Name: 식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 학습하세요 유전자 변형 마우스 전립선 엽 해체 및 조직학 특성화 방법을 통해 전립선암 메커니즘을 연구하세요. 이 기술은 세포 분리 및 3D 스페로이드 배양을 포함한 완전한 분석을 가능하게 합니다.

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이 작품은 국립 암 연구소, LK에 R01CA161018에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 마우스 실험 SUNY Upstate 의학 대학에서 기관 IACUC 승인 프로토콜에 명시 된 지침에 따라 수행 했다.
1. 비뇨 생식 기 시스템 (UGS) 해 부
참고: 회로도 그림 1에 표시 됩니다.
<ol><li>CO2 inhalational 안락사 메서드 또는 다른 승인 된 기술을 사용 하 여 3 개월 남성 C57BL/6 마우스 안락사 참고: 3과 12 개월의 나가 사이 쥐 실험을 위해 성공적으로 사용할 수 있습니다. 이전 마우스 (> 6 개월) 대부분 맑게 될 필요가 있을 것 이다 UGS 주위에 더 많은 지방을 해야한다. 식별 및 돌출부의 분리는 종종 3 개월 보다 젊은 쥐에서 어려운. 다른 긴장 실험, 또한을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>그것의 뒤에 마우스를 놓고 동물의 복 부 측 노출 되도록 핀을 사용 하 여 다리를 확보 합니다.</li>
	<li>마우스의 복 부에 70% 에탄올을 스프레이 하 고 그것을 깨끗 하 게 닦아. 참고: 절 개는 필요 하지 않습니다 하기 전에 복 부 머리를 면도.</li>
	<li>중간 무딘 집게의 쌍에서 복 부 근육 층과 함께 피부를 들어올려 고 거꾸로 Y 자 모양의 절 개가 위를 사용 하 여 복 부에.<ol>
<li>첫째, 날카로운가 위에서 음 경 바로 위의 (그림 2a) 흉 골을 절 개를 직선 만들.</li>
		<li>허벅지 (그림 2b)까지 각 발가락 쪽으로 절 개의 기지에서 잘라. 접어 다시 피부 양쪽에 및 전체 복 부 지역 (그림 2 c-e)을 보려면 아래에서. 참고: 컷된 크기 변화 한다 마우스 나이 및 크기에 따라 달라 집니다. 초기 직선 절 개 크기는 마우스의 크기에 따라 4 cm 1.5에서 범위 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>UGS를 노출 하는 다른 장기 위로 이동 합니다. 리프트와 브라운-노란색 창 자 (그림 2f) 이동. 집게와 복 부 지방 패드 (불투명 백색 해 면 조직)을 선택 하 고 (그림 2 g) 양쪽에 이동. 참고:는 UGS 정액 소포, 요도, 전립선, ductus 정 관 (vas deferens), 및 오 줌 방광의 구성 되어 있습니다. 그것은 기본에 연결 된 액체가 채워진 방광 sac와 불투명 흰색 반원형 아치 (이 정액 vesicles), 특성 쌍에 의해 식별할 수 있습니다. 정액 소포 아래 오른쪽에 있는 반투명 조직 전립선 이다.</li>
	<li>UGS, 단단히 무뚝뚝한 겸 자, 오 줌 방광 잡고 찾아서 마우스 복 부 위쪽에서 전체 UGS를 들어올립니다. 참고: 경우 방광이 가득, 드레인 그것 먼저 하는 집게와 함께 더 나은 그립을 제공 하 고 방광 파열의 위험을 줄일 작은 주사기.</li>
	<li>계속 방광, 척추를 슬라이드 방광과 전립선 아래가 위에 올려 고 한 컷. 모든 나머지 연결 (그림 2 h 와 2i) 복 부 구멍을 통해 잘라. 수 있는 전립선 조직을 통해 사고 절단을 피하기 위해 UGS에 너무 가까이 잘라 하지 않도록 주의 하십시오. 참고: 아래는 UGS 컷 하면서,가 위 한다 삽입 마우스의 뒷면에 있는 모든 방법을 컷 스냅 뿐만 아니라 척추 열을. 이 메서드는 UGS와 마우스에서 조직을 추출 하는 데 필요한 시간을 단축 한 캡처에 복 부 구멍 사이 연결의 거의 모든 severing 발생 합니다.</li>
	<li>UGS를 제거 하 고 2-6 mL (충분히 커버는 조직)에 인산 염 (PBS) 버퍼링 또는 Dulbecco의 6 cm 배양 접시 (2j 그림 및 2 k)에서 독수리 매체 (DMEM, 높은 포도 당)을 수정 하 고 해 부 현미경 (10 X로 이동 확대)입니다. 참고: 나머지 단계에 필요한 해 미디어 변경 합니다.</li>
</ol>2. 해 부 전립선
<ol><li>한 쌍의 미세 집게와가 위 서 (그림 3a)와 등 쪽과 복 부 측면에서 모든 지방 선택을 취소 합니다. 비슷한 수술 도구를 사용 하 여 해 부 프로토콜의 나머지 부분에 대 한. 참고: 지방 질은 종종 밀접 하 게 함께 짝을 이루고 UGS (흰색 스폰지 모양을 하 여 확인할 수 있습니다); 따라서,이 단계는 실수로 어떤 전립선 조직에서 캡처를 방지 하려면 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 그것은 모든 지방을 10-15 분까지 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>개최는 집게와 방광을 당겨 하 고가 위 (그림 3b) 기지에서 싹 둑.</li>
	<li>나머지 조직 복 부 측을 놓습니다. 하나의 ductus deferens 집게를 잡고가 위, 기지에 추적 그리고 그것 (그림 3c), 싹 둑 반대편에 반복. 지금 뒤에 남겨두고 전립선 (반투명 그리고 verminous), 정액 소포 ductus deferens 제거 (불투명 하 고 흰색, 반원형), 그리고 요도 (핑크 빨강과 불투명 튜브) (그림 3d 와 3e).</li>
	<li>정액 소포, 전립선 조직 앞쪽 돌출부의 내부 아치 사이 집게를 삽입 합니다. 놀 리 려는 떨어져 정액 소포, 전립선 필요한 (그림 3 층)으로 모든 결합 조직 싹 둑 하 고. 요도에 그들의 기지에 정액 소포를 추적 하 고 (그림 3 g 및 3 h) 그들을 제거. 수 그들을 찔린 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>개별 전립선 엽 개 해 부를 진행 합니다.</li>
</ol>3. 전립선 및 개별 엽 서 (수치 3i-n, 그림 4)의 심한 해부학
<ol><li>그래서 그는 지 면을 위로, 나비의 날개를 닮은 등 돌출부를 보여주는 조직을 무딘 집게의 쌍을 가진 플립.</li>
	<li>엽 집게와가 위 (그림 3j) 기지에서 캡처를 하 여 등 돌출부를 수집 합니다.</li>
	<li>복 부 측에 나머지 조직에 플립.</li>
	<li>작은 측면 돌출부를 수집 하 고 일반적으로 포장 요도, 측면에는 앞쪽, 복 부, 고 등 돌출부 (그림 3 k) 사이 끼여 있다.</li>
	<li>다음, 수집 측면 돌출부 보다 큰 고 ventrally 요도에 누워 복 부 엽 (그림 3 l).</li>
	<li>마지막으로, 앞쪽 돌출부를 절단 하 고 요도 (그림 3 m)을 삭제 하 여 4의 가장 큰 수확.</li>
	<li>실험 요구 사항에 따라 조직 조각을 처리 합니다. 조직학, 대 한 제 4 또는 제 5 회전 타원 체 문화에 대 한 이동 합니다.</li>
</ol>4. 엽 신분증과 Hematoxylin와 오신 스테인드 슬라이드 형태
<ol><li>전립선 조직 수정 하 고 파라핀에 포함. 진행 되며와 오신 (H & E) 보고 올리베이라 외에 의해 설명 된 특성을 사용 하 여 조직학에 따라 전립선 돌출부에 차이 식별 하는 슬라이드를 얼룩. 12 (그림 5).</li>
</ol>5. 3D 문화10 조직 처리
참고:이 그림 6에 요약.
<ol><li>계속 실험 필요에 의하여 전체 전립선 또는 개별 돌출부를 경작 합니다. 전립선 조직 DMEM의 2-3 mL를 포함 하는 10 cm 접시에 전송. 메스와 함께 가늘게 및 해 부 현미경 아래 최대한 전립선 tubules를 말하다.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 조직 문화 후드 나머지 단계를 계속 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브는 DMEM 함께 조직 조각을 전송 하 고 DMEM과 9 mL를 볼륨을 증가. DMEM 조직 혼합물을 혼합 하는 소용돌이 10 x 콜라 재고 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 콜라 재고 솔루션 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 10 mg/mL 이며 15 mL 튜브에 최종 농도 1 mg/mL 이다.</li>
	<li>선회 통에 튜브 또는 튜브는 세포 외 기질을 저하 콜라에 대 한 37 ° C에서 2 시간에 대 한 회전 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 튜브 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 쪼개-셀 및 셀-매트릭스 유착을 따뜻한 0.05% 트립 신-EDTA의 2 mL에 resuspend. 5 분 동안 37 ° C에 튜브를 전송. 참고: 조직 덩어리를 잘 섞어 너무 큰 경우에, 더 넓은 구멍을 면도날으로 피 펫 팁을 잘라.</li>
	<li>8-10 번, P1000 피 펫과 pipetting 다음 P200 피 펫을 반복 하 여 모든 조직 덩어리를 헤어.</li>
	<li>완전 한 DMEM의 3 mL와 트립 신을 무력화. 500 U DNAase의 추가 나 하 고 잘 혼합.</li>
	<li>통과 5 mL 주사기 5-10 회 18 G 바늘. 다음 통과 5 회 20 G 바늘으로.</li>
	<li>솔루션에는 여전히 큰 조직 덩어리 들어 있으면 4-8 단계를 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 40 μ m 필터를 통해 필터링. DMEM의 5 mL와 함께 15 mL 튜브를 헹 구 고 동일한 필터를 통과. 린스를 반복 합니다.</li>
	<li>필터를 삭제 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 흐름 통해 포함 된 튜브 원심.</li>
</ol>6. 도금 및 세포 배양
<ol><li>완전 한 전립선 상피 세포 성장 매체 (PrEGM)의 0.5 mL에 펠 릿을 resuspend. 셀 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 밀도 계산 하 고 완전 한 PrEGM에5 셀/mL 5 x 10을 셀을 희석. 참고: 3 개월 마우스 전체 전립선에서 수익률 3 x 105-106 세포에서 배열할 수 있다. 따라서, (듯이)에 원하는 셀 밀도, 낮은 수익률도 함께 얻을 수 있도록 더 이상 0.5 ml PrEGM의 펠 릿 처음 resuspend에 중요 하다.</li>
	<li>2:3 볼륨 비율 (60% 지하실 멤브레인 ECM 및 40% 세포 현 탁 액) 및 멀티 잘 플레이트 또는 실험적인 요구에 의하여 챔버 슬라이드 플레이트에 지하실 막 ECM으로 셀의 필요한 볼륨 믹스. 참고: immunostaining, 접시 유리 하단 또는 챔버 슬라이드에 대 한 전체 잘 또는 우물의 중간 취재. 우물의 테두리 하십시오 결과 organoids를 계산 하는 경우 또는 더 높은 볼륨을 도금 하는 경우 잘 전면으로 몇 방울을 접시. 그것은 너무 두껍거나 너무 얇게 확산 되지 염두 됩니다. 행렬 셀의 지역; 도금의 1 c m2 당 적어도 100 µ L 플레이트 예를 들어 2cm2챔버 슬라이드에에서-잘 표면적, 5 x 104 의 세포를 포함 하는 행렬 셀 혼합물의 200 µ L를 도금 한다.</li>
	<li>접시/슬라이드 지하실 멤브레인 공고히 ECM에 대 일 분 동안 5% CO2 37 ° C 배양 기에 전송. 그런 다음, 지하실 멤브레인 ECM 플러그를 방해 하지 않도록 주의 복용 잘 커버를 미리 데워 진된 완전 한 PrEGM를 추가 합니다.</li>
	<li>미디어의 절반을 제거 하 고 2-3 일 마다 신선한 미디어를 추가. 5-10 일 동안 spheroids를 성장.</li>
	<li>(7 단계), immunostaining (8 단계), 수확 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 이미지와 함께 진행 합니다.</li>
</ol>7. 수확 분야
<ol><li>분야를 수확, 지하실 멤브레인 ECM 젤 플러그를 방해 하지 않고 미디어를 신중 하 게 발음 하 고 지하실 멤브레인 ECM의 100 µ L 당 PrEGM에 1 mg/mL dispase 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 그것은 그들이 잘 또는 변죽 (전체 잘 다루는), 대신 중간에 도금 하는 경우 spheroids을 수확 하기가 dispase 솔루션의 적절 한 금액 우물에 추가 될 수 있도록.</li>
	<li>Dispase PrEGM 솔루션으로 지하실 멤브레인 ECM 젤에서 리프트 셀 스 크레이 퍼와 접시의 바닥을 긁어.</li>
	<li>피펫은 넓은 한 번 아래로 전체 솔루션 1000 µ L 피 펫 팁 또는 작은 조각으로 젤 플러그 헤어 5 mL 피 펫을 낳았다. 참고: 넓은 구멍 팁을 면도날으로 1000 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
	<li>지하실 막 ECM 완전히 용 해 될 때까지 1-2 h 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 품 어. 참고:이 젤의 더 없는 덩어리 남아 확인 접시를 기울이기 동안 잘 바닥의 검사에 의해 보장 될 수 있다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 250 x g에서 분야를 원심 고 다운스트림 응용 프로그램 계속 합니다.</li>
</ol>8. 분야13 Immunostaining
참고: spheroids는 원하는 시간 동안 성장, 지하실 멤브레인 ECM 녹을 수 있다 고 Colicino 외 에 설명 된 대로 분야를 얼룩이 질 수 있다 13.
<ol><li>간단히, PBS와 문화를 씻어 하 고 지하실 멤브레인 ECM 젤 플러그에 직접 4 %paraformaldehyde (PFA)를 추가 합니다. 지하실 막 ECM 완전히 해산 신선한 PFA 마다 30 분 교체 될 때까지 느린 떨고와 실 온에서 30-90 분에 대 한 품 어. 참고:는 PFA 젤 플러그를 녹이 고이 과정에서 spheroids를 수정 합니다.</li>
	<li>다음, PBS 3 번 세척 하 고 50 m m는 PFA에서 어떤 autofluorescence를 끄다 10 분에 대 한 염화 암모늄을 추가. PBS 가진 3 세척에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>5 분 및 PBSAT 블록에 대 한 0.1% 비 이온 세제로 permeabilize (PBS, 1 %BSA, 0.5% 트라이 톤 X-100) 30 분.</li>
	<li>PBSAT와 실 온에서 2 h에 대 한 PBSAT에 이차 항 체 3 세척 다음 4 ° C에서 하룻밤 PBSAT에 1 차 항 체로 품 어.</li>
	<li>필요한 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 PBSAT와 세척 및 DAPI와 얼룩을 반복 합니다. PBS 가진 3 개 이상 번 씻는 다.</li>
	<li>200 m m 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] 옥 탄 (DABCO) antifade 시 약으로 PBS를 추가 하 고 영상 진행.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 문서는 마우스 전립선의 해 부 및 개별 돌출부의 식별 방법을 설명합니다. 또한 생체 외에서 분석에 대 한 3 차원 문화에 마우스 전립선 세포 배양에 대 한 프로토콜이입니다.
해 부 프로토콜의 중요 한 단계가입니다 (1) 마우스에서 전체 UGS를 수확 하 고 분리 해 부 현미경 아래 개별 기관. 전립선 조직 이며 매우 작은 UGS;의 나머지 부분에 의해 둘러싸인 따라서, 그것은 불가능 사실상 그대로 돌출부의 모든 4 개 쌍을 조달 하는 동안 신체 구멍에서 직접 장기를 수확 합니다. 따라서, 그것은 마우스에서 전체 UGS를 수확 하 고 전립선을 추출 진행 하는 것이 중요입니다. 그것은 또한 (2)이이 프로토콜에 중요 한 시기의 단계를 수행 하지만 세심 한 유지. 시간은 본질의 해 부 동안 조직 저하를 최소화 하기 위하여 이다. 마우스에서는 UGS를 추출에 대 한 여기에 설명 된 특정 기술 대안에 비해 더 빨리 하 고는 것이 좋습니다. 전체 해 부와 엽 격리 절차는...

사회 과학 수십 년 동안 인간의 암 개발의 복잡 한 메커니즘을 명료 하 게 시도 되었습니다. 반면 잠재적인 핵심 선수 및 마약 대상 환자 세포와 조직 연구 시작, 종종 이러한 결과의 변환 응용 프로그램 전 임상 동물 모델의 사용을 해야 합니다. 유전자 조작된 생쥐 모델 (GEMMs) 모델 인간의 암 마우스 모델의 인간 암 컨소시엄 (NCI-MMHCC), 설명 및 마우스 암의 특성을 통합 하는 위원회의 설립 이후 꾸준히 상승 했다의 사용 과학자 들은 전세계1,2에 대 한 모델. 마우스 모델 개발, 진행, 치료에 응답을 이해 하기 위한 암 대부분의 종류의 전 임상 연구에서 기계 론 적인 연구에 대 한 필요성을 충족 하 고 저항3인수.
전립선 암은 남성, 모든4이상 160000 남자에 영향을 미치는 가장 일반적으로 발생 한 암이 이다. 적극적인 형태의 질병 생활 매년 수천 수만의 주장. 그러나, 질병의 진행의 메커니즘은 여전히 가난 하 게 이해 된다. 고급 전립선 암 환자4에서 높은 사망 율 알 수 있듯 고급 및 전이성 전립선 암에 대 한 효과적인 치료 옵션의 심각한 부족을 발생합니다. 따라서, 전립선 암 연구를 전 임상 모델에 대 한 필요성이 있다. 그러나, 마우스 및 인간의 전립선 사이의 고유의 차이 때문 GEMMs에 전립선 암의 모델링 얻지 않았다 인기 바 하버 분류 시스템 마우스 histopathological 변화를 설명 하는 2004 년에 도입 되었다 때까지 유전자 조작, 종양 약 변경, 식별 및 인간5암 진행의 단계에 그들의 관계의 전립선 어떤 전립선 GEMM 모델을 공부 하는 동안 고려 사항으로 수행 해야 하는 마우스 전립선의 하나의 중요 한 특징은 네 가지 쌍 돌출부의 존재: 전방, 측면, 복 부와 등 쪽. 돌출부는 histopathology 및 유전자 표현 패턴6에 큰 차이가 존재. Probasin 단백질 식 패턴 젊은 포스트 사춘기 마우스7, 고려 되어야 한다 Cre 기반 GEMM 모델은 주로 설계 되었습니다 이후 Pb-Cre47라고 probasin 기반 promotor를 사용 하 여에 돌출부 사이의 달라질 수 있습니다. 종종 Cre 식에서 결과 공간 및 시간 차이 이어질 종양 약 변화에 차이 뿐 아니라 종양 개시 및 진행 타임 라인에 차이 돌출부 사이. 따라서, GEMMs, 전립선에서 종양 개발을 공부 하는 동안 이러한 차이 담당 하는 것이 중요 하다 고 개별 돌출부 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 평가 될 필요가 있습니다. 이 문서의 첫 번째 부분에는 마우스 전립선의 해 부, 식별 하 고 각 엽, 별도 돌출부 사이 조직학 차이 인식 적절 한 방법을 설명 합니다.
종양의 성장 및 histopathology 분석 종양 개발에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 그들은 분자 메커니즘에 대 한 많은 정보를 제공 하지 않습니다. 공부 하 고 종양의 개발 및 진행의 메커니즘, 그것은 종양 세포 생체 외분석 종종 유용 합니다. 서 스 펜 션 문화, 3D 문화8 을 포함 하 여 이러한 셀의 문화를 포함 하는 수 년에 걸쳐 여러 가지 방법이 제안 되었습니다 그리고 최근에, 일반 2D 문화9. 반면 이러한 메서드의 대부분 좋은 세포 생존 및 확산 속도 결과, 3D 문화 생리 적 조건에 가장 가까운 환경을 제공 합니다. 3D 또는 회전 타원 체 문화는 지하실 막 세포 외 기질 (ECM)에서 성장, 완전히 차별화 된 luminal 세포는 일반적으로 매우 낮은 생존 율을; 있다 그러나, 기초 및 중간 세포 (주로 줄기 세포) 라는 spheroids10셀 클러스터를 생산 하 고 전파 수 있습니다. 이것은 그것 암 연구에 대 한 적합 한 이후 상피 암 줄기 세포 (암 줄기 세포로 널리 알려져 있는)11에서 발생 한 것으로 추정 된다. 이 프로토콜의 두 번째 부분 3D 문화에 마우스 전립선 세포를 배양 하는 방법을 설명 합니다. 결과 분야 organoid 형태학 및 라이브 셀 이미징, 면역 형광 검사 다른 단백질에 대 한 얼룩으로 행동의 연구 및 화학요법에 대 한 응답의 연구를 포함 하 여 다운스트림 분석의 여러 종류에 사용할 수 있습니다. 치료입니다.
전반적으로,이 프로토콜의 목표는 마우스 전립선의 해부학 및 해 부 기술 및 회전 타원 체 문화 및 생체 외에서 분석을 위한 조직 처리를 설명 하 여 전립선 암에서 마우스 모델을 사용 하기 위한 최적의 방법 개요 .

<table><tbody><tr><td>마우스 수술 기구(마우스 해부 키트)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 배지</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>해부 배지(DMEM + 10%FBS)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>10438018</tr><tr><td>PBS (Phosphate buffered saline)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17018029</td><td>RPMI로 10배 (10mg/ml) 제조, 여과 살균, 분취 및 -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마-알드리치</td><td>10104159001&nbsp; ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>주사기 및 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran&nbsp; 멸균 세포 여과기, 40&mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>PrEGM BulletKit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3166</td><td>모든 구성 요소, 부분 표본을 추가하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>Matrigel 멤브레인 매트릭스</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II 분말</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td>PrEGM에서 10x 재고(10mg/ml)를 만들고 필터 살균, 분취 및 -20°에서 보관합니다. 씨</td></tr></tbody></table>

식별, 조직학 특성화 및 체 외 3d 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 인간의 암, 전립선 암 (PCa) 등의 대부분의 종류를 조사에 대 한 효과적인 전 임상 모델 역할을 합니다. 해부학 및 조직학 마우스 전립선의 이해 하는 것이 효율적인 사용과 같은 동물 모델의 적절 한 특성에 대 한 중요 합니다. 마우스 전립선 엽 각각 그들의 자신의 특성의 4 가지 쌍 있다. 이 문서에서는 적절 한 해 부 방법 및 질병 분석에 대 한 마우스 전립선 엽의 식별 합니다. 후 해 부, 전립선 세포 배양 체 외에 기계적 이해에 대 한 추가 될 수 있습니다. 마우스부터 전립선 1 차 셀 그들의 일반적인 특성을 잃게 하는 경향이 때 교양 생체 외에서우리는 개요 여기 세포를 분리 하 고는 생리 보존에 대 한 효과 3D 회전 타원 체 문화로 그들을 성장 하는 방법 셀의 특성입니다. 이러한 3D 문화 세포 형태학 및 조사 근처 생리 적 조건에서 동작 변경 수준 및 주요 단백질 및 경로 개발에 참여의 지 방화는 질병의 진행을 분석 및 보고에 사용할 수 있습니다. 약물 치료에 응답 합니다.

마우스 전립선 엽 확인 될 수 있다 고 정액 소포 및 요도 위치를 사용 하 여 해 부. 마우스 전립선 4 쌍 dorsally 있는 돌출부의 ventrally 정액 소포 및 요도 구성 됩니다. 그림 4a 와 4b (맨 위) 그대로 전립선, 정액 소포 및 요도의 등 쪽과 복 부 뷰를 표시합니다. 하단 패널 (그림 4 c 및 4 d) 다른 엽 식별에 대 한 설명을 표시 합니다. 돌출부는 3 개월 어린 쥐에서 분리 수 있습니다.
다른 전립선 엽 조직학 (그림 5)에서 크게 다르다. 모든 마우스 전립선 엽 분 비 상피 세포; 둘러싸여 루멘의 구성 하는 여...

유전자 조작된 생쥐 전립선 암 메커니즘을 조사를 위해 유용한 모델이 있습니다. 여기를 식별 하 고 마우스 비뇨 생식 기 시스템에서 전립선 엽 해 부, 조직학에 따라 구분 하 고 분리 다운스트림 분석에 대 한 spheroids로 기본 전립선 세포에는 생체 외에서 문화 프로토콜 선물이.

식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

이 방법은 전립선암의 유전자 조작 마우스 모델의 시작과 생체 내 및 체외 분석을 통해 전립선암 메커니즘의 조사에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 해부에서 세포 격리 및 배양에 이르기까지 전립선암 마우스 모델의 완전한 분석을 허용한다는 것입니다. 비뇨 생식기 시스템, 또는 UGS를 노출 한 후, 단단히 중간 무딘 집게와 오줌 방광을 잡고, 마우스 복부에서 전체 시스템을 들어 올립니다.방광과 전립선 아래 가위 한 쌍을 밀어 척추에 모든 방법을 밀어 척수를 통해 절개를하고, 전체 UGS의 제거를 허용하기 위해 복강에 남아있는 연결을 잘라. UGS를 해부 현미경으로 PBS 2~6밀리리터가 함유한 6센티미터 페트리 접시로 옮는다. 그리고 미세 한 집게와 미세 절 가위를 사용하여 전립선 조직을 자르지 않고 조직 시스템의 등쪽 및 복부 측면에서 모든 지방을 조심스럽게 지웁습니다.모든 지방이 제거되면 방광을 집게로 당기고 방광을 기지에서 소비합니다. 나머지 조직 복부 쪽을 위로 놓고 집게로 하나의 덕트 끝을 잡고, 가위로 혈관을 따라 그 기지에 혈관을 소비한다. 다른 쪽에 동일한 용기를 제거하고 정액 소포와 전립선 사이에 집게를 삽입하여 필요에 따라 인접한 결합 조직의 조각을 허용합니다.그런 다음 요도의 기지에 정액 소포를 추적하고 혈관을 구멍을 뚫지 않고 제거하십시오. 두 소포가 모두 제거되면, 나비의 날개를 닮은 등쪽 엽이 보이면 조직 등쪽을 위로 놓습니다. 각 등쪽 엽을 집게로 잡고, 등쪽 엽을 수집하고 복부 측에 조직을 설정하는 가위로 베이스에 조직을 잘라.측면 엽을 수집, 이는 작고 일반적으로 측면에 요도를 포장하고 같은 방식으로 전방, 복부, 및 등쪽 엽 사이에 쐐기된다. 측면 엽보다 큰 복부 엽을 수집하고 요도에 누워 있습니다. 그런 다음 요도를 자르고 버리고 전방 엽을 수확합니다.3D 배양을 위한 전립선 조직을 처리하기 위해, 로브를 DMEM의 2~3밀리리터를 함유한 10센티미터 접시로 옮기고, 메스를 사용하여 전립선 튜블러를 가능한 한 섬세하고 고르게 다진다. 조직 단편을 멸균 조직 배양 후드로 옮기고 새로운 15 밀리리터 튜브에 조직 용액을 추가합니다. 튜브의 부피를 신선한 배지로 최대 9밀리리터까지 가져와 텐X 콜라게나제 스톡 용액 1밀리리터를 조직 혼합물에 추가합니다.소용돌이 후, 세포 외 매트릭스를 저하시키기 위해 섭씨 37도에서 2 시간 동안 흔들어 튜브를 배양. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 조직을 수집하고 EDTA에서 따뜻한 05 %의 스트립의 두 밀리리터에 펠릿을 다시 중단. 세포 간 및 세포 간 유착을 용이하게하기 위해 섭씨 37도의 5 분 후, 모든 덩어리를 깰 조직을 세타게하는 넓은 보드 팁P1000 파이프 헤드를 사용합니다.P200 파이프헤드 팁으로 해리를 반복합니다. 그런 다음 트립신을 완전한 매체의 3 밀리리터로 중화시합니다. 500단위의 DNASE1을 조직 슬러리에 넣고 18게이지 바늘이 장착된 5밀리리터 주사기를 통해 5~10회 용액을 통과한 다음 20게이지 바늘을 통해 5회 전달합니다.더 이상 큰 조직 조각이 보이지 않는 경우 40 마이크로미터 필터를 통해 서스펜션을 50 밀리리터 원유형 튜브로 필터링하고 원심 분리로 세포를 수집합니다. 세포 도금 및 배양의 경우, 완전한 전립선 상피 세포 성장 배지의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 전립선 상피 세포 성장 중간 농도의 밀리리터 당 5배 10~5번째 세포로 세포를 암시한다. 세포를 지하 막 세포 외 매트릭스와 혼합하여 2~3부의 용액 비율로 혼합하고, 적절한 실험세포 배양 용기에서 세포 현탁액을 플레이트한다.그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터에 30 분 동안 배치하십시오. 세포외 매트릭스가 고화되면, 전동된 완전한 전립선 상피 세포 성장 매체로 배양을 커버하여 지하 막 세포 외 매트릭스 플러그를 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 5~10일 간 돌려보내 2~3일마다 배지의 절반을 상쾌하게 한다.구체를 수확하려면 지하 멤브레인 세포 외 매트릭스 젤 플러그를 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 흡인하고 지하 막 세포 외 매트릭스의 100 마이크로 리터에 대한 Disbase 용액 1 밀리리터를 추가하십시오. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 의 바닥을 따라 긁어 내어 플레이트 바닥에서 세포외 젤을 슈퍼나티로 들어 올리고 전체 용액을 한 번 파이프하여 플러그를 작은 조각으로 분해합니다. 지하 막 세포 외 매트릭스가 완전히 용해 될 때까지 세포 배양 인큐베이터에서 여분의 세포 매트릭스 조각을 1 ~ 2 시간 동안 배양합니다.그런 다음 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 그리고 추가 다운스트림 조작을 위해 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 마우스 전립선은 정액 소포와 요도에 등대 및 통풍관에 있는 로브의 4쌍으로 이루어질 것입니다.전립선 엽은 여러 선 프로파일로 구성되어 있으며, 각각 은밀상피 세포로 둘러싸인 루멘으로 구성됩니다. 엽의 모양, 세포의 조직 및 분비의 특성은 로브에서 로브까지 다양합니다. 고립 된 전립선 세포는 지하 막 세포 외 매트릭스 배양 후 4 일 일찍 오르가노이드로 성장하기 시작합니다.다음 1~6일 동안 대부분의 세포는 부분또는 전체 루멘을 나타내는 구체의 일부와 함께 고체 구체로 자랍니다. 스페로이드는 또한 F-액틴 염색과 공동 국소화되는 세포 대 세포 접합부에서 강한 베타 카테닌 염색을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 미세 절 단계를 꼼꼼하게 따르는 것이 매우 중요합니다.예를 들어, 전립선 엽을 요도에 부착하는 동안 분리하므로 요도에 대해 어느 엽이 있는지 알 수 있습니다. 해부 절차에 따라, 절연 된 엽은 RMA 시퀀싱, 서양 블로팅 또는 면역 스테인닝과 같은 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다. 1 차적인 3D 배양 기술은 형태학 및 행동 변경을 위한 spheroids를 가진 생활을 감시하고 동일에 있는 어떤 신생물 변경을 확인할 수 있기 때문에, 전립선 암 기계장치에 추가 통찰력을 얻을 수 있습니다.요약하자면, 이러한 전립선 해부 및 배양 방법은 유전자 조작 된 마우스 모델을 사용하여 전립선암의 메커니즘을 조사하기위한 귀중한 정보를 제공하기 위해 다양한 다운스트림 응용 프로그램에 통합 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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쥐의 전립선 마이크로 해부 및 수술 거세

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발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

여기, 우리 인간의 기본 전립선 organoid 처리 안내 다음 끝점 표현 형을 평가 하는 것이 좋습니다 프로토콜을 제시. 시드, 문화 유지 보수, 매트릭스 젤에서 복구 형태 론 적 정량화, 포함 및 단면, FFPE 단면, 전체 마운트 얼룩, 및 상업적인 분석의 응용 프로그램 설명 합니다.

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

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유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

이 프로토콜은 2D에서 성장된 쥐 전립선 오가노이드 기반 모델 생성을 설명합니다. 이 과정에는 오가노이드 해리, 세포 시딩, 분화, 상피 완전성 평가, 그리고 요로병원성 대장균에 의한 시험관 내 감염이 포함됩니다. 이 모델은 끝부분 접근성을 제공하며 숙주-병원체 상호작용 연구에 적합하여 전통적인 3D 오르가노이드 시스템의 한계를 극복합니다.

숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 마우스 전립선 오가노이드 기반 모델 생성

학습하세요 유전자 변형 마우스 전립선 엽 해체 및 조직학 특성화 방법을 통해 전립선암 메커니즘을 연구하세요. 이 기술은 세포 분리 및 3D 스페로이드 배양을 포함한 완전한 분석을 가능하게 합니다.

식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

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