Name: 표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 Folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 Nanoprobe Ratiometry 대상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 배우세요 난소암 전이를 검출하기 위한 엽산 수용체 표적화 표면 강화 공명 라만 나노프로브 비율 측정법을 통해 정확한 종양 영상화를 수행하는 방법을. 이 기술은 미세 종양을 정밀하게 식별하여 진단 정확도를 향상시킵니다.

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(M.F.K.)에 다음과 같은 자금 출처 인정: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 및 K08 CA16396; 데이먼 Runyon-Rachleff 혁신 상을 DRR-29-14, 퍼싱 스퀘어 손 수상 퍼싱 스퀘어 손 암 연구 연립, 그리고 MSKCC 센터 분자 이미징 & 나노기술 (CMINT) 및 기술 개발에 대 한 권한을 부여합니다. 승인은 MSKCC NIH 코어 그랜트 (P30-CA008748)에서 제공 하는 교부 금 자금 지원에도 확장 된다.

모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 기념 슬로 안 Kettering 암 센터 (#06-07-011)에 의해 승인 되었다.
1. 골드 Nanostar 코어 합성
참고: 골드 nanostars 두 맛이이 실험에 사용 되는 SERRS nanoprobes의 코어로 사용 됩니다.
<ol><li>60mm 의약품 (C6H8O6) 솔루션 이온된 (DI) 수와 디 물에 20 mM tetrachloroauric 산 (HAuCl4) 솔루션의 8 mL의 800 mL를 준비 합니다. 4 ° c에 냉각</li>
	<li>4 ° c.에이 반응 단계를 수행 마그네틱 저 어 접시에 의약품 솔루션의 800 mL를 포함 하는 원뿔 플라스 크를 배치 하 고 꾸준한 소용돌이 유도. 신속 하 게 소용돌이에 tetrachloroauric 산 성 솔루션의 8 mL를 추가 합니다. 초 이내에, nanostars 형성 하 고 솔루션 어두운 파란색을 가정 합니다 합니다. 경우에 언제 든 지 색상 분홍색 또는 자주색, 나노, 현 탁 액의 형성을 삭제 한다 상징 및 다시 합성 된다.</li>
	<li>50 mL 원뿔 관, 및 (4 ° C, 3,220 x g) 20 분 동안 원심 분리기 nanostar 정지 하 거 라. 각 관에는 솔루션의 대략 200 µ L를 떠나 상쾌한 발음 튜브의 하단에 나노 입자의 펠 렛을 방해 하지에 주의 지불 해야 합니다. 참고: 나머지 정지 nanostars 때문에 상쾌한 푸른 색조를 있어야 합니다.</li>
	<li>사용 하는 micropipette, 일시 중지 하 여 각 관에서은 나노 입자를 수집 솔루션 교 반 하십시오. 펠 릿의 일부 튜브의 바닥에 압축 될 수 있습니다 그리고이 부분 활기찬 pipetting 폐기와도 resuspend 하지 것입니다.</li>
	<li>투 석 카세트 (MWCO 3.5 kDa) 나노 서 스 펜 션 전송 및 적어도 3 일 매일 물을 변경 디 물 2 L에 대 한 dialyze. 3-4 일 마다 물 변화 한 달까지 4 ° C에서 투 석에서 nanostars을 저장 합니다. 참고: 섹션 2에에서 설명 된 대로 투 석 silication 반응에 필요한 때까지에 nanostars는 유지 한다.</li>
</ol>2입니다. 실리 카 포탄의 형성
참고: 라만 nanoprobes의 2 개의 풍미 합성 됩니다. 합성 절차 라 기자 분자 (염료) 사용 되 고 유일한 차이 둘 다를 위해 동일 이다. 이 실험에서 IR780 과염소산염 및 IR140 사용 됩니다. 반응이 항상 플라스틱 용기에서 수행 되어야 합니다. 합성 확장성 이며 필요한 injectate의 원하는 금액에 대 한 조정 될 수 있다. 여기, 중간 일괄 합성 기술 된다는 같은 농도와 반응 시간 필요에 따라 낮은 또는 높은 볼륨을 선형으로 확장할 수 있습니다. SERRS nanoprobe 두가지에 대 한 반응은 동시에 수행할 수 있습니다. 교차 오염을 방지에 주의. 쥡니다 단계, 세척 하는 동안 나는 나노 입자를 1 시간 이상 저장 한 후 원심 분리 후 나노 펠 릿의 redispersion에 대 한 수행 되어야 한다. 나노 입자는 일반적으로 1에 대 한 솔루션으로 명확 하 게 일시 중지 될 때까지 수행 해야 하는 쥡니다 s.
<ol><li>튜브 A (50 mL 원뿔 튜브), 소 프로 파 놀, TEOS, 디 물, 200 µ L의 500 µ L 및 염료 (IR780 과염소산염 또는 IR140, DMF (dimethylformamide)에 20 m m)의 60 µ L의 10ml를 혼합.</li>
	<li>튜브 B (15 mL 원뿔 튜브), 에탄올의 3 mL 및 수산화 암모늄의 200 µ L을 혼합. 분산 솔루션에서 모든 클러스터를 하 고 nanostars의 1.2 mL 튜브 단계 1.4에서 nanostars sonicate 참고: 수산화 암모늄 솔루션은 높은 휘발성 하 고 정확 하 게 플라스틱 어렵다. Pipetting 촉진 하기 위하여 필요한 때까지 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>와 동 믹서에 관 A를 놓고 꾸준한 소용돌이 유도 합니다. 빠르게 소용돌이로 관 B의 내용을 추가 하 고 약 5 혼합 계속 미 셰이 커와 상 온에서 300 rpm에서 떨고 있는 동안 15 분에 대 한 반응에 즉시 전송.</li>
	<li>15 분 부 화 후 에탄올 50ml 튜브를 채우기 위해 추가 하 여 반응을 끄다. 3,220 x g 와 4 ° C에서 20 분 동안 원심 분리기</li>
	<li>솔루션, 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의의 약 0.5 mL를 떠나 상쾌한 발음 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 resuspend는 나노 입자를 피 펫을 선동. 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 전송 하 고 4 분 11000 x g 에서 centrifuging, 상쾌한, 발음 및 펠 릿 ultrasonication 약 1, resuspending에 의해 에탄올과 4 번을 씻어 s. 참고: 이 단계에서 silicated 나노 입자 수 기능성, 3, 섹션에 설명 된 대로 또는, 주일 4 ° C에서 저장 한 추가 세척 단계와 디 물에 resuspended.</li>
</ol>3. 표면 기능화
참고: IR780 SERRS nanoprobes 양식 αFR-NPs;로 못 crosslinker 통해 엽 산 수용 체를 대상으로 항 체와 함께 활용 될 것입니다. IR140 SERRS 제어 nanoprobes nt NPs에 대 한 청 못 단층으로 활용 될 것입니다. 두 맛 별도 하지만 병렬 반응에서 thiol maleimide 반응을 통해 형성 된다.
<ol><li>두 번을 4 분 11000 x g 에서 centrifuging, 상쾌한, 발음 ultrasonication에 의해 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 resuspending 나노 입자를 씻어. 한 번 더 세척 단계를 반복 하지만 디 물 1 ml 에탄올 85%, 10 %3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane), 및 5%의 redisperse. 입자 표면에 thiols를 소개 하는 1-2 h에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>4 분 11000 x g 에서 centrifuging와 발음은 상쾌한 ultrasonication, 에탄올, 디에 두 번에 두 번으로 펠 릿을 resuspending thiol 기능성된 나노 입자를 씻어 그리고 마침내 HEPES에서 (4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic 산) 버퍼 (10 m m, pH 7.1), 그리고 설정 옆으로. 참고: MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산) 버퍼 또는 HEPES을 사용 해야 합니다. PBS (인산 염 버퍼 식 염 수), 등 높은 염 분 버퍼 나노 집계를 유도 수 있습니다.</li>
	<li>기능성된 항 체 αFR-NPs에 대 한 항 체 (항 엽 산 바인딩 단백질 항 체 클론 [LK26])의 200 µ g의 말뚝 crosslinker (poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) 에테르 n ′-(3-10 배 어 금 니 과잉 반응 maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에) 30 분 MES 버퍼 (10 m m, pH 7.1)의 500 µ L에서.</li>
	<li>초과 crosslinker를 제거 하 고 원심 필터 (MWCO 100 kDa)에서 항 체 못 솔루션 centrifuging 여 항 체를 집중. 이 연구에 사용 되는 원심 필터에 대 한 수행 14000 x g 에서 10 분 및 23 ° c.에 대 한 원심 분리 필터 반전 및 1000 x g 2 분에 centrifuging 신선한 튜브에 활용 된 항 체를 복구 합니다.</li>
	<li>플라스틱 단계 3.2에서 항 체와 튜브에 IR780 나노 입자와 혼합을 피 펫을 선동. 적어도 30 분을 위한 혼합물을 품 어 방 온도, 또는, 또는 양식 αFR-NPs 하룻밤 4 ° C에서.</li>
	<li>Nt-NPs를 형성, 추가 1 %w / v methoxy 종료 (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) 단계 3.2 및 500 µ L MES 버퍼 (10 m m, pH 7.1), 실내 온도에 적어도 30 분에 게 반응에서 IR140 SERRS 나노 입자에 DMSO에 용 해 또는, 양자 택일로 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>마우스 (5 절), 두 nanoprobe 맛 4 분 11000 x g 에 아래로 회전 관리에 대 한 무료 unreacted 항 체/못, 솔루션을 제거 하려면 상쾌한 발음 하 고 MES buffer (10 m m, pH 7.1) 600 오후 농도에서 각각의 맛 redisperse . Resuspending는 나노 입자 때 초음파, 항 체의 변성을 방지 하기 위해 불필요 한 노출을 최소화 합니다.</li>
</ol>4. 마우스 모델 개발
<ol><li>인간의 난소 선 (SKOV-3) 암 세포 라인의 꾸준한 문화를 설정 합니다. 필요한 경우, 생물 발광/형광을 통해 모니터링 활성화, transfected SKOV 3 Luc+/GFP+ 세포를 사용 합니다. 일주일에 두 번 통과와 10% 태아 종 아리 혈 청 RPMI (로스웰 파크 기념 연구소) 매체에 문화 세포. 주입, 0.25% trypsin/0.05% EDTA 3 분 분리 후 세척 하 고 2 x 106 셀/100 µ L에 PBS에 resuspend를 가진 세포를 품 어.</li>
	<li>난소 micrometastasis 모델을 설정 하기 위해 athymic 여성 쥐 (FOXn1nu/FOXn1nu 마우스, 6-8 주 이전)에 일시 SKOV-3 셀의 200 µ L을 intraperitoneally 주사. 전파 복 막 확산은 약 4 주 동안에서 발생 합니다. SKOV 3 Luc+ 세포를 사용 하는 경우 종양 성장 retroorbital 주입을 통해 50 µ L PBS에 딱정벌레 소의 2 mg을 투여 하 여 생물 발광을 모니터링할 수 있습니다.</li>
</ol>5. Nanoprobe 주입 및 이미징
<ol><li>섹션 1-3, 300의 최종 농도 대 한 1:1 비율로 믹스에 설명 된 대로 nanoprobes (αFR-NPs와 nt NPs) 준비 (10 m m, pH 7.1) MES 버퍼에 각 유형의 오후. 필요에 따라 준비 하는 30의 기준 작은 (100 µ L) 원뿔 튜브에 nanoprobe 풍미의 각각의 오후.</li>
	<li>각 마우스에 나노 서 스 펜 션의 intraperitoneally 1 mL를 주사 하 고 복 강 내 나노 입자를 분산 하는 배를 부드럽게 마사지. 그 주택에 마우스를 반환 합니다. 25 이상의 분 후 CO2 질을 통해 마우스를 안락사.</li>
	<li>
(대 한 이미징, 플랫폼 요구 똑바로 현미경 스테이지에 탑재할 수는 전체 복 부) 부정사 위치에 수술 플랫폼에 마우스를 고정.
	<ol>
<li>톱니 모양의 집게 및 해 부가 위를 사용 하면, 복을 노출 하 고 전체 복 부를 노출 (2, 3 cm 길이) 사이 큰 화살 절 개를 수행 피부 제거할. 플랫폼에 복 막 날개를 부착 합니다. 플라스틱 물 총 병을 사용 하 여 PBS의 적어도 60 mL와 복 막 구멍의 내부를 세척. 참고: 전체 복 부의 고품격된 이미지를 사용 하려면 내장 동원 또는 excised 필요가 있다. 절단을 위한 복 부 구멍으로 출혈을 감소 시키기 위하여 mesenteric 혈관의 결 찰 resect.</li>
		<li>또는, 특정 기관 이미지, PBS 세척 후 삭제할 현미경 슬라이드에 그들을 배치 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
똑바로 광학 구성 및 이미징; 전동된 스테이지 라 microspectrophotometer에 플랫폼 이나 슬라이드를 전송 300 mW 785 nm 다이오드 레이저, mm, 1,115 c m-1에서 중심으로 당 1200 홈의 격자와 상용 시스템을 사용 합니다.
	<ol>
<li>흰 빛 광학, 라만 레이저 parfocal를 사용 하 여 관심사의 지역에 초점. 선택 하는 이미지 수를 지역 및 원하는 해상도; 이 보고서에서 고속 수집 모드 사용 되었다 (연속 레이저 조명 아래 끊임없이 이동, 효과적인 공간 해상도 14.2 µ m 200 µ m, 5 배 확대에 목표, 100 mW 전력 현미경 단계 취득 스펙트럼 그리고 < 100 ms 노출 포인트 당)입니다. 참고: 5.1 단계에서에서 참조 nanoprobes 튜브 후속 분석을 위한 내부 기준 제공 하기 원하는 경우 이미지 영역 내에서 배치할 수 있습니다. 레이저 이외에서, 외부 광원 도달 목표 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>필요에 따라 4% paraformaldehyde PBS에 4 ° c.에 하룻밤 사이에 고정 하 여 조직학 처리 및 유효성 검사에 대 한 샘플을 준비 씻어 PBS와 15 분 동안 4 ° C에서 두 번 이상. 표준 조직학 가공 및 파라핀 포함까지 물에 70% 에탄올에 샘플을 계속. 종양의 조직학 유효성 검사, 파라핀 블록의 다른 깊이에서 섹션 (두께 5 µ m) hematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩이 될 수 있다.</li>
</ol>6. 데이터 처리 및 시각화
참고: 모든 데이터 처리는 그래픽 사용자 인터페이스 자체를 개발 상용 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 모든 사용 하는 함수는 일반적인 해당 다른 컴퓨팅 환경에서 사용할 수 있습니다.
<ol><li>각각의 순수한 정지 질문 2 개의 풍미에 대 한 참조 스펙트럼을 얻을. 참조 스펙트럼 포인트 스캔 nanoprobes에서 파생 될 수 있다 잘 플레이트 또는 참조 튜브 (단계 5.1 참조)에 실험 검사에서 내부 참조를 포함 하 여 nanoprobes의 영상.</li>
	<li>기본 빼기를 사용 하 여 참조 스펙트럼을 전처리 (휘 태 커 필터, λ = 200), 곡선, 및 Savitzky Golay 파생 필터 영역에 의해 정규화 (2도 다항식, 1 차 파생, 너비에 맞춰 15 단계 =). 이러한 전처리 스펙트럼 고전 최소 자승법 (CLS) 모델에 대 한 참조가 될 것입니다.</li>
	<li>같은 방법으로 참조 스펙트럼 이미지에서 샘플 데이터를 전처리. 사용할 수 있는 CLS 알고리즘을 사용 하 여 각 샘플 포인트에 대 한 CLS 점수를 얻을. 직접 CLS (DCL) 점수는 단순히 참조 스펙트럼의 일반적인된 역 매트릭스 (무어 펜로즈 역)에 의해 정의 된 선형 공간 샘플 스펙트럼의 투영의 좌표입니다. 다른 피팅 알고리즘 수 사용 (음수가 최소 자승법, 부분 최소 제곱, 또는 다른 사람). 참고: 일부 피팅 알고리즘이이 맥락에서 되지 않은 실제 부정적인 점수 상승을 줄 수 있습니다. 이 경우, 부정적인 점수를 제외 하도록 임계값을 설정할 수 또는 제한 된 음수가 최소 제곱 알고리즘 될 경우 대신 고용.</li>
	<li>대상된 나노 입자에 대 한 참조에 점수의 pointwise 비율 (점수αFR) 비 대상 나노 입자 (점수nt)에 대 한 참조에 점수에. 점수-음수가 있다면, 비율 로그 패션에 표현 될 수 있습니다. R = 로그10(αFR점수 /nt점수). 비율 R 최고의 0, 크기 순서에서에서 프로브의 상대 풍부한 표현 중심으로 분기 색 눈금에 표시 됩니다. 결과 이미지는 folate 수용 체 overexpression의 영역을 표시 하는 샘플의 흰색 빛 이미지에 중첩 될 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

• M.F.K.는이 작품에 관련 된 여러 발급 또는 특허 출원 중인 발명가 나열 됩니다. M.F.K. 리오 이미징, Inc., SERRS 나노 클리닉으로 번역을 목표로는의 공동 설립자 이다.
• 저자 들은 전혀 다른 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

라에 대 한 SERRS nanoprobes의 두 가지 "맛"의 합성 및 쥐에 있는 그들의 고용에 대 한 지침을 제공 하는 여기에 설명 된 프로토콜 overexpressing 비율 알고리즘을 사용 하 여 Folate 수용 체 난소 종양의 이미징. 라만 (형광) 같은 다른 광학 이미징 기술을 통해 이미징의 주요 장점은 생물학 근원의 어떤 신호도 혼동 될 수 없는 nanoprobe 신호의 높은 특이성. 라만 이미징의이 화신에는 나노 입자는 하지 관리 정 맥, 하지만, 하나의 세척 단계 뒤 복 주사를 통해. 이 방법론, 임상 경기장으로 번역 한 번 수 있도록 시각화 하 고 따라서 모든 난소 암 임 플 란 트, 너무 작아서 맨 눈으로 감지 하 고 있는 대상이 될 수 없는 그들 조차 resect 외과 우아한 해결책을 나타내는 것 이다 먹이 혈관의 그들의 부족으로 체계적으로 주입 된 이미징 에이전트 조직의 순환에 연결. 같은 시간에 우리의 SERRS 나노 입자는 전신 순환으로 resorbed 하지로 부작용에 대 한 잠재적인 문제 최소화 됩니...

라만 '표면 강화 된 라만 산란'와 이미징 (SERS) 나노 설정의 다양 한 병 변을 묘사에 큰 약속을 표시 하 고 많은 다른 종양에 대 한1,2,3,4 . 관련 나노 입자의 주요 이점은 그들 생물 학적 배경 신호5혼동 하지 분명 탐지를 affording 그들의 지문 처럼 스펙트럼 서명입니다. 또한, 내보낸된 신호 강도 더 여기 레이저, '표면 강화 된 공명 라만 산란'를 야 기한에 맞춰 흡 광도 맥시 마와 기자 분자 (염료)의 사용과 증폭 (SERRS) 더 큰 감도6,7,8,9,10,,1112나노 입자.
SE(R)RS 나노 입자13 의 채택에 대 한 해결 되어야 한 방 벽 및 많은 다른 나노 구조14,15 임상 사용을 위해 이다 관리의 그들의 모드 주사 하면 체계적으로 에이전트의 노출 잠재적인 부작용을 제외 하려면 광범위 한 테스트 필요로 하는 고. 이 문서에서는, 우리는 나노 입자의 응용 프로그램에 따라 다른 패러다임 제시 로컬로 vivo에서, 동안 수술, 복 막 구멍에 직접 다음 언바운드 나노 입자1를 제거 하는 세척 단계. 이 방식은 소설 치료 접근의 조사를 받고 현재는 또한 그에 맞춰 흘리기 복 화학요법 (HIPEC) 라는 복 막 구멍으로 에이전트의 로컬 주입의 사용. 따라서, 원리 자체 임상 작업 흐름에 통합 하기 위해 상대적으로 쉬워야 한다. 우리는 나노 입자의 biodistribution 복 신청 후, 공부 하 고 조직의 순환1에 어떤 감지 흡수 관찰 하지. 또한, 로컬 응용 프로그램 접근 필요한 나노 입자의 수는 현저 하 게 감소 하므로 reticuloendothelial 시스템에서 나노 입자의 격리 circumvents. 그러나, 몸에 붙이기도 적용할 때 항 체 기능성된 나노 입자는 그들의 목표의 부재에도 내장 표면에 고착 하는 경향이 있습니다. 때문에 일반적인 나노 접착 거짓 긍정적인 신호를 최소화 하기 위해 우리는 비율 접근 방식을 추구, 분자로 타겟된 nanoprobe 특정 신호 및 다른 라만 스펙트럼, 비 대상 컨트롤 nanoprobe를 제공 하는 곳 일반적인 배경16,17에 대 한 계정. 우리 몸에 붙이기도 적용 표면 강화 된 공명 라만 비율 분광학 확산 난소 암1마우스 모델에서 최근이 방법론을 설명 했다.
이 방법의 전반적인 목표는 표적으로 한 두 개의 SERRS nanoprobes를 개발 하 고 하나의 일반적인, 암의 보급/overexpression 이미지 위해 마우스 모델에 로컬로 적용 관련 바이오 마커 비율 기준 탐지의 두 프로브를 사용 하 여 통해 라만 이미징입니다. 이 작품에서는, 이것이 많은 난소 암18,19에서 마커 upregulated folate 수용 체 (FR)를 대상으로 선정 되었다. 관련 기반 나노 입자와 라 microimaging 또한 암 셀 식별20에 대 한 증명 되었습니다. 두 가지 "맛" 라 나노 입자의 합성 됩니다, 각각의 지문 다른 유기 염료에서 파생. 나노 실리 카 포탄에 의해 둘러싸인 별 모양의 골드 코어의 구성 및 표면 플라스몬 공명 약 710에서 설명 nm. 라만 기자 (유기 염료) 실리 카 쉘 형성 동시 입금 됩니다. 마지막으로, FR을 대상으로 nanoprobes (αFR-NPs)에 대 한 실리 카 포탄은 활용 된 항 체와 비 대상으로 nanoprobes (nt-NPs)는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 단층으로 패 하는 반면.
이 기술은 미세한 종양 확산 전이성 난소 암 (SKOV-3), 생체 조건 사용에 대 한 그것의 적용을 보여주는 마우스가 종이 식 모델에 매핑하는 데 성공적으로 사용 되었다. 그것은 또한 종양 형질, 또는 동족 연구21과 같이 debulking 후 여백 결정에 대 한 삭제 조직에 사용 하기 위해 확장할 수 있습니다.
SERRS nanoprobes 개요로 그림 1에 요약 된 대로 간단한 화학 반응으로 합성, 생체에 대 한 여러 대상된 태그의 창조를 위한 강력한 플랫폼을 제공 합니다. 여기, 우리는 SERRS nanoprobes (섹션 1-3)의 두 종류의 합성에 대 한 프로토콜, 적합 한 난소 암 마우스 모델 (4 단원)의 개발, nanoprobes 및 이미징 (5 단원)의 관리 및 마지막으로 데이터 분석 제시 및 시각화 (6 단원)입니다.

<table><tbody><tr><td>시약의 이름</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>3-MPTMS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide (28%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Folate Receptor 항체 [LK26]&nbsp;</td><td>AbCam</td><td>ab3361</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(무수)</td><td>시그마-알드리치</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>792780</td><td></td></tr><tr><td>IR140</td><td>시그마-알드리치</td><td>260932</td><td></td></tr><tr><td>IR780 과염소산염*</td><td>시그마-알드리치</td><td>576409</td><td>단종*</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>N.N.디메틸포름아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>PEG 크로스링커</td><td>시그마-알드리치</td><td>757853</td><td></td></tr><tr><td>PEG-말레이미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>900339</td><td></td></tr><tr><td>테트라클로로오우르산</td><td>시그마-알드리치</td><td>244597</td><td></td></tr><tr><td>테트라에틸 오르토실리케이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86578</td><td></td></tr><tr><td>*IR792</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425982</td><td>*대체</td></tr><tr><td>장비 이름</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>투석 카세트(3,500 MWCO)</td><td>ThermoFIsher</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>원심분리 필터</td><td>Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>inVia 컨포칼 라만 현미경</td><td>Renishaw</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB (v2014b)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS Toolbox (v8.0)</td><td>고유벡터 연구</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 nanoprobe ratiometry 대상

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

난소 암 최악의 부인과 악성을 나타냅니다. 대부분의 환자 (피구 단계 III 또는 IV), 고급 단계에서 현재 로컬 전이성 확산은 이미 발생 한 경우. 그러나, 난소 암 복 강 내 종양 이식 포함 처음에 전이성 확산의 독특한 패턴이 있다. 이 기능은 수 가능, 원칙적으로, 종양 치료 의도 임 플 란 트의 완전 한 절제 이러한 전이성 병 변이의 대부분은 현미경, 그들을 식별 하 고 치료 열심히 하입니다. 이러한 micrometastases 중화 종양 재발을 제거 하 고 장기적인 생존을 달성을 향해 주요 목표 될 여겨진다. 라만 표면 강화 된 공명 라만 산란 nanoprobes와 이미징 윤곽을 그리 다 때문에 그들의 밝은 높은 감도와 미세한 종양 및 bioorthogonal 스펙트럼 서명을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 같은 nanoprobes의 두 '맛'의 합성 설명: folate 수용 체는 항 체 공업화 한-많은 난소 암 overexpressed-그리고 고유한 스펙트럼과 비 대상 컨트롤 nanoprobe. nanoprobes는 intraperitoneally의 전이성 인간 난소 선 암 마우스 모델을 공동 관리. 모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 기념 슬로 안 Kettering 암 센터에 의해 승인 되었다. 동물의 복 막 구멍, 노출 수술은, 고 라 microphotospectrometer와 검사. 그 후, 두 nanoprobes의 라만 서명을 클래식 최소 제곱법 맞춤 알고리즘을 사용 하 여 분리 되며 타겟이 불분명 한 프로브를 통해 엽 산 대상의 비율 기준 신호를 제공 하기 위해 그들의 각각 점수 분할. 이 방법에서는, 미세한 전이 높은 특이성으로 시각화 됩니다. 이 방법의 주요 이점은 복 막 구멍으로 로컬 응용 프로그램은-수술 하는 동안 편리 하 게 할 수 있는-조직의 나노 노출 환자를 쓰는 하지 않고 종양을 태그 수 있습니다. 가양성 신호 내장 표면에 nanoprobes의 비 특정 바인딩에서 형태소 분석 별개 라만 서명 사용 하 여 대상 및 비 대상 nanoprobes 혼합물으로 적용 됩니다 비율 방법에 따라 삭제 될 수 있다. 절차는 현재 상업 넓은 필드 라만 이미징 운영 극장에서이 기술의 응용 프로그램에 대 한 수 한 번 사용할 수 있는 카메라 시스템의 부족에 의해 제한 됩니다.

품질 관리 목적을 위해은 나노 입자 합성 과정, 그림 2와 같이 가장, DL, 나노 추적 분석 및 UV/Vis 흡수도 분광학를 포함 하 여 다양 한 방법 사용 하 여 특징 수 있습니다.
이 방법에서는, 골드 nanostar 코어 (설명된 섹션 1)의 크기, 실리 카 셸 (제 2)의 형성 및 후속 표면 기능화 (제 3) 수 확인 (그림 2). 일반적으로, 골드 nanostar 코어의 크기 (유체역학 직경) 80 정도 될 것으로 예상 된다 nm, 그리고 실리 카 포탄은 약 20 nm 두께, 총 silicated 나노 크기 약 120 nm와 약 140 nm αFR 항 체와 활용 후. UV/Vis 흡 광도 나노 입자의 형태를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 물...

난소 암 복 막 구멍을 통해 전이 형성 한다. 여기, 우리는 프로토콜을 제시 하 고 사용 folate 수용 체 표면 강화 된 공명 라만 산란 nanoprobes 비율 이미지를 통해 높은 특이성으로 이러한 병 변 공개 대상. nanoprobes 생활 쥐, intraperitoneally 관리 되 고 파생된 이미지 조직학 잘 연관.

표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 Folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 Nanoprobe Ratiometry 대상

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

이 방법은 현미경 종양, 특히 난소암의 전이와 같은 혈관에 접근할 수 없는 악성 종양에 나노입자의 국소 적용을 사용합니다. 이 기술은 거짓 신호를 감소시키고 종양의 실제 범위를 밝히기 위해 단일 검사에서 비표적, 이미징 표적 및 비표적 나노 입자입니다. 이러한 나노 입자는 난소암 및 기타 많은 종양 유형의 고정밀 이미징을 위해 복막 내 또는 정맥 주사에 의해 투여될 수 있다.금 나노 스타 코어 합성의 경우 4 섭씨에서 자기 교반 판에 갓 준비 된 아스코르브 산 용액 800 밀리리터를 포함하는 원추형 플라스크를 배치하고 꾸준한 소용돌이를 유도합니다. 새로 준비된 테트라클로로우릭 산 용액 8밀리리터를 소용돌이에 빠르게 추가합니다. 몇 초 안에 나노스타가 형성되고 용액은 진한 파란색을 가정합니다.나노 스타 서스펜션을 원심 분리를 위해 50 밀리리터 원원형 튜브에 붓고 스핀의 끝에있는 각 튜브에서 마지막 200 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 흡인하십시오. 마이크로파이프를 사용하여 각 튜브의 나노 입자를 다시 일시 중지한 후 모든 나노 입자를 단일 투석 카세트에 풀링합니다. 그런 다음 나노 입자를 매일 물을 변화시키는 2 리터의 탈온 물에 대해 적어도 3 일 동안 투석하십시오.실리카 쉘 형성의 경우 먼저 이소프로판올 10밀리리터, TEOS 500 마이크로리터, 200마이크로리터의 탈량제, 60마이크로리터의 염료를 50밀리리터 원내 튜브에 추가합니다. 또한 에탄올 3밀리리터와 200마이크로리터의 수산화암모늄을 15밀리리터 튜브에 넣습니다. 다음으로, 투석된 나노별을 초음파 처리하여 클러스터를 분산시키고 튜브에 1.2 밀리리터의 나노별을 추가합니다.50 밀리리터 튜브를 소용돌이 믹서에 놓고 꾸준한 소용돌이를 유도합니다. 나노스타 용액을 50밀리리터 튜브에 약 5초 더 혼합한 후 실온에서 300RPM에서 15분 동안 셰이커로 빠르게 이송합니다. 두 개의 튜브는 나노 스타에서 실리션 반응이 일어나고 무료 실리카 생산을 최소화하기 위해 일정한 닉스 아래에 신속하게 결합해야합니다.인큐베이션의 끝에서 반응을 담금질하고 원심분리에 의해 나노 별을 수집하기 위해 에탄올로 튜브를 채웁니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고 신선한 에탄올의 한 밀리리터에서 나노 입자를 다시 중단주의 하는 슈퍼 나탄의 마지막 500 마이크로 리터를 제외한 모든 흡인. 그런 다음 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 용액을 원심분리에 의한 4밀리리터의 원심분리기를 원심분리하여, 각 세척 사이에 약 1초 동안 초음파에 의해 펠릿을 재연한다.입자 표면에 티올을 도입하려면 마지막 세척 후 펠릿을 85%에탄올, 10%3-메케토프로필-트리메톡시실레인, 실온에서 1~2시간 배양용 5%의 탈량액으로 펠릿을 재차 중단한다. 인큐베이션의 끝에서, 지시된 바와 같이 원심분리에 의해 티올 기능성 나노입자를 세척하고, 세척 사이의 초음파에 의해 펠릿을 재연한다. 항체 기능화 된 엽산 수용체 나노 프로브는 HEPES 버퍼의 500 마이크로 리터에서 PEG 크로스 링커의 10 배 의 연체와 함께 엽산 결합 단백질 항체의 200 마이크로 그램을 반응한다.30분 후 원심 필터에서 원심분리에 의해 항체를 농축하고, 필터를 새로운 튜브로 반전시켜 항체를 회복시켜 추가 원심분리를 한다. 그런 다음 티올 기능성 나노입자를 농축 된 항체와 혼합하고 실온에서 적어도 30 분 동안 혼합물을 배양한다. 비표적 나노 프로브를 형성하기 위해 실온에서 적어도 30분 동안 헤페스 버퍼의 500 마이크로리터에 티올 기능성 나노입자에 DMSO에 용해된 5밀리그램 메톡시 종단 PEG 5000 말리미드를 첨가한다.나노 프로브 주입을 위해 나노 프로브 맛을 모두 스핀하고 600 피코몰라 농도에서 신선한 MES 버퍼로 펠릿을 재연합니다. 나노 입자를 혼합하고 마우스 당 26 게이지 바늘을 장착 한 1 밀리리터 주사기에 결과 용액의 1 밀리리터를로드하고 각 마우스의 복부에 전체 볼륨을 주입. 그런 다음 복부를 부드럽게 마사지하여 복막 전체에 나노 입자를 분배합니다.적어도 25분 후에 는 안락사주입된 동물의 사지를 수술 플랫폼에 고정시키고 톱니 모양의 집게와 해부 가위를 사용하여 피부를 제거하여 회음부를 노출시합니다. 회음절을 절개합니다. 복막 플랩을 플랫폼에 부착하고 PBS의 최소 60 밀리리터로 복막 구멍의 내부를 세척합니다.그런 다음 플랫폼을 똑바로 광학 구성과 전동 스테이지로 라만 분광측으로 옮기고 적절한 이미징 매개 변수 하에서 복부를 이미지화한다. 이것은 라만 스캔의 초점 평면이 대부분의 내장의 표면에 있는 것이 중요합니다. 장기가 평면에서 벗어난 경우 획득된 신호는 유용하지 않습니다.품질 관리를 위해 나노 입자는 투과 전자 현미경, 동적 광 산란, 나노 입자 추적 분석 및 자외선 가시 흡수성 분광법을 포함하여 합성 과정에서 다양한 방법을 사용하여 특징지어질 수 있습니다. 라만 측정은 합성 을 통해 나노 입자의 각 맛의 독특한 스펙트럼의 존재를 보여줍니다. 일반적인 반응 수율 및 농도는 세척 단계 동안 파이펫팅 기술에 크게 의존합니다.라만 스펙트럼은 형광을 제거하고 고전적인 최소 제곱을 적용하기 전에 신호 강도를 보정하기 위해 단위 영역으로 정규화하기 위해 처리 될 수있다. 각 나노 프로브 기준 스펙트럼에 대한 고전적인 최소 제곱 점수는 개별적으로 종양의 특정 위치를 제공하지 않지만, 점 현명한 비율은 전파 된 현미경 확산의 존재를 드러낸다. 이 절차를 시도하는 동안 나노 입자의 품질이 최종 결과에 강하게 영향을 미치기 때문에 합성의 모든 단계에서 나노 입자를 검증하는 것이 중요합니다.이 기술은 연구원이 동물 모형에 있는 종양 관련 마커의 검출을 위해 SERRS 나노 프로브를 사용하고 현미경 정밀도의 높은 수준을 가진 절제된 참을성 있는 조직을 사용하는 잠재력을 보여줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 엽산으로 덮인 황화구리 나노 입자(CuS NP)의 내재화를 촉진하는 기술을 보여줍니다. 엽산 기능성 CuS NP는 많은 난소암 세포에서 과발현되는 엽산 수용체를 표적으로 삼을 수 있는 능력이 있습니다.

난소암의 기능화된 나노입자 표적화: 난소암 세포의 엽산 접합 나노입자 조영제 흡수를 촉진하는 기술

이 비디오에서는 순환 체외 유동 챔버에서 나노 입자를 함유한 난소암 세포의 광음향 유세포 검출을 보여줍니다. 이 비침습적 기법은 조영제를 사용하여 유동 시스템에서 순환 종양 세포를 성공적으로 식별합니다.

In vitro photoacoustic flow cytometry: 나노 입자 함유 순환 난소암 세포를 검출하기 위한 비침습적 유동 광음향 기술

이 프로토콜은 난소 절치와 나팔관 암 세포를 공동 배양하여 검체 준비 기술을 설명합니다. 이러한 샘플은 이미징 질량 분광법(IMS)을 사용하여 시각화하여 종양 발생으로 이어지는 세포와 조직 간의 소분자 교환을 감지합니다.

이미징 질량 분석 분석을 위한 난소암 커뮤니케이션 모델링: 전이성 난소 종양 발달에서 소분자 화학 전달자를 식별하는 방법

이 동영상은 표적 나노프로브, 특이적 항수용체 항체 및 비표적 대조군 나노프로브를 사용하여 전이성 난소암을 검출하는 표면 강화 공명 라만 산란 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 두 나노 프로브의 상대적 풍부도를 결정하고 내장 배경에서 암세포를 구별하는 데 도움이 됩니다.

항체 기능성 SERRS 나노프로브 기반 이미징: 전이성 난소암을 생체 내에서 감지하기 위한 고감도 라만 이미징 기술

우리는 난소암의 성장과 재발을 감지, 정량화 및 모니터링할 수 있는 비침습적 동물 이미징 플랫폼을 설명합니다. 이 복막내 이종이식 모델은 난소암 환자의 임상 프로필을 모방합니다.

비 침습적 영상에 대한 생쥐 모델 검색 및 모니터 난소 암 재발

나노 입자 기반 광학 프로브는 라만 및 UV-Vis 분광법을 사용하여 항원을 검출하기 위한 매개체로 설계되었습니다. 여기에서는 향후 다중화 기능을 통합하는 방식으로 UV-Vis/Raman 분광법 면역분석을 위해 이러한 프로브를 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

자외선 VI와 라만 분광학 면역 플랫폼 제조

프로토콜은 맞춤형 광음향 흐름 시스템 및 표적 엽산 덮인 구리 황화물 나노 입자를 활용하여 순환 난소 종양 세포를 검출하기 위해 제시된다.

광음향 유동 세포측정을 이용한 난소암 검출

우리는 난소/부속기 병변의 질식 영상에 대해 공동 등록된 초음파 및 광음향 영상 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 다른 병진 광 음향 영상 연구, 특히 광 음향 신호 검출을위한 상용 초음파 어레이 및 이미징을위한 표준 지연 및 합계 빔 형성 알고리즘을 사용하는 연구에 유용 할 수 있습니다.

난소 병변의 질식 영상을위한 공동 등록 된 초음파 및 광 음향 영상 프로토콜

본 연구에서는 생체적합성이 우수한 저비용 표면 강화 라만 산란(SERS) 기반 지문 나노프로브를 개발하여 비파괴 방법으로 살아있는 세포의 SERS 스펙트럼을 얻는 방법을 자세히 보여주기 위해 라벨이 없는 생세포 바이오이미징을 보여주고 두 가지 박테리아 균주를 검출했습니다.

Au@Carbon 도트 나노프로브를 기반으로 하는 Label-Free Surface-Enhanced Raman Scattering Bioanalysis

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

배우세요 난소암 전이를 검출하기 위한 엽산 수용체 표적화 표면 강화 공명 라만 나노프로브 비율 측정법을 통해 정확한 종양 영상화를 수행하는 방법을. 이 기술은 미세 종양을 정밀하게 식별하여 진단 정확도를 향상시킵니다.

표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 Folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 Nanoprobe Ratiometry 대상

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