표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 Folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 Nanoprobe Ratiometry 대상
March 25th, 2019
난소 암 복 막 구멍을 통해 전이 형성 한다. 여기, 우리는 프로토콜을 제시 하 고 사용 folate 수용 체 표면 강화 된 공명 라만 산란 nanoprobes 비율 이미지를 통해 높은 특이성으로 이러한 병 변 공개 대상. nanoprobes 생활 쥐, intraperitoneally 관리 되 고 파생된 이미지 조직학 잘 연관.
이 방법은 현미경 종양, 특히 난소암의 전이와 같은 혈관에 접근할 수 없는 악성 종양에 나노입자의 국소 적용을 사용합니다. 이 기술은 거짓 신호를 감소시키고 종양의 실제 범위를 밝히기 위해 단일 검사에서 비표적, 이미징 표적 및 비표적 나노 입자입니다. 이러한 나노 입자는 난소암 및 기타 많은 종양 유형의 고정밀 이미징을 위해 복막 내 또는 정맥 주사에 의해 투여될 수 있다.
금 나노 스타 코어 합성의 경우 4 섭씨에서 자기 교반 판에 갓 준비 된 아스코르브 산 용액 800 밀리리터를 포함하는 원추형 플라스크를 배치하고 꾸준한 소용돌이를 유도합니다. 새로 준비된 테트라클로로우릭 산 용액 8밀리리터를 소용돌이에 빠르게 추가합니다. 몇 초 안에 나노스타가 형성되고 용액은 진한 파란색을 가정합니다.
나노 스타 서스펜션을 원심 분리를 위해 50 밀리리터 원원형 튜브에 붓고 스핀의 끝에있는 각 튜브에서 마지막 200 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 흡인하십시오. 마이크로파이프를 사용하여 각 튜브의 나노 입자를 다시 일시 중지한 후 모든 나노 입자를 단일 투석 카세트에 풀링합니다. 그런 다음 나노 입자를 매일 물을 변화시키는 2 리터의 탈온 물에 대해 적어도 3 일 동안 투석하십시오.
실리카 쉘 형성의 경우 먼저 이소프로판올 10밀리리터, TEOS 500 마이크로리터, 200마이크로리터의 탈량제, 60마이크로리터의 염료를 50밀리리터 원내 튜브에 추가합니다. 또한 에탄올 3밀리리터와 200마이크로리터의 수산화암모늄을 15밀리리터 튜브에 넣습니다. 다음으로, 투석된 나노별을 초음파 처리하여 클러스터를 분산시키고 튜브에 1.2 밀리리터의 나노별을 추가합니다.
50 밀리리터 튜브를 소용돌이 믹서에 놓고 꾸준한 소용돌이를 유도합니다. 나노스타 용액을 50밀리리터 튜브에 약 5초 더 혼합한 후 실온에서 300RPM에서 15분 동안 셰이커로 빠르게 이송합니다. 두 개의 튜브는 나노 스타에서 실리션 반응이 일어나고 무료 실리카 생산을 최소화하기 위해 일정한 닉스 아래에 신속하게 결합해야합니다.
인큐베이션의 끝에서 반응을 담금질하고 원심분리에 의해 나노 별을 수집하기 위해 에탄올로 튜브를 채웁니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고 신선한 에탄올의 한 밀리리터에서 나노 입자를 다시 중단주의 하는 슈퍼 나탄의 마지막 500 마이크로 리터를 제외한 모든 흡인. 그런 다음 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 용액을 원심분리에 의한 4밀리리터의 원심분리기를 원심분리하여, 각 세척 사이에 약 1초 동안 초음파에 의해 펠릿을 재연한다.
입자 표면에 티올을 도입하려면 마지막 세척 후 펠릿을 85%에탄올, 10%3-메케토프로필-트리메톡시실레인, 실온에서 1~2시간 배양용 5%의 탈량액으로 펠릿을 재차 중단한다. 인큐베이션의 끝에서, 지시된 바와 같이 원심분리에 의해 티올 기능성 나노입자를 세척하고, 세척 사이의 초음파에 의해 펠릿을 재연한다. 항체 기능화 된 엽산 수용체 나노 프로브는 HEPES 버퍼의 500 마이크로 리터에서 PEG 크로스 링커의 10 배 의 연체와 함께 엽산 결합 단백질 항체의 200 마이크로 그램을 반응한다.
30분 후 원심 필터에서 원심분리에 의해 항체를 농축하고, 필터를 새로운 튜브로 반전시켜 항체를 회복시켜 추가 원심분리를 한다. 그런 다음 티올 기능성 나노입자를 농축 된 항체와 혼합하고 실온에서 적어도 30 분 동안 혼합물을 배양한다. 비표적 나노 프로브를 형성하기 위해 실온에서 적어도 30분 동안 헤페스 버퍼의 500 마이크로리터에 티올 기능성 나노입자에 DMSO에 용해된 5밀리그램 메톡시 종단 PEG 5000 말리미드를 첨가한다.
나노 프로브 주입을 위해 나노 프로브 맛을 모두 스핀하고 600 피코몰라 농도에서 신선한 MES 버퍼로 펠릿을 재연합니다. 나노 입자를 혼합하고 마우스 당 26 게이지 바늘을 장착 한 1 밀리리터 주사기에 결과 용액의 1 밀리리터를로드하고 각 마우스의 복부에 전체 볼륨을 주입. 그런 다음 복부를 부드럽게 마사지하여 복막 전체에 나노 입자를 분배합니다.
적어도 25분 후에 는 안락사주입된 동물의 사지를 수술 플랫폼에 고정시키고 톱니 모양의 집게와 해부 가위를 사용하여 피부를 제거하여 회음부를 노출시합니다. 회음절을 절개합니다. 복막 플랩을 플랫폼에 부착하고 PBS의 최소 60 밀리리터로 복막 구멍의 내부를 세척합니다.
그런 다음 플랫폼을 똑바로 광학 구성과 전동 스테이지로 라만 분광측으로 옮기고 적절한 이미징 매개 변수 하에서 복부를 이미지화한다. 이것은 라만 스캔의 초점 평면이 대부분의 내장의 표면에 있는 것이 중요합니다. 장기가 평면에서 벗어난 경우 획득된 신호는 유용하지 않습니다.
품질 관리를 위해 나노 입자는 투과 전자 현미경, 동적 광 산란, 나노 입자 추적 분석 및 자외선 가시 흡수성 분광법을 포함하여 합성 과정에서 다양한 방법을 사용하여 특징지어질 수 있습니다. 라만 측정은 합성 을 통해 나노 입자의 각 맛의 독특한 스펙트럼의 존재를 보여줍니다. 일반적인 반응 수율 및 농도는 세척 단계 동안 파이펫팅 기술에 크게 의존합니다.
라만 스펙트럼은 형광을 제거하고 고전적인 최소 제곱을 적용하기 전에 신호 강도를 보정하기 위해 단위 영역으로 정규화하기 위해 처리 될 수있다. 각 나노 프로브 기준 스펙트럼에 대한 고전적인 최소 제곱 점수는 개별적으로 종양의 특정 위치를 제공하지 않지만, 점 현명한 비율은 전파 된 현미경 확산의 존재를 드러낸다. 이 절차를 시도하는 동안 나노 입자의 품질이 최종 결과에 강하게 영향을 미치기 때문에 합성의 모든 단계에서 나노 입자를 검증하는 것이 중요합니다.
이 기술은 연구원이 동물 모형에 있는 종양 관련 마커의 검출을 위해 SERRS 나노 프로브를 사용하고 현미경 정밀도의 높은 수준을 가진 절제된 참을성 있는 조직을 사용하는 잠재력을 보여줍니다.
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개요
본 연구는 엽산 수용체 표적 표면 강화 공명 라만 산란 나노프로브를 사용하여 높은 특이성으로 난소암 전이를 영상화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 표적화된 및 비표적화된 나노입자의 비율 영상을 허용하여 종양 탐지의 정확성을 향상시킵니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 종양학
- 나노기술
배경
- 난소암은 복강 내에서 자주 전이됩니다.
- 현재 영상 기술은 미세한 종양을 효과적으로 감지하지 못할 수 있습니다.
- 나노입자는 악성 종양의 표적화된 영상화에 사용될 수 있습니다.
- 비율 영상은 종양 탐지에서 거짓 신호를 줄이는 데 도움이 됩니다.
연구 목적
- 난소암 전이를 영상화하기 위한 프로토콜을 개발하기 위해.
- 향상된 특이성을 위해 엽산 수용체 표적 나노프로브를 활용하기 위해.
- 비율 영상 기술을 사용하여 종양 탐지의 정확성을 향상시키기 위해.
사용된 방법
- 영상화를 위한 나노입자의 국소 도포.
- 복강 내 또는 정맥 내 나노프로브 투여.
- 표적화된 및 비표적화된 나노입자의 비율 영상.
- 영상 응용을 위한 골드 나노스타의 합성.
주요 결과
- 난소암 병변의 영상화에서 높은 특이성이 달성되었습니다.
- 나노프로브에서 유래한 영상은 조직학적 소견과 잘 상관되었습니다.
- 이 방법은 미세한 종양을 감지하는 효과를 입증했습니다.
- 비율 영상은 거짓 신호를 현저히 감소시켰습니다.
결론
- 개발된 프로토콜은 난소암 전이의 검출을 향상시킵니다.
- 엽산 수용체 표적 나노프로브는 유망한 영상 기술을 제공합니다.
- 이 방법은 다른 종류의 종양에도 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables high-specificity detection of microscopic ovarian cancer metastases using folate-receptor targeted SERRS nanoprobes, addressing a critical unmet need in early-stage tumor visualization. By employing a ratiometric imaging approach, the technique reduces false-positive signals from non-specific binding, improving predictive confidence in target engagement. The intraperitoneal delivery route aligns with the peritoneal metastatic pattern of ovarian cancer, supporting translational relevance for intraoperative imaging applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of folate receptor overexpression as a therapeutic hypothesis in ovarian cancer models.
- Operational Value: Provides a quantitative, imaging-based readout for target-specific nanoparticle accumulation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating nanoprobe signal with histological confirmation of micrometastases.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates distinct, decouplable Raman spectra for targeted and non-targeted nanoprobes, enabling multiplexed detection.
- Operational Value: Yields a ratiometric signal output that normalizes for variability in nanoparticle delivery and tissue background.
- Assay Readiness: Establishes a standardized protocol for nanoprobe synthesis, functionalization, and intraperitoneal administration in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses intraperitoneal delivery to model clinical administration during surgical intervention in the peritoneal cavity.
- Disease-Relevant System: Targets folate receptor, which is overexpressed in many ovarian cancers, enhancing relevance to human pathology.
- <Predictive De-risking: Enables visualization of microscopic tumor implants that are otherwise undetectable, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical imaging, supporting hypothesis-driven evaluation of folate receptor as a biomarker in ovarian cancer metastasis models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of folate receptor-mediated targeting in disseminated tumor models.
- Screening: Produces assay-ready nanoprobes with quantifiable, ratiometric outputs for comparing targeting efficiency.
- Analytics: Employs Classical Least Squares fitting to decouple overlapping spectra and generate point-wise ratio images for tumor delineation.
- Translational Research: Bridges in vivo imaging with ex vivo tissue validation, supporting continuity toward clinical intraoperative use.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular nanoprobe platform adaptable to other targets via antibody or ligand exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through specific, ratiometric detection of receptor-positive micrometastases.
- Operational Value: Delivers reproducible nanoparticle synthesis and functionalization protocols with defined QC steps (TEM, DLS, UV-Vis).
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by providing direct visualization of target engagement in relevant disease models.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by enabling early detection of treatment-resistant microscopic disease.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, surface chemistry, and Raman spectroscopy.
- Depends on access to a Raman microphotospectrometer with motorized stage and appropriate laser excitation.
- Necessitates standardization across teams for nanoprobe injection, peritoneal washing, and imaging protocol execution.
- Adaptation to other model systems may require optimization of nanoprobe dose and incubation time.
- Current limitation: lack of a commercial wide-field Raman imaging system restricts real-time intraoperative application.
