미토 콘 드리 아 반응 산소 종 생산 및 산화 손상에 취약 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, 지질 및 미토 콘 드리 아 DNA. 미토 콘 드리 아 나이, 손상 더 미토 콘 드리 아 대사6 에 더 큰 민감성 질병에 암소의 부전을 일으키는 mtDNA를 특히 누적 될 수 있습니다. 실제로, 많은 가축 동물 보충 항 산화 기능을 강화 하는 Cu, Zn와 Mn 등의 상부를 먹인 다. 그러나, 높은 수준의 Cu, Zn와 Mn 우유 생산 감소 유와 양성자 누출 (상태 4 호흡)7인 산소 소비를 증가.
미토 콘 드 리아 기능 가축에 에너지 효율에서의 역할에 대 한 이전 연구는 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출에 변화에 집중 했다. 젖소에 거의 연구 출판 되었습니다 및 대부분 논문 쇠고기 가축에 미토 콘 드리 아 기능에 잔여 먹이 섭취 (RFI)의 형태로 생산 효율을 비교 합니다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양모 홀스타인 암소를 젖을 쇠고기 간에서 주 3, 주 4 및 RCR을 측정 하 여 시험 되었다 다양성 소 (앵거스, Brangus와 헤 리)8. 연구원은 성장 또는 쇠고기 가축에 대 한 특성을 짤 미토 콘 드리 아 호흡에 어떤 상관 관계를 찾지 못했습니다 하지만 미토 콘 드리 아 호흡 및 우유 홀스타인 열에 대 한 특성 간의 상관 관계를 보고 했다. 두 연구, RFI 근육 mitochondria9,10에 미토 콘 드리 아 호흡 요금 (3, 4 주와 RCR 상태) 쇠고기 가축에 비교 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 DMI에 대 한 응답에서 변경 하 고 낮은 속도 덜 효율적인 쇠고기 steers와 관련 되었다. 또 다른 연구에서는, 높은 또는 낮은 RFI 불스에서 steers의 RFI 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양성자 누출 속도 론 자손11의 두 그룹 사이 비교 되었다. 차이 때문에 이득 얻을 결론 쇠고기 가축에서 미토 콘 드리 아 호흡을 영향 하지 않습니다 확인 했다.
이 논문에서는, 실험 3 항 산화 미네랄 양모 젖소를 먹이에 대 한 응답 RCR에서는 측정 하는 방법 사용 하는 간 검사 중 산소 소비 4 고 3 호흡 및 PMF 상태.

<table><tbody><tr><td>Liver Biopsy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney 소 간 생검 기구</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>봉합 바늘</td><td>NA</td><td></td><td>포함 봉합사</td></tr><tr><td>메스</td><td>포함 시그마 - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># 핸들 및 블레이드용</td></tr><tr><td>수술용 수건</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 튜브 50mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>50mL 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>주사 바늘 (22, 2 1/2)</td> <td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>암소 고삐</td><td>트랙터 공급 유한</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>면 거즈 사각형 (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>의료용 가위</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td><td></td><td></td><td>제공 수</td></tr>의사 <tr><td>Clostridia 백신</td><td></td><td></td> 수<td>의사</td></tr><tr><td>제공 간 생검 항생제 엑세넬 2cc/100lbs, 3일</td><td></td><td></td><td></td>동안</tr> 수의사 <tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Veteterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>Sigma 제공 - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg </td><td></td><td></td> 체중 수<td>의사 제공</td></tr><tr><td>2% 리도카인 HCl (10-15mL)</td><td></td><td></td> 수<td>의사 제공</td></tr><tr><td>플루닉신 메글루민</td><td></td><td></td> 1mg/kg IV 주<td>사 수의사 제공</td></tr><tr><td>미토콘드리아(간) 분리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.16mm 간격의 테프론 유봉이 있는 Wheaton 바이알 30mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>균질화 모터</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>균질화 프로브</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>자동 피펫(10mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>얼음이 있는 비커(500mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>냉장 마이크로퓨지</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>마이크로fuge 튜브(1.5mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)abcam</td><td></td> <td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>트리스-HCl</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA(지방산 무함유)</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>만니톨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>미토콘드리아 분리 매체를 만드는 데 사용: 220 mM 만니톨, 70 mM 자당, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA 및 0.1% (w/v) 지방산 무료 BSA,&nbsp; pH 7.4 at 4 &g; C, 냉장고</td><td></td><td></td><td></td>에서 2 일 지속</tr><tr><td>Mitochondria 산소 흡수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>>< 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oxygraph 설정 + Clark type 산소 전극</td><td>Hansatech (PP Systems)</td> <td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 워터 펌프</td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>Clark 타입 산소 전극</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Autopipette (1 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>Oxy1</td></tr><tr><td>Small magnetic stir bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (10 &mu; L)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Sigma</td><td>- Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>미토콘드리아 산소 소비 매체를 만드는 데 사용: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes 및 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7.4 at 30 &deg; 0.3% 탈지 BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>로테논이 함유된 C(4mM 용액)</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>숙시네이트(1M 용액)</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP(100mM 용액)</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>올리고마이신(8μ 용액); g/mL in ethanol)</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP electrode</td><td>World Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals-solutions는 신선할 필요는 없지만 실행 사이에 냉동고에 보관해야 합니다</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malonate (0.1 mM solution)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin (8 &mu; g/mL in ethanol), 냉동고에 보관</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), 냉동고에 보관</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP 용액: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes 및 1 mM EGTA,&nbsp; 30°C에서 pH 7.4 & 0.3% 탈지 BSA</td><td></td><td></td><td></td>를 함유한 C</tr></tbody></table>

홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

산소 소비, 양성자 동기 힘 (PMF) 그리고 양성자 누출 측정의 미토 콘 드리 아 호흡, 또는 얼마나 잘 미토 콘 드리 아 ATP로 NADH와 FADH 변환할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아도 산소 사용 및 이산화탄소와 물에 영양분 산화에 대 한 기본 사이트 이기 때문에, 그들이 얼마나 효율적으로 산소를 사용 하 고 직접 ATP를 생산 영양소 대사의 효율성에 관한 동물의 영양소 요구 사항 및 동물의 건강입니다. 이 방법의 목적은 다른 약물, 다이어트와 미토 콘 드리 아 대사에 환경에 미치는 영향의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 미토 콘 드리 아 호흡을 살펴보는 것입니다. 결과 산소 소비를 양성자 종속 호흡 (주 3) 및 양성자 누출 종속 호흡 (주 4)으로 측정 포함 됩니다. 주 3 / 주 4 호흡의 비율 호흡 제어 비율 (RCR)로 정의 되 고 미토 콘 드리 아 에너지 효율을 나타낼 수 있습니다. 미토 콘 드 리아 양성자 누출에서 ADP ATP 합성의 효율을 감소 연결을 푸는 산화 인 산화에 의해 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)의 소비를 허용 하는 프로세스입니다. 미토 콘 드리 아 기질 및 전자 수송 체인 억제제 산소와 TRMP + 민감한 전극 상태 3 주 4 호흡, 미토 콘 드 리아 멤브레인 PMF (또는 ATP 생산 잠재력)를 측정 하는 데 사용는 양성자 누출. 이 방법에 한계는 간 조직을 최대한 신선한 해야 모든 생 검 및 분석 실험 10 h이 하에서 수행 되어야 합니다. 이 샘플을 수집 하 고 약 5 하루에 한 사람에 의해 처리 수의 수를 제한 합니다. 그러나, 간 조직 1 g만 필요, 그래서 젖소와 같은 큰 동물에 필요한 샘플의 금액은 간 크기에 상대적으로 작은 작은 복구 시간이 필요 합니다.

RCR와 양성자 누출 속도 보여주는 긍정적인 결과 각각 표 1 과 그림 15에 표시 됩니다. 이 연구7, RCR 및 단백질 누출에서 속도 론 측정 되었다 홀스타인 젖소에서 우유에 70 일 후 소는 28 일에 대 한 Cu, Zn와 Mn의 5 가지 레벨의 1을 공급 했다. 주 4, 최대 양성자 누출 종속 호흡, Cu, Mn, Zn (p &lt; 0.1)의 미네랄 섭취에 의해 영향을 받을 하는 경향이 있었다. 주 3 호흡 (최대 ATP 자극 호흡) 및 RCR = 상태 3 / 상태 4 (호흡 제어 비율)은 미네랄 섭취에 의해 영향을 받지 않습니다. 4 호흡 했다 LowMn에서 최고 및 최저 컨트롤, 미네소타 최소화 양성자 누출 종속 호흡에 중요 한 역할을 합니다 나타내는 상태. 망간 Mn Superoxide Dismutase 효소를 통해...

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 산소 소비, 영양에 너 지론, 및 양성자 누출, 미토 콘 드리 아에서 ATP 비능률적의 주요 원인의 정의 개념을 측정 하기 위한 방법 공유. 이러한 결과 미토 콘 드리 아 기능을 평가할 수 있도록 영양소 사용률에 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다.

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

이 방법은 미토콘드리아 건강, 에너지 효율 및 에너지 사용과 같은 에너지 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고립 된 미토콘드리아의 산소 소비가 직접 측정된다는 것입니다. 결과는 다른 세포 내 신진 대사 과정에 대해 수정 할 필요가 없습니다.우리는 먼저 미토콘드리아 효율이 공급 효율성에 미치는 영향을 조사하고 싶었을 때 유제품 가축에서이 방법을 추구하기로 결정했습니다. 이 방법의 비디오 데모는 미토콘드리아 격리의 단계가 일관되고 정확해야 하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 간 샘플을 제거한 후 가능한 한 빨리 소에서 제거된 후 미토콘드리아 격리 매체에서 샘플을 세척하여 적혈구를 제거한다.가위를 사용하여 조직을 미세하게 진정된 비커로 다진데, 이 비커에는 조직을 촉촉하게 유지하기에 충분한 격리 매체가 들어 있습니다. 미토콘드리아 격리 매체를 함유한 30밀리리터 유리 바이알로 다진 간을 옮기다. 0.16 밀리미터의 클리어런스를 가지고 있으며 얼음에서 배양된 테플론 유봉을 넣고 500 RPM에서 분당 4스트로크로 1분 동안 간 샘플을 균질화합니다.그 후, 균주를 미토콘드리아 격리 매체가 들어있는 튜브로 옮기고 얼음으로 가득찬 비커에 넣습니다. 원심분리기는 G 500회, 섭씨 4도에서 10분간 동종합니다. 펠릿을 버리고 상체를 차가운 원심분리기 튜브로 옮춥니다.미토콘드리아 펠릿을 얻기 위해 10, 000배, 섭씨 4도에서 10분간 생성된 상체원분리. 지방산이 없는 BSA를 사용하여 미토콘드리아 격리 매체의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세척하십시오. 그런 다음 원심 분리기는 8, 100 배 G, 섭씨 4도에서 10 분 동안.상체를 버리고 격리 매체의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 산소 소비와 양성자 누출 운동 분석에 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 이것을 놓습니다. BSA를 사용하여 제조업체의 지침당 bicinchoninicacid 산 키트를 사용하여 펠릿 현탁액의 단백질 농도를 결정합니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 산소 소비 미디어를 만듭니다. 산소 소비 매체를 섭씨 30도에서 배양합니다. 다음으로, 제조업체의 지시에 따라 옥시그래프 시스템에 대한 호흡챔버, 펌프 및 산소 전극을 설정한다.그런 다음 산소 소비 매체 의 1 밀리리터를 호흡 실에 놓습니다. 그런 다음 챔버에 미토콘드리아 단백질0.35 밀리그램을 추가합니다. 용액이 공기로 포화되고 섭씨 30도의 온도를 유지하기 위해 적극적으로 저어줍니다.약 5분 동안 산소 소비를 기록합니다. 산소 소비가 감소하는 직선으로 일정하게 표시되면 이를 기준산소 소비로 기록하십시오. 복잡한 용액을 억제하기 위해 4 밀리 마일러 로테네 용액의 1.25 마이크로 리터를 추가 한 다음 1 개의 어금니 간편 한 용액의 5 마이크로 리터를 추가하여 호흡실에서 간결한 5 밀리머의 최종 농도에 도달하십시오.이것은 상태 IV 산소 소비. 그 후, 100밀리머 ADP 용액의 마이크로리터 1개를 추가하여 호흡실에서 100마이크로몰러의 최종 농도에 도달한다. 산소 소비는 약 5 분 동안 감소하고 직선이 될 것입니다.상태 III 호흡으로이 산소 소비를 기록합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 호흡 제어 비율을 계산합니다. 그런 다음 호흡 실에서 모든 솔루션을 흡인합니다.이중 탈이온된 물로 챔버를 여러 번 헹구는 다. 먼저, 에탄올에서 나이지리아의 밀리리터당 80나노그램의 용액을 준비하여 1편 미만의 마이크로리터에 첨가된 에탄올의 양을 제한한다. 또한, 에탄올에서 밀리리터 올리고마이신 당 8 마이크로그램의 용액을 준비한다.이중 산화물로 챔버를 철저히 헹구고 산소 소비 매체 1밀리리터를 호흡실에 넣고 자기 교반 바에 힘차게 저어줍니다. 호흡 챔버에 미토콘드리아 단백질0.35 밀리그램을 추가합니다. 메틸 트리페닐포스포늄에 민감한 전극을 챔버 셋업에 추가하여 다른 쪽 끝이 pH 미터에 제대로 연결되어 있는지 확인합니다.복합 I.레코드 2 ~5 분 동안 호흡을 억제하기 위해 4 밀리 머 롤러 로테네 솔루션의 1.25 마이크로 리터를 추가합니다. 산소 소비 값을 일정하게 되면 기록합니다. 다음으로, ADP 활용도를 저해하기 위해 올리고마이신 용액의 0.56 마이크로리터를 추가합니다.호흡을 약 2~5분 동안 기록합니다. 산소 소비 값을 일정하게 되면 기록합니다. 그런 다음 밀리리터 니제르리시틴 용액당 80 나노그램의 0.112 마이크로리터를 추가하여 미토콘드리아 내막을 가로지르는 pH 그라데이션을 폐지한다.2~5분 동안 호흡을 기록하고 일정해질 때 산소 소비 값을 기록합니다. 표준 곡선을 준비하기 시작하기 위해 미토콘드리아 인큐베이션에 10 밀리머메틸 메틸 트리헤닐 포스포늄 용액 5개소소기를 첨가한다. 총 농도가 2.5일 때까지 이 추가를 4회 더 반복합니다.마이크로몰러가 추가되었습니다. 그 후, 호흡을 시작하기 위해 챔버에 하나의 어금니 간결한 용액의 5 개의 마이크로 리터를 추가합니다. 안정적인 추적이 이루어질 때까지 호흡을 기록합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시스템을 적티레이에 말로나테를 추가합니다. 이 연구에서 RCR 및 양성자 누출 운동학은 젖소가 28 일 동안 구리, 아연 및 망간의 다른 수준으로 공급 된 후 70 일 후에 홀스타인 낙농 소의 우유에서 측정됩니다. 상태 IV 호흡은 망간의 낮은 수준을 주어진 소에서 가장 높은 것으로 볼 수 있습니다, 아직 제어 소에서 가장 낮은, 망간 양성자 누출 의존 호흡을 최소화에 중요한 역할을 나타냅니다.간 간 누출 의존호흡의 분석은 이 호흡이 낮은 망간으로 취급된 소에서 가장 크고, 통제소에서 가장 낮다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 낮은 망간 그룹이 가장 큰 상태 IV 호흡을 가지고 있음을 확인하며 대조군은 가장 낮다. 높은 RFI 황소보다 낮은 RFI 황소에서 태어난 앵거스 조인에서 사료 효율이 높지만, 이것은 미토콘드리아 RCR 또는 양성자 누출 운동학에 반영되지 않았습니다.이 절차를 수행하는 동안 미토콘드리아를 처리하는 동안 얼음에 모든 바이알과 비커를 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후이 기술은 간에서 공급 효율과 미토콘드리아 기능에 미토콘드리아 효율의 역할을 탐구하는 유제품 영양 분야의 연구자들을위한 길을 열었습니다. 로테네톤으로 일하는 것은 위험할 수 있으며, 장갑, 눈 보호 및 적절한 PPE 착용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

근원:엘레트라 레오1, 루이자 H.D. 카르도소1, 사빈 슈미트1, 에리히 그나이거11오로보로스 악기이 비디오는 산소 플럭스가 살아있는 포유류 세포와 투과화된 포유류 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 다양한 호흡 상태를 특성화하기 위해 디지토닌, 대사 기질, ADP, 언커플러 및 억제제를 순차적으로 사용하는 방법을 보여줍니다. 생성된 산소 플럭스 프로파일은 정의된 조건에서 미토콘드리아 기능과 에너지 결합 효율을 나타냅니다.

살아있는 세포와 투과화된 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하기 위한 산소 플럭스 측정

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

우리는 현장에서 포획한 야생 동물의 고립된 미토콘드리아에서 호흡수를 측정하기 위해 이동식 실험실을 설계하고 건설했습니다. 여기에서는 이동식 미토콘드리아 실험실의 설계 및 의장과 관련 실험실 프로토콜에 대해 설명합니다.

현장에서 미토콘드리아 에너지를 측정하기 위한 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실 개발

형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

말은 뛰어난 유산소 운동 능력을 가지고 있어 말 골격근을 말 운동 생리학 연구와 포유류 미토콘드리아 생리학 연구 모두에 중요한 조직으로 만듭니다. 이 기사에서는 말 골격근의 미토콘드리아 기능을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다.

말 골격근의 고분해능 불소 호흡 측정

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

여기에서는 인간 또는 생쥐 근육의 신선한 투과화된 골격근 섬유에서 미토콘드리아 산화 인산화를 측정하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 호흡을 실시간으로 정량화하고 연료 선호도 및 대사 유연성을 평가하는 동시에 기존 미토콘드리아 네트워크와 멤브레인 무결성을 유지할 수 있습니다.

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정

학습하세요 홀스타인 젖소 간 미토콘드리아에서 산소 소비량과 양성자 누출 속도를 직접 측정하는 방법을. 이 기술은 사료 효율성과 미토콘드리아 기능 연구에 필수적입니다.

홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정

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