Name: 포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 자동화된 다중 면역형광 패널을 이용하여 포르말린 고정 암 조직에서 면역세포를 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 면역종양학 연구에서 종양 미세환경의 면역 반응을 정밀하게 평가하는 데 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

편집 지원 MedImmune의 데보라 Shuman에 의해 제공 했다.

<ol><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient%27s+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).</li>
<li>Idikio, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+diagnostic+surgical+pathology%3A+contributions+of+protein+life-cycle%2C+use+of+evidence-based+methods+and+data+normalization+on+interpretation+of+immunohistochemical+stains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).</li>
<li>Rebelatto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+programmed+cell+death+ligand-1+immunohistochemical+assay+validated+for+analysis+of+non-small+cell+lung+cancer+and+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma.</a> Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+image+analysis-based+study+shows+that+several+immune+checkpoints+are+co-expressed+in+non-small+cell+lung+carcinoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).</li>
<li>Rehman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+pathologist-read+comparison+of+the+heterogeneity+of+programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+expression+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer.</a> Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).</li>
<li>Dixon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+multiplexing+techniques+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+immune+profiling+in+HPV-+oral+squamous+cell+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunofluorescence+analysis+and+quantification+of+intratumoral+PD-1%2B+Tim-3%2B+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Ribas, A., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+using+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy using checkpoint blockade.</a> Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+neoadjuvant+chemotherapy+on+the+immune+microenvironment+in+non-small+cell+lung+carcinomas+as+determined+by+multiplex+immunofluorescence+and+image+analysis+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).</li>
<li>Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unvalidated+antibodies+and+misleading+results%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Unvalidated antibodies and misleading results.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).</li>
<li>Baskin, D. G., Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+state+of+the+science+of+immunohistochemistry%3A+the+Histochemical+Society%27s+standards+of+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).</li>
<li>Freedman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+improved+education+and+training+in+research+antibody+usage+and+validation+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices.</a> Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).</li>
<li>Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+it+is+just+good+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: it is just good science.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
</ol>

이 작품은 MedImmune, 글로벌 biologics R & D 팔 아 스 트 라의에 의해 지원 되었다. C.W., K.R., 및 C.C.H.는 Perkin Elmer (TSA kit) 시 약을 생산 하 고이 작품에 사용 했던 multispectral 스캐너의 직원이 있습니다. 석사, K.D., 아, W.Z., C. Bagnall, C. 브라운, J.C., 앨 러 배 마, 캔사스, M.R., 및 J.R.C.는 주식 소유권 및 재고 관심사 또는 아 스 트 라 옵션 MedImmune의 직원.

지속적인 암 immunotherapy 혁명은 오프닝 소설과 유망 암 환자13에 대 한 치료 옵션. 면역-종양학 분야에서 발전 새로운 예측 생체를 찾을 뿐만 아니라 발암에 관여 하는 면역 메커니즘의 생물학을 이해 하는 것 뿐만 아니라 염증 성 종양 microenvironment의 증가 지식 필요 합니다. immunotherapy 기반 치료1,2. 때문에 암 면역학의 복잡 한 생물학, 종양 조직 샘플의 심문 일반적으로 하는 데 필요한 면역 표식, 서로 상호 작용 하 고 자주 조직1에에서 다양 한 세포 인구에 의해 coexpressed의 성장 목록을 개발합니다 ,,25. 임상 시험 일반적으로 작은 biopsies 코어 바...

FFPE 종양 조직 샘플의 Immunoprofiling 분석 특히 발견 및 암 immunotherapy 임상 시험1의 맥락에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 유효성 검사에 대 한 면역-종양학 연구의 필수 요소가 되고있다 ,2. 발 IHC, diaminobenzidine, 등 화학 chromogens를 사용 하 여 진단 병리학 생 검 조직의3의 immunolabeling에 대 한 표준 기술에 남아 있다. 표준 IHC 암 조직 immunoprofiling, 종양 관련 된 림프 톨의 부분 모집단 그리고 프로그램 된 세포 죽음 ligand 1 등 면역 검사점의 식 수준 평가 (PD-L1)4의 정량 등도 사용할 수 있습니다. ,5. 그러나 표준 IHC 제한 됩니다,, 그 하나의 항 원 조직 섹션 당 표시 될 수 있습니다. Immunoprofiling 연구는 일반적으로 여러 마커의 결합된 식의 분석 필요, 표준 IHC 사용 여러 조직 단면도의 얼룩이 지기 요구, 각 하나의 표식으로 물 될 것 이다, 실질적으로 중 핵 바늘 생 검 같은 작은 조직 샘플의 분석에 대 한 제한. 표준 IHC 방법 다양 한 세포 인구, PD L1, 종양 관련 된 대 식 세포와 암 세포에 의해 표현 된다와 같은 면역 검사점 마커로 일반적인 coexpressed 마커의 평가 대 한 제한도 있습니다. 이 제한에, 표준 수염 IHC의 사용 예를 들어, 다양 한 세포 유형6표현 IHC 마커의 정량 분석에 대 한 병리학 자에 의해 보고 되었습니다. 멀티플렉스 발 IHC 기술 채용 같은 조직 섹션 나타냅니다에 다양 한 컬러 chromogens 전진 표준 IHC 수염 방법,7 에 그들은 남아 있지만 개발의 불과 immunolabeling에 의해 제한 마커 또한 동일한 세포 인구의 동일한 subcellular 구획에서 표현 하는 마커의 적절 한 평가 위한 중요 한 기술 과제를 제시.
멀티플렉스 발 IHC 기법의 제한 뿐만 아니라 임상 샘플에서 조직 여부에 관한 상기 주의 에겐 있다 면역-종양학 연구 기반 향상 된 다중 방법을 개발 하는 필요 형광 라벨 결합 이미징 시스템을 효과적으로 동일한 슬라이드에서 여러 fluorophores의 신호를 분리할 수 있습니다. 1 개의 그런 기술은 tyramide 신호 증폭 (TSA) 효율적인 색상 분리8multispectral 현미경 이미징 결합을 기반으로 합니다. TSA 기반 상용 키트 사용 fluorophores multispectral 이미징8 최적화 ( 재료의 표참조). 이 시스템의 중요 한 이점은 이미 검증 되 고 표준 발 IHC9,,1011에 최적화 된 동일한 레이블 없는 기본 항 체와의 호환성 이다. 이 새로운 목표를 통합 최적화 및 패널 수정에서 빠른 최적화 뿐만 아니라 유연성 수 있습니다. 또한, 다중 면역 형광 검사 (mIF) TSA 메서드 수염에서 간단한 전송에 대 한 수 있도록 자동화 된 상용 IHC 염색기 시스템, 최적화 될 수 있습니다 비 IHC mIF.
여기 선물이 프로토콜 기반 면역-종양학 연구 mIF 패널 mIF TSA 얼룩 자동 고 이미징 multispectral 스캐너를 사용 하 여. 이 프로토콜 적응 고 설명된 계측 및 시 약에 대 한 액세스 있는 실험실 사용자에 의해 수정 될 수 있습니다. Carcinomas의 immunoprofiling에 대 한 6 주 항 체의 패널을 포함 하는 프로토콜: PD-L1, PD-1, CD68 (마커로 팬-대 식 세포), CD8 (세포 독성 T 세포), 기-67, 및 AE1/AE3 (팬 cytokeratin, 신분의 상피 표식으로 사용 암 세포)입니다. 최근 연구는 멀티 플렉스12얼룩을 확인 하기 위해 표준 참조로 발 IHC를 사용 하 여 수동 TSA mIF 프로토콜의 최적화를 설명 합니다. 여기에 제시 된 업데이트 메서드는 자동된 염색기, 크게는 착 시간 단축 3-5 일에서 14 h, 또한은 얼룩의 일관성을 향상 시키는 동시에 최적화 된 상용, 일곱 색 TSA 키트를 사용 하 여 개발 되었습니다. 여기에 제시 된 세부 주요 프로토콜 뿐만 아니라 보충 자료 섹션 포함 하는 "드롭-제어" 방법, 새 mIF 패널 뿐만 아니라, 최적화에 대 한 기술 노트를 평가 하는 추가적인 품질 관리 프로세스 문제 해결, 그리고 설정 하 고 사용자 정의 mIF 패널의 mIF TSA 방법 최적화 실험실 사용자 있도록 새로운 다중 패널의 개발.

<table><tbody><tr><td>스펙트럼 불혼합 및 이미지 분석을 위한 "InForm 2.4.2" 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151066</td><td>텍스트에서 "스펙트럼 불혼합 소프트웨어"라고 함</td></tr><tr><td>"Phenochart 1.0.9" MSI 선택 및 전체 슬라이드 스캔 보기를 위한 QPTIFF 소프트웨어</td>, <td>PerkinElmer</td><td>CLS151067</td> 텍스트#1.5<td>에서 "QPTIFF 소프트웨어"라고 함</td></tr>, <tr><td>Coverslips,</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2975246</td><td></td></tr><tr><td>200 프루프 에탄올</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>20x Tris-Buffered Saline</td><td>VWR</td><td>J640-4L</td><td></td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>DAKO</td><td>S2203</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD68 마우스 단클론</td><td>DAKO</td><td>M087601-2</td><td>클론 PG-M1</td></tr><tr><td>Anti-CD8 Rabbit 단클론</td><td>벤타나</td><td>M5392</td><td>클론 SP239</td></tr><tr><td>Anti-CK 마우스 모노클로날</td><td>DAKO</td><td>M351501-2</td><td>클론 AE1/AE3</td></tr><tr><td>Anti-ki67 마우스 단클론</td><td>DAKO</td><td>M724001-2</td><td>클론 MIB-1</td></tr><tr><td>Anti-PD-1 토끼 단클론</td><td>세포 신호</td><td>#86163</td><td>클론 D4W2J</td></tr><tr><td>Anti-PD-L1 토끼 단클론</td><td>Ventana</td><td>790-4905</td><td>클론 SP263</td></tr><tr><td>본드 듀왁스 용액</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td>텍스트에서 "왁스 용액"이라고 함</td></tr><tr><td>본드 에피토프 회수 용액 1</td><td>Leica</td><td>AR9961</td>(<td>텍스트: "ER1"</td></tr>), <tr><td>본드 에피토프 회수 용액 2</td>: <td>Leica</td><td>AR9640</td>: <td>텍스트: "ER2",</td></tr><tr><td>Bond Open Containers, 30 mL</td><td>Leica</td><td>OP309700</td>: <td>"30 mL open containers"</td></tr>, <tr><td>7 mL</td><td>Leica</td><td>OP79193</td><td>"7 mL open containers"라고 함" 텍스트:</td></tr><tr><td>Bond Polymer Refine Detection</td><td>Leica</td><td>DS9800</td><td>텍스트: "발색 검출 키트"</td></tr>, <tr><td>Bond Research Detection Kit</td><td>Leica</td><td>DS9455</td>: <td>텍스트에서 "연구 검출 키트"라고 함</td></tr>, <tr><td>Bond Titration Kit</td><td>Leica</td><td>OPT9049</td><td>텍스트: "적정 키트"라고 함</td></tr><tr><td>Bond Universal Covertile Novocastra</td><td>Leica</td><td>S21.2001</td><td>텍스트에서 "covertiles"라고 부름</td></tr><tr><td>Bond Wash Solution 10X Concentrate</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td>텍스트에서 "10x 세척 솔루션"이라고 부름</td></tr><tr><td>BondRX Autostainer</td><td>Leica</td><td></td><td>텍스트에서 "자동 염색기"라고 부름</td></tr><tr><td>BondRX 소프트웨어 버전 5.2.1.204</td><td>Leica</td><td></td><td>텍스트에서 "자동 염색기 소프트웨어"라고 부름</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL801001KT</td><td>텍스트에서 "멀티 스펙트럼 염색 키트"라고 함</td></tr><tr><td>Peroxidase Block</td><td>Leica</td><td>RE7101</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P36965</td><td>텍스트에서 "슬라이드 장착"이라고 함</td></tr><tr><td>Starfrost Slides</td><td>Fisher</td><td>15-183-51</td><td></td></tr><tr><td>다중 스펙트럼 현미경 제어를 위한 "Vectra 3.0.5" 소프트웨어가 있는 Vectra Polaris 다중 스펙트럼 현미경</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS143455</td><td>텍스트에서 "현미경 제어 소프트웨어"라고 합니다</td></tr></tbody></table>.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

종양 면역에서에서 지속적인된 개발 암 면역학의 메커니즘의 증가 이해를 필요합니다. 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 생 검에서 조직 샘플의 immunoprofiling 분석 종양 면역학의 복잡성을 이해 하 고 암 immunotherapy에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 발견을 위한 주요 도구가 되고있다. Immunoprofiling 분석 조직 등 염증 성 세포 모집단 면역 검사, 종양 microenvironment에 결합 된 마커의 평가 필요 합니다. 소설 멀티플렉스 immunohistochemical 방법의 출현 보다 표준 수염 immunohistochemistry (IHC) 단일 조직 단면도의 더 효율적인 multiparametric 분석에 대 한 수 있습니다. 한 상용 멀티플렉스 면역 형광 (경우) 메서드는 tyramide 신호 증폭에 따라, multispectral 현미경 분석, 결합 조직에서 다양 한 마커의 더 나은 신호 분리에 대 한 수 있습니다. 이 방법론 표준 IHC FFPE 조직 샘플에 대 한 최적화 된 결합형된 기본 항 체의 사용과 호환 됩니다. 여기 우리가 자세하게에서 설명 멀티플렉스 수 있는 자동화 프로토콜 6-마커 다중 항 체 패널 구성 된 PD-L1, 암 조직 샘플의 라벨 경우 PD-1, CD68, CD8, 기-67, 및 4와 AE1/AE3 cytokeratins 6-diamidino-2-phenylindole 로 핵 셀 counterstain. 멀티플렉스 패널 프로토콜 착 시간을 수동 프로토콜의 보다 짧은 수 있습니다 직접 적용 고 인간의 FFPE 조직 샘플에 대 한 면역-종양학 연구에 대 한 모든 실험실 조사에 의해 적응에 대 한 자동된 IHC 염색기에 최적화 되어 있습니다. 또한 몇몇 컨트롤 및 도구, 새로운 다중 경우 패널의 좋은 품질 관리에 대 한 드롭-제어 방법을 포함 하 여 최적화 및 검증 기법에 대 한 유용한 있다.

여기에 설명 된 프로토콜은 그림 2에 표시 된 것과 같은 결과 제공할 것입니다. 편도 선 컨트롤, 표면 편평 세포 상피로 시작에 얼룩의 평가로 시작 합니다. 편도 선 샘플의 조직학 병리학 자, H &amp; E 슬라이드를 참조 하 여 함께 검토할 수 있습니다. 비 IHC 섹션을 동일한 조직 블록에 동일한 표식으로 수행 하 고, 다음이 사용할 수 있습니다 밀도 및 mIF 슬라이드에 각 마커의 유통 확인 하. 그림 2A같이 편도 선 조직 명확 하 게 정의 된 AE1/AE3 cytokeratin 편도 선 표면 편평 상피에 얼룩을 제공 해야 한다 (그림 2A; 빨간 모조 색상으로 표시), 림프는에 배경 없이 조직입니다. 얼룩 세포질 막 음의 억양 법와 때때로 ...

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

이 프로토콜은 멀티플렉스 면역 형광 프로토콜의 개발 최적화 및 전송이 복잡하고 어렵기 때문에 중요합니다. 많은 실험실에서 최적화된 프로토콜의 발가락 보유는 매우 중요합니다. 다중 스펙트럼 면역 형광은 종양 안팎의 다중 세포 유형의 위치와 정체성을 모두 평가할 수 있게 합니다.이것은 면역 종양학 연구 결과에 있는 정보의 강력한 조합입니다. 멀티플렉스 면역 형광에 가장 강력한 사용은 면역 종양학입니다. 그러나 setu에서 다중 면역 세포 모형을 조사하는 기능은 모든 자가 면역 및 선동적인 치료에 걸쳐 이용될 수 있습니다.고체 세포 안팎의 면역 세포의 위치와 표현형을 아는 것은 종양 특정 면역 요법에 대한 예후 및 예측 가능한 반응입니다. 프로토콜의 최적화 및 유효성 검사는 서두르지 않아야 하는 주요 단계입니다. 새로운 개발자는 다중 스펙트럼 이미징과 관련된 새로운 종류의 아티팩트에 익숙해져야 합니다.기본 멀티 플렉스 프로토콜을 찾으려면 자동화된 스테인에 미리 로드됩니다. 프로토콜 화면에서 선호하는 대신 모두를 필터링합니다. 변경하기 전에 원래 프로토콜을 저장하고 프로토콜 탭을 클릭하고 오른쪽 을 클릭하여 오팔 6 멀티플렉스를 클릭하여 복사본을 선택합니다.새 창에서 이름을 7멀티플렉스 프로토콜 1'으로 변경하고 올바른 장치와 연결된 탭을 선택합니다. 보충 표 S1'에서 프로토콜을 일치시키고 시약을 추가클릭하면 시약으로 peroxidase 억제제를 선택하여 10분 파록시제 억제 단계를 추가합니다. 차단 단계는 단백질 키나아제 차단 버퍼를 이용하고, 각 1차 항체가 적절한 시약을 지칭하며, 이차 항체 단계는 고추냉이 과산화고분자를 이용하며 다중 스펙트럼 자동화 키트와 함께 제공되는 스펙트럼 다이를 활용한다는 것을 확인한다.프로토콜이 peroxidase 억제제를 포함하고 있는지 확인하고, 단백질 차단 단계, 1 차 적인 항체, 이차 항체, 티라미드 바닥 및 항원 검색을 포함하는 6개의 순차적 염색 실행이 각각 항체를 제거하는지 확인하십시오. 드롭 컨트롤을 추가하려면 7 멀티플렉스 프로토콜 1'이름을 복사하고 7 멀티플렉스 프로토콜 1 CD68 드롭으로 변경합니다. CD68 항체 시약을 마우스 IgG로 변경하고 프로토콜을 저장합니다.그런 다음 각 드롭 컨트롤에 대해 하나씩 6개의 새 프로토콜을 만들고 동일한 방식으로 완전한 iso 형 컨트롤을 만듭니다. 여기에 표시된 것과 동일한 방식으로 각 대상에 대한 드롭 제어 프로토콜을 만듭니다. 연구 감지 키트를 준비하려면 1X 트리스 버퍼식 식염수로 표시된 30 밀리리터 오픈 컨테이너를 채우고 멀티플렉스 연구 키트 1의 핸들에서 가장 멀리 떨어진 위치에 컨테이너를 배치합니다.2개의 30 밀리리터 오픈 컨테이너 muli-spectral 블록및 다중 스펙트럼 블록에 라벨을 붙이고, 다중 스펙트럼 염색 키트에서 완충 항체 희석제30 밀리리터로 뮤틀리 스펙트럼 블록 용기를 채웁니다. 다중 스펙트럼 이차 용기에 다중 스펙트럼 이차 용기에 다중 스펙트럼 염색 키트에서 안티 마우스 안티 라비드 이차 항체 폴리머 30 밀리리터를 채우고 10 7 밀리리터 오픈 용기각각에 600 마이크로리터의 항체 희석제를 첨가한다. 다음으로, 테이블에 표시된 부피의 적절한 튜브에 농축 된 1 차 항체를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 혼합합니다.이중 증류수 3밀리리터, 12방울의 스펙트럼 다피 한 개와 7밀리리터 오픈 용기에 12방울, 퍼록시다제 블록 3밀리리터를 2차 7밀리리터 오픈 컨테이너에 넣습니다. 디메틸 설옥화물 75 마이크로리터로 각 리아탈화 바닥을 다시 중단하고 파이펫팅으로 섞습니다. 그런 다음 티라미드 신호 증폭 바닥 재고를 준비될 때까지 섭씨 4도에 저장합니다.개별 TSA 바닥 희석을 준비하는 동안. 자동 스테인에 모든 시약을 등록한 다음 각 용기를 시약 랙에 넣고 모든 시약을 자동화된 스테너에 로드합니다. 얼룩은 존재를 감지하고 각 시약의 부피를 확인합니다.모든 시약이 로드되면 프로토콜을 활성화하여 밤새 실행합니다. 염색 절차가 끝나면 커버 슬립으로 샘플을 장착하고 샘플을 다중 스펙트럼 이미징 플랫폼 스캐너에 적재하여 스캔합니다. 모든 샘플을 스캔하면 이미지가 qptiff 파일로 포맷됩니다.적절한 qptiff 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 로드 슬라이드를 클릭하여 관심 슬라이드의 5개의 필터 전체 슬라이드 스캔을 엽니다. 로그인하여 스탬프 도구를 사용하여 다중 스펙트럼 이미징을 위해 5개의 영역을 선택합니다. 아래 선택: 필즈의 언더 사이즈 선택: 1x1 을 선택하고 필드 해상도에서 0.5 마이크로미터 20x를 선택합니다.이 사이토케라틴 염색에 기초하여 사이토케라틴 양성 종양 조직, 및 세포케라틴 음성 기질 조직을 모두 가진 몇몇 영역을 선택하여 전반적인 스캔에서 심영상될 수 있다. 모든 다중 스펙트럼 이미지를 선택한 경우 Vectra 소프트웨어로 전환하여 각 슬라이드에 대해 검사에서 다중 스펙트럼 이미징'으로 작업을 변경합니다. 그런 다음 검사를 클릭하여 다중 스펙트럼 이미징 컬렉션을 수행합니다.다중 스펙트럼 이미지 수집이 완료되면 스펙트럼 언믹싱 소프트웨어를 사용하여 다중 스펙트럼 이미지 폴더 내에서 파일을 엽니다. 이미지 형식에서 다중 스펙트럼'언더 샘플 형식'을 선택합니다'그리고 스펙트럼 라이브러리 소스에서 '선택'inForm'바닥을 선택하고 6 층 을 모두 로드하고 샘플 라이브러리 슬라이드에서 다피를 클릭하고 모든 준비를 클릭합니다. 스펙트럼 언 믹싱 소프트웨어는 제공된 스펙트럼 프로파일을 사용하여 모든 열린 이미지에서 스펙트럼 언믹싱을 수행합니다.자동 형광 스펙트럼 프로파일을 식별하고 주석을 지정합니다. 자동 형광 기능을 확인하여 혼합 해제 후 자동 형광 채널에서 완전히 캡처되었는지 확인하고 다른 샘플링이 허용있게 제거될 때까지 테스트해야 합니다. 그런 다음 병리학자와 동일한 조직의 순차적 슬라이드에서 동일한 표적의 염색체 단일 얼룩에 대한 염색 패턴을 평가합니다.각 채널의 형광 강도를 평가하려면 카운트 도구를 사용하여 열린 이미지를 조사합니다. 그런 다음 염색 프로토콜로 돌아가서 TSA 농도를 조정하여 허용 범위를 초과하거나 도달하지 못하는 정규화된 수를 해결합니다. 이러한 대표적인 분석에서 편도선 조직은 토실 표면 내에서 명확하게 정의된 사이토케라틴 염색을 시연했으며, 시토케라틴과 PDL-1이 토굴의 망막상에서 명백한 침구를 가진 림프구 조직의 배경이 없는 편평상피상피를 입증했다.여포 발아 센터는 Ki-67 양성 림프구에서 쉽게 인식할 수 있고 풍부했습니다. 발아 센터 내에 존재하는 대식세포는 발아 센터 외부에서도 관찰된 일부 대식세포와 함께 CD-68 발현에 의해 확인되었다. CD-8 염색 림프구는 T 세포 분포와 PD-1 발현을 강하게 염색된 작은 림프구가 발아 센터의 주변에 모여, 뿐만 아니라 간 간 부위에 흩어져 있다.예상되는 염색 패턴이 편도선 조직 조절에서 확인된 후, 폐암 샘플에서 동일한 염색을 평가할 수 있었다. 동종형 네거티브 컨트롤 및 드롭 컨트롤도 평가되어야 합니다.배경 및 자동 형광검출뿐만 아니라 우산 효과 및 스펙트럼 출혈도 평가되어야 합니다. 드롭 컨트롤은 새로운 멀티 플렉스 패널의 최적화 중에 다발성 면역 불발성 방법으로 인해 염색에 있는 잠재적인 아티팩트를 평가하는 데 중요합니다.각 낙하 제어는 각 특정 대조군에서 제거되어야 하는 단일 1차 항체를 제외하고 전체 멀티 플렉스 패널과 동일한 염색 패턴을 보여줘야 한다. 다중 스펙트럼 면역 형광을 가진 면역 프로파일링은 면역 기준에 의하여 종양과 지구의 계층화를 허용하고 그 때 대규모 멀티플렉스 게놈, 전사, 및 proteomic 연구 결과에 의해 조사될 수 있습니다. 나는 setu의 한 섹션에서 면역 및 병원성 세포의 식별 및 특성화를 허용하는 종양학 및 자가 면역 장애에서 작용 메커니즘을 조사하기 위해 다중 플렉스 면역 fluorescence를 사용했습니다.일반적인 예방 조치는 인체 단백질, 티라미드 및 다피에 대한 항체와 함께 작업 할 때 취해야하지만,이 프로토콜의 시약이나 물질은 특히 위험한 것으로 알려져 있습니다.

automated-multiplex-immunofluorescence-panel-for-immuno-oncology

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

이 프로토콜은 쥐 FFPE 흑색종 조직의 DNA 바코드 기반 이미징을 위한 다중 면역형광 항체 패널을 설계하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 또한 쥐 흑색종 종양 면역 미세환경에 대한 공간 단백질체학 통찰력을 생성하기 위해 오픈 소스 도구를 사용하는 이미지 분석 파이프라인에 대해 설명합니다.

유전적으로 재프로그래밍된 쥐 흑색종의 FFPE 검체를 분석하기 위한 DNA 바코드 기반 다중 면역형광 이미징

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

배우세요 자동화된 다중 면역형광 패널을 이용하여 포르말린 고정 암 조직에서 면역세포를 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 면역종양학 연구에서 종양 미세환경의 면역 반응을 정밀하게 평가하는 데 필수적입니다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

더 많은 동영상 탐색