Name: 돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 학습하세요 돼지 간세포를 이용한 ex vivo 유전자 치료와 자가 이식 기법으로 유전성 티로시네미아 1형을 치료하는 방법입니다. 이 기술은 면역억제 위험을 줄이고 다양한 간 질환 치료에 적용할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

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저자는 전문성 수술 절차 동안 지원을 위한 포털 정 맥 주입, 스티브 Krage, 조 앤 로버츠, 그리고로 리 Hillin를 수행에 대 한 드 웨인 Meixner을 감사 합니다. 이 작품은 어린이 병원의 미네소타 기초 및 재생 의학 미네소타에 의해 지원 되었다. R.D.H. 재생 의학 경력 개발 상을 위한 NIH K01 DK106056 보너스와 메이 요 클리닉 센터를 통해 투자 되었다.

모든 동물 절차 기관 지침에 따라 수행 된 검토 하 고 연구 행위 이전 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 절차는 수술에 적합 하 고 건강 한 것으로 간주 되는 나이의 3 개월까지 남성과 여성의 큰 백색 농장 돼지 (50 %Landrace/50% 큰 화이트 유전 배경)에 수행 했다.  동물 기관 수의 관리 직원에 의해 호환 되지 않는 것으로 간주 하지 않는 한 사회적으로 지 내게 됩니다.  동물 적어도 한 번 매일 관리 직원에 의해 차 우 두 번 매일 하 고 임상 증상에 대 한 관찰의 적절 한 수준을 먹인 다.
1입니다. 수술을 위한 준비
<ol><li>5 mg/kg telazol 및 진정 작용을 유도 하는 것을 피하는 2 mg/kg xylazine를 관리 합니다. 수술 후 무 통을 위한 0.18 mg/kg의 복용량에 피하 buprenorphine 명함 관리 (무 통이이 복용량에서 72 h를 될 것으로 예상). 수동으로 응답 진정 확인에 대 한 동물을 확인 합니다.</li>
	<li>일단 진정, 약리학 적인 접근에 대 한 주변 귀 정 맥에 정 맥 카 테 터를 삽입 합니다.</li>
	<li>수술 전 정 맥 25 mg/kg cefazolin와 ceftiofur의 근육 5 mg/kg를 관리 합니다.<ol>
<li>혈압과 심장 박동 절차를 통해 정상적인 생리 한계 내에서 유지 하는 정 맥 정상적인 염 분 관리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복 부를 압축 하는 orogastric 튜브를 놓습니다. 적절 한 크기의 endotracheal 튜브 endotracheal 삽 관 법을 수행, 증발 기, 감지 수동으로 가슴을 압축 하 여 적절 한 배치를 확인 하 고 1-3 %isoflurane 동물을 기계적으로 환기.</li>
	<li>심전도 (ECG) 리드, 혈압 팔목, 온도 프로브, 및 생체 신호를 모니터 및 기록 하 펄스 속도도 장소. 동물 부정사 위치에서, 흉 곽에서 골반 betadine와 복 부를 문질러 놓고 sterilely 드러 워 진.</li>
	<li>마 취의 수술 평면을 유지 하는 절차 중 1-3 %isoflurane 주제를 환기. 변경에 대 한 생체 신호를 모니터링 하 고 유지 하려면 사전 절 개 수준에서 심장 박동 혈압 강하 극적으로 isoflurane 감소 같은 생명력, 복원 제도 승인 에이전트 시작 isoflurane 조절 하 정 맥 피 네 프 린입니다.<ol>
<li>심장 박동, 호흡, 혈압, 비율과 온도 추적 하 고 유지 하는 큰 동물 복지 표준 준수 하기 위해 교육 기관 관련 정책에 따라 동물 복지 수술 기록에 기록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 복 강경 부분 Hepatectomy
<ol><li>초기 포트 사이트 항목은 배꼽에 cephalad 오픈 Hassen 기술을 사용 하 여 수행 합니다. 복 막 시각 때 안전 하 게 복 부 구멍으로 12mm trocar를 소개 합니다. 이 포트를 통해 5 mm, 30 °, 범위를 전달 합니다.</li>
	<li>CO2 15 mmHg 복 부 insufflate 복 강경 카메라와 함께 직접 시각화, 아래 두 개의 추가 5 m m 포트 간 왼쪽된 측면 엽에 측량을 배치 합니다. 포트의 정확한 배치 크기와 동물의 해부학에 따라 달라 집니다.<ol>
<li>이 시점에서 5mm 포트 중 하나에 복 강경을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>왼쪽된 엽의 주요 균열 지점 간 왼쪽된 측면 세그먼트를 식별 합니다. 이 게 의료와 왼쪽 측면 세그먼트 구분합니다. 수술 용 스테이플러를 사용 하 여이 게 따라 간 정 맥 함께 포털 구조 확보 ( 재료의 표참조). 60, 45, 또는 30mm 긴 혈관 부하를 사용 하 여 스 테 플 러에서 순차적 실행을 사용 하 여이 균열을 통해 실질 transect<ol>
<li>Parenchymal 절제 완료 되 면 적절 한 hemostasis 되도록 남은 간을 평가 합니다. 로 또는 봉합 된 실질에서 어떤 출혈을 제어 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>내 시경 graspers 및 내 시경 조직 검색 가방을 사용 하 여 간 섹션을 검색 합니다.</li>
	<li>포트를 제거 하 고 중간 근 막, 피부 깊은 층에 대 한 실행 2-0 봉합 및 subcuticular 계층에 대 한 실행 4-0 봉합 사 봉합 사 중단된 크기 0와 3 개의 층에 12 m m 포트 절 개를 닫습니다. 5 m m 포트 2-0으로 한 층에 닫힐 수 있습니다.</li>
	<li>( 재료의 표참조) 절 개에 멸 균 드레싱을 놓습니다.</li>
	<li>셀 4 시간 이내에 준비가 될 것입니다 때 autotransplantation의 시간까지 전신에서 동물 post-operatively 유지.</li>
	<li>또는 셀 조작 장기간을 요구 하는 경우 (예: hepatocyte spheroids 또는이 방법의 개별 응용 프로그램에 따라 더 이상 변환/선택 기간의 형성을 허용) 허용 동물 마 취와 반복에서 복구 하는 autotransplantation 셀 준비가 전에 마 취 유도 단계.</li>
</ol>3. hepatocyte 절연
<ol><li>연결할 연동 펌프 (43 ° C 물 욕조에 유지) 따뜻한 분산 솔루션을 제공 하도록 설정 하는 관류와 간 섹션의 큰 노출된 혈관에 배치 하는 카 솔루션 온도 38 ° C는 조직에 소개 시. 모든 배관, 장비 및 솔루션 유지 되어야 세포 이식 적합 되도록 살 균.<ol>
<li>프라임 펌프와 튜브 당 II와 I와 II 당 배달 조직에 당 사이 전환 배치 자 지까지. 당 놓고 프라임 튜빙 세트의 나머지 소개를 방지 하기 위해 완전히 인라인 거품 트랩을 작성 하는 자 지를 전환 조직에 기포.</li>
	</ol>
</li>
	<li>깨끗 한 가로 수직 문맥 분 지의 횡단면을 간 순환을 잘라 준비 하 고 키 모 혈관 도관 법에 대 한.</li>
	<li>perfusate의 누설을 방지 하는 아늑한 피팅 카 테 터와 함께 사용할 수 있는 노출된 정 맥 catheterize 1 포털 cannulate 하 고 조직의 적절 한 관류를 위해 정 맥 간장 1.<ol>
<li>catheter(s)는 공기의 액/무료 정 맥에 카 테 터를 배치 하기 전에 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mL/min, 콘센트 튜브에서 정 맥을 정 맥 30 초 마다 1 분 주기를 통해 이동 15-20 분에 대 한 모든 사용 가능한 혈관에서 나 당 따뜻한 perfuse. 동안 난 당 주입, 대피 튜브 절차 트레이 비어 있는 진공에서 폐기물 컨테이너를 설정 합니다.</li>
	<li>100 mL/min, 정 맥으로와, 당 30 분의 총 순환에 당 II로 전환. 2 당 동안 반환 펌프 사용 하 여 활성 효소의 준비를 보존 하기 위해 다시 관리를 위한 저수지에 다시 당 II를 재활용. 리턴 펌프 유출 펌프 보다 낮게 설정 (즉, 94 mL/min), 소스 병에 과도 한 공기를 반환 하지 않도록 주의 되 고.<ol>
<li>간 캡슐 휴식,이 시간을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>간은 완전히 소화 되지 경우 (남아 있지 않는다 부드러운 초점 압력 보조 개가) 관류의 추가 5 분을 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>때때로 (약 매 5 분) 문서는 hepatocytes 감기 하지 못하고 되도록 간 거품 트랩의 표면 온도. 간은 점점 추 워 하는 경우 (< 35 ° C) 38 ° c 가까이 간 온도 복원 물 목욕의 열을 증가 관류 진행 간 위임 해야 합니다.</li>
	<li>간 살 균 격판덮개 또는 셀 문화 후드 수 수송을 위한 페 트리 접시를 제거 합니다. Hepatocyte 처리 하는 동안 무결성을 유지 하기 위해 무 균 드 레이프와 살 균 분야 커버.</li>
	<li>무 균 드 레이프에서 간 절 하 고 찬 hepatocyte 세척 미디어 (HWM) 간 잠수함. 위쪽에 위를 드래그 하 여 캡슐을 방해. 멸 균 장갑 착용, 부드럽게 매체에 있는 hepatocytes 출시 간 마사지.</li>
	<li>HWM hepatocytes 멸 균 거 즈를 통해 큰 (~ 200 mL) 원심 분리기 병에 포함 된 필터링. 3 중으로 첫 번째 물의 resuspension 후 여러 병에서 셀 펠 릿 결합에서 다음 절차를 통해 hepatocytes 세척:<ol>
<li>50 x g, 5 분, 4 ° C에서 원심 분리기</li>
		<li>발음 하 고 HWM의 150ml에서 resuspend.</li>
		<li>HWM 3rd 세척 후 펠 릿을 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가능한 한 hemocytometer 또는 다른 장치를 사용 하 여 셀 농도 계산 합니다. 이 세포는 ex vivo 유전자 치료, 세포 분류, 또는 autotransplantation에 앞서 다른 전문화를 포함 하 여 관심의 조작에 대 한 준비가 지금. 특정 농도 (셀/mL)를 대상으로 HWM의 최종 볼륨을 조정할 수 있습니다.</li>
</ol>4. hepatocyte 변환
<ol><li>미디어에서 hepatocytes resuspend (Dulbecco의 수정된이 글 매체 [DMEM], 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS] 페니실린 스, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic [HEPES], dexamethasone, 표 피 성장 인자 [EGF] 산과 NTBC) 1-2 얼음에 원뿔 튜브에 mL 당 백만 셀입니다.</li>
	<li>Lentiviral 벡터 실 온에서 해 동 하 고 추가 감염 (MOI) 셀 바인딩할 대상 20 다양성에서 얼음에 원뿔 튜브. 세포 표면에 바이러스 성 벡터를 바인딩할 90 분 10 rpm에서 4 ° C에서 세포를 회전 합니다.</li>
	<li>30-40 분 혼합 바인딩된 셀 시험 벡터를 촉진 하기 위하여 5 분 마다 반전에 대 한 37 ° C에 튜브를 전송 합니다.</li>
	<li>셀 4 분 Resuspend 셀 펠 릿 얼음에 원하는 농도에서 식 염 수에 4 ° C에서 50 x g에서 원심 준비에서 바인딩되지 않은 모든 벡터의 제거를 보장 하기 위해이 세척을 반복 합니다.</li>
	<li>만약에 가능 하다 면, 생존, 접착, 변환 효율성, 등등 을 위한 확인 (즉, 500000 셀 6에서 잘 당 잘 셀 문화 접시) 세포의 충분 한 aliquots 플레이트 참고: 그것 불가능 자주 특히 당일 절차에 대 한 autotransplantation, 이전에 이러한 매개 변수를 평가 합니다. 예를 들어 여기에 설명 된 절차는 알파-1 antitrypsin 간 특정 발기인, 쉽게 이식 전에 hepatocytes에서 assayable는의 통제 된 파 cDNA를 고용. 그러나, 이러한 도금된 셀 변환 (즉, 통해 서 부 럽)의 성공 또는 절차의 일반적인 성공의 예측 지표로 서는 autotransplantation 후속 분석 될 수 있다.</li>
</ol>5. hepatocyte 이식
<ol><li>2 ~ 5 MHz 변환기를 사용 하 여 초음파를 통해 문맥을 식별 합니다. 18 G, 그것의 분기를 인접 주요 포털 정 맥 쪽으로 5 인치 바늘을 직접.</li>
	<li>1 x 109 hepatocytes (약 10 g) 주사기를 사용 하 여 최대의 느린 수동 주입을 시작 합니다. 모니터 포털 압력 주입 카 테 터를 사용 하 여 이식 하는 동안.<ol>
<li>포털 압력 증가 기준선 위에 8 mmHg, 주입을 일시 중지 하 고 초기 수준으로 반환 하는 압력을 허용 합니다.</li>
		<li>포털 압력 일시 중지 후 기준선을 반환 하지 않는 경우 5 분 동안 주입 주입을 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이식 및 카 테 터 제거 후 thrombotic 이벤트의 존재에 대 한 평가 문맥에서 흐름을 전달 하는 초음파를 사용 합니다.</li>
</ol>6. 수술 후 회복 및 유지 보수
<ol><li>적절 한 복구 영역에 따라 이동한 동물 완전히 보 행, 필요에 따라 15-30 분 마다 따뜻한 담요로 체온 유지 또는 공기가 열 랩 심 박수, 산소 포화 온도 모니터링 될 때까지 관찰 합니다.</li>
	<li>Inappetence의 복싱으로 발생할 수 있는 위 궤의 기회를 줄이기 위해 매일 (의 끝을 통해 연구) 입으로 1 mg/kg omeprazole를 관리 합니다.</li>
	<li>Postoperatively, 동물 실험실 및 수의 직원에 의해 주의깊게 감시 하 고 일반적으로 수술 buprenorphine 복용량에서 별도 추가 진통제를 필요로 하지 않습니다.  고통/통증의 표시 된 수의학 케어 직원 (절 개를 지키고, inappetence, 혼 수)에 의해 관찰 된다, 항 염증 제 대리인 (즉, Carprofen) 관리할 수 있습니다.</li>
</ol>7입니다. 조리법
<ol><li>이 프로토콜에서 사용 하는 조리법에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>HWM</td>
			<td>시 약</td>
			<td>난 (10 배) 당</td>
			<td>제 2 차 당 (10 배)</td>
		</tr>
<tr>
<td>윌리엄스는-E 분말 (g/L)</td>
			<td>10.8</td>
			<td>NaCl (g/L)</td>
			<td>83</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (g/L)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>KCl (g/L)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>24</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep (100 x, mL/L)</td>
			<td>10</td>
			<td>EGTA (g/L)</td>
			<td>9.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>소 태아 혈 청 (mL/L)</td>
			<td>100</td>
			<td>N-아 세 틸-L-시스테인</td>
			<td rowspan="2">8</td>
			<td rowspan="2">8</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH</td>
			<td>7.3</td>
			<td>(N-A-C, g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>리세 (mL/L)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CaCl2 2 H2O (g/L)</td>
			<td>-</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>콜라 D (mg/mL)</td>
			<td>-</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 간 섹션에서 Hepatocyte 절연에 사용 되는 솔루션에 대 한 조리법.

<ol><li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening%3A+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li>
<li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li>
<li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism%3A+advancing+towards+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43(2017).</li>
<li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism%3A+progress+towards+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Italian+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2(2008).</li>
<li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li>
<li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li>
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<li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li>
<li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li>
<li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663(2013).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 보고서에는 비보 전 헌 유전자 치료 접근을 돼지 모델 HT-1의 치료를 설명 합니다. 그것은 교정 transgene 들고 lenti 바이러스 비보 전 hepatocyte 고립과 격리 hepatocytes의 변환 다음 부분 hepatectomy 포함. 수정된 헌 hepatocytes는 다음 다시 문맥8파 결핍 동물에 이식 됩니다. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다, 하지만 파 불충분 한 돼지는 매우 선택적 환경 수정된 셀13,15의 독특한 이점이 있다. 이 메서드는 HT-1에 대 한 효과적인 치료로 약 복용된 동물 쇼 화학적 측정 된 대사 산물과 염증 성 간 생체, 변과 HCC의 예방 및 초기 섬유 증 본의 완전 한 반전의 정규화 NTBC 독립적인 성장 NTBC와 사이클링. 또한, 최근 연구와 관련 된 광범위 한 조직...

선된 천 성 간 물질 대사의 총칭 1에 800 생존 출생1만큼 영향을 미치는 유전 질환의 가족입니다. 이 질병의 많은 단일 유전자 결함2 고 hepatocytes3의 충분 한 수에 영향을 받는 유전자의 단일 수정 된 복사본을 도입 하 여 기능적으로 치료 될 수 있습니다. 수정 해야 hepatocytes의 실제 비율 질병4 에 의해 변화 하 고 인코딩, 단백질 세포질 대 예 배설된 단백질의 특성에 크게 좌우 됩니다. 대부분의 경우, 신진 대사 질환에 대 한 어떤 치료의 효능은 순환에서 자주 사용할 수 있는 바이오 마커의 존재를 통해 쉽게 분석 됩니다.
HT-1은 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파)5결함, 티로신 물질 대사6의 마지막 효소 단계에서 결과 간 대사의 선천적인된 오류가. 파 결핍 리드 빌드 급성 간 기능 장애 및 사망을 일으킬 수 있습니다 또는 질병의 만성 모양에서 경 변 증 및 간세포 암 하면 간 독성 대사 산물의. 질병은 임상 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), 효소 상류 파의 티로신 물질 대사에서의 작은 분자 억제 물의 행정에 의해 관리 됩니다. Hepatocytes의도 적은 수의 성공적인 교정 결국 모두 크고 작은 동물 모델에 수정 된 셀의 전체 간 repopulation에 발생 질병 유전자 치료 방법, 테스트할 수 있는 이상적인 환경을 제공 합니다. 7 , 8.이 때문에 발생 합니다 수정 세포는 깊은 생존 이점을 독성 대사 산물의 축적으로 인해 수정 되지 않은 셀에서 후자. 수정 되지 않은 hepatocytes의 손실 수 있습니다 수정된 hepatocytes의 선택적 확장 간 재생 용량와 일치. 치료는 쉽게 순환 이식 다음 티로신 및 succinylacetone 수준에 감소를 측정 하 여 다음 수 있습니다.
부분 hepatectomy 포함, 절차의 침략 적인 본질을 정당화 하기 위해이 방법의 목표 내구성 치료 해야 합니다. 따라서, 복제 무능 한 lentiviral 벡터 때문에 그들은 안정적으로 hepatocyte 게놈9를 통합할 것 이다 데 사용 됩니다. 간으로 모든 딸 세포에는 수정 된 유전자의 배달 보장 성장 하 고 확장 합니다 수정 되지 않은 세포의 급속 한 손실 대체. 이 주로 유사 분열10 주만 치료의 어떤 효력 든 지 그로 인하여 잃는 동안 단일 딸 세포에 전달 될 수 있는 episomes로 존재 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터에 유리 하다.
문학의 성장 시체 위에 lentivirus11, 관심사의 안전 지원 하지만 차적인 이벤트 환경 제어 생체 외에서 호스트 셀 변환 제한 하 여 완화 됩니다. 이 방법은 수행 되는 문맥을 통해 헌 이식으로 다시 소개 될 hepatocytes에 노출 제한 무료 벡터 적 체계적으로 호스트에 도입 되었습니다.
이 보고서는 수술의 방법 및 절차 ex vivo 유전자 치료 비보 전 을 위한 hepatocytes와 HT-1 돼지8의 치료에 대 한 후속 헌 이식12 를 격리 하는 데 사용에 대해 설명 합니다. 1) 부분 hepatectomy hepatocytes와 호스트의 간 성장 자극의 근원, 2) 삭제 간 뒤에 ex vivo 유전자 보정, 그리고 마지막으로 3)의 재 소개부터에서 hepatocytes의 절연 역할을 포함 하는 전체 프로세스는 수정된 hepatocytes 호스트에 다시. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정, 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다 하지만 파 불충분 한 돼지13 수정된 hepatocytes에 대 한 선택적 환경 활용 해야한다.

<table><tbody><tr><td>2-(2-니트로-4-트리플루오로메틸벤조일)-1,3-시클로헥산디온(NTBC)</td><td>Yecuris</td><td>20-0027</td><td></td></tr><tr><td>12mm 투관침</td><td></td><td>B12STS</td><td></td></tr><tr><td>5mm 투관침</td><td></td><td>B5SHF</td><td></td></tr><tr><td>엔도 수술용 스테이플러 60</td><td>Covidien</td><td>EGIA60AMT</td><td></td></tr><tr><td>엔도 수술용 스테이플러 45</td><td>Covidien</td><td>EGIA45AVM</td><td></td></tr><tr><td>엔도 외과 스테이플러 30</td><td>Covidien</td><td>SIG30AVM</td><td></td></tr><tr><td>Endo 캐치 백</td><td>Covidien</td><td>173050G</td><td></td></tr><tr><td>0 PDS</td><td>Ethicon</td><td>Z340H</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J459H</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J426H</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond</td><td>Ethicon</td><td>DNX12</td><td>멸균 드레싱</td></tr><tr><td>Williams'-E 파우더&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>ME16060P1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>S8875-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>펜/스트렙&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1679-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl (g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (g/L)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>45172</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine</td><td>Oakwood Chemical</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>(N-A-C, g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O (g/L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 D (mg/mL)</td><td>Crescent Chemical</td><td>17456.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC6337</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>Gibco</td><td>PHG0314</td><td></td></tr></tbody></table>

돼지에서 자가 이식 hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

유전자 치료는 치료 많은 선된 천 성 간 물질 대사의 이상적인 선택 이다. Ex vivo, lentiviral 벡터 사용 되었습니다 성공적으로 인 간에, 많은 조 혈 질환의 치료에 그들의 사용은 주인 게놈으로 통합 하는 벡터의 능력으로 인해 안정적인 transgene 식으로. 이 메서드는 유전 tyrosinemia 형식의 큰 동물 모델에 ex vivo 유전자 치료 hepatocytes의의 응용 프로그램을 보여 줍니다 나. 헌 혈 기증자/받는 동물, 2에서에서 기본 hepatocytes의 1) 절연 이루어져이 프로세스) ex vivo 유전자 배달 hepatocyte 변환 lentiviral 벡터와 포털을 통해 수정된 hepatocytes의 3) 헌 식을 통해 사출 맥락 메서드의 성공 일반적으로 간 절제, 격리 된 셀의 다시 engrafting, 높은 백분율 변환에 대 한 충분 한 실행 가능한 hepatocytes의 격리에 대 한 삭제 견본 취급 주의의 효율적이 고 살 균 제거에 의존 하 고 전체 감염을 방지 하기 위해 무 균 수술 절차입니다. 이 단계에서 기술적인 실패 자가 이식 가능한 불리고 hepatocytes의 낮은 수익률 또는 기증자/받는 사람 동물의 감염 발생 합니다. 인간의 유형 1 유전 tyrosinemia (HT-1)이이 접근에 대 한 선택의 돼지 모델은 이러한 메서드를 고유 하 게 의무가 engraftment 수정된 세포의 심지어 작은 비율 간 repopulation 건강 한 세포는 강력한 기반으로 이어질 것으로 기본 병 hepatocytes에 선택적인 이점입니다. 성장 선택이 모든 표시에 대 한 사실이 되지 않을 것입니다, 하지만이 방법은 다른 표시로 확장을 위한 기초 이며 추가 질병, 간 내에서 모두 해결 하 고 넘어, 동안에이 환경 조작할 수 있습니다. 바이러스 성 벡터와 오프 대상 독성 및 tumorigenicity에 대 한 기회에 대 한 노출 제어.

간 절제 및 자가 이식 개요로 그림 1에 표시 됩니다. 5 돼지 간 절제 수술의 대표적인 일대에 대부분의 수확량 했다 &gt; 1 x 109 hepatocytes 약 80% 생존 (표 2)와 함께 모든 종류의 많은 셀을 제공 하는 조작, 유전자를 포함 하 여 원하는 치료입니다. 각 그 5 돼지 보여 좋은 생존 및 접착, 전형적인 hepatocyte 형태학 46 시간 후에 변환 및 초기 도금 (그림 2)와 준비 hepatocytes의 비 이식 부분의 후속 문화. 이러한 결과 성공적인 준비의 대표 동안 가난한 결과 셀, 생존, 또는 최소한의 준수는 단층에 셀의 낮은 수와 함께 표시 될 것 이다.
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이 프로토콜은 돼지 hepatocyte 격리와 ex vivo 유전자 배달 모델 autologous 세포 이식 통해 대사 질환의 치료를 설명 하는 위한 것입니다. 이 특정 모델은 성공적인 치료를 선호 하는 독특한 장점, 있지만 응용 프로그램은 추가 질병 징후를 해결 하기 위해 관련 기초 이다.

돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

간에서 신진 대사의 태아 오류의 치료를위한 Ex 생체 유전자 치료 및 자가 세포 이식은 이러한 장애에 대한 치료에 중요한 대안이다. 그리고 우리는 이러한 장애를 치료 할뿐만 아니라 치료 결과를 달성하는 데 필요한 바이오 매스를 알아낼 수 있습니다. 이 접근은 또한 면역 억제의 중요한 결과 및 치료의 다른 모형을 가진 그밖 결과를 피합니다.현재 문맥에서, 우리는 유전 티로시혈증 타입 1을 취급하기 위하여 이 접근법을 사용하고 있습니다. 그러나, 아이디어는이 최소한의 변경으로 다른 간 질환의 무리를 치료하는 플랫폼 접근 방식이 될 것입니다. 이식을 위해 실행 가능한 간세포를 얻는 데 필수적인 관류의 효율성을 시각화할 때 약간의 가변성이 있기 때문에 이 기술을 시각화할 수 있어야 합니다.로버트 카이저와 조셉 릴레가드에 의해 수행 수술. 세포 격리는 지지 두, 브루스 아미오트에 의해 수행. UAU 세포 정화 및 세포의 전 생체 변환은 케이틀린 반리스에 의해 수행되었다.동물과 OR 준비의 준비는 카리 앨런과 로리 힐린에 의해 수행되었다. 초기 포트 사이트 항목을 수행하려면 최대 3 개월 된 대형 흰색 농장 돼지의 마취에 열려있는 Hasson 기술을 수행하십시오. 복강이 보이는 복강에 12mm 트로카를 도입합니다.트로카가 제자리에 있을 때, 진입 항을 통해 5밀리미터 30도 범위를 통과하고 이산화탄소로 복부를 15밀리미터의 수은으로 부수시게 합니다. 복강경 카메라로 직접 시각화하는 과정에서 2개의 5mm 포트를 추가로 배치하여 간 왼쪽 측면 엽에 삼각측량합니다. 그리고 하나의 새로운 포트에 복강경을 배치합니다.내측 및 왼쪽 측면 세그먼트를 분리하는 왼쪽 엽의 주요 균열 지점에서 간 왼쪽 측면 세그먼트를 식별합니다. 그리고 외과 스테이플러를 사용하여 혈관 구조와 이 균열을 따라 간 정맥을 확보하십시오. 순차적 발사 및 60, 45 또는 30mm 길이의 혈관 하중을 사용하여이 균열을 통해 parenchyma를 경유하십시오.절제술이 완료되면, 적절한 hemostasis를 보장하고 내시경 손아그및 내시경 조직 검색 가방을 사용하여 간 섹션을 검색하기 위해 남은 간을 평가합니다. 이제 포트를 제거하고 중간 선 근막에 대해 중단된 크기 0 봉합사를 사용합니다. 깊은 진피 층을 위한 2-0 봉합사.그리고 피하 층을 위한 4-0 봉합사를 실행하여, 3층에서 12밀리미터 포트 절개를 닫는다. 그런 다음 2-0 봉합사로 한 층에서 5mm

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

종양 용해성 바이러스 요법은 간세포 암종(HCC) 치료를 위한 새로운 치료법으로 개발 중입니다.  여기에서는 종양 용해성 바이러스의 간 동맥 투여를 통한 간세포암의 국소 치료 방법을 설명합니다.

쥐에서 동소 이식 간세포 암의 국소 치료에 대한 종양 살상 바이러스의 간동맥 관리

탈세포화된 쥐 간의 재세포화된 세포외 기질은 바이러스 또는 바이러스 벡터의 분포 및 전이유전자 발현을 연구하기 위해 인간화된 3차원 생체 외 모델로 사용할 수 있습니다.

인간의 간세포 암 세포주 인 HepG2와 3 차원 간 모델 다시 채워에서 바이러스 성 벡터의 연구

유체역학 꼬리 정 맥 주입 transposon 기반 통합 벡터의 수 murine hepatocytes의 안정 되어 있는 transfection vivo에서. 여기, 우리는 단일 transgene의 장기 제정 식 또는 결합 된 제정 및 doxycycline 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 간에서 미르 shRNA 있도록 transfection 시스템을 위한 실용적인 프로토콜 제시.

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

우리는 murine 모델에 주입의 정 맥 및 양수 내 노선을 통해는 utero에 이식 (IUT)을 수행 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 독특한 면역 관용 태아 환경에 셀, 바이러스 성 벡터, 및 다른 물질을 소개 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

이 프로토콜의 목표 nonhuman 영장류 CD34 분리 하는+ 세포 액된 골, 유전자-수정 lentiviral 벡터와이 셀 하 고 주입 헌 호스트에 대 한 제품을 준비에서. 총 프로토콜 길이 약 48 h입니다.

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

우리는 돼지 이종성 심장 이식 모델에서 전체 심장 동종이식편에 치료제를 전달하기 위한 규범발열 ex vivo sanguinous perfusion system을 활용하기 위한 프로토콜을 제시한다.

심장 동종이식편에 치료제를 전달하기 위한 돼지 이질성 심장 이식 프로토콜

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

이 프로토콜에서는 생착 중 정맥 - 정맥 바이 패스를 사용하지 않고 20 시간 동안 기증자 장기를 정적 냉장 보관 한 후 돼지 동종 간 이식 모델을 설명합니다. 이 접근법은 무간기를 최소화하고 정교한 부피 및 혈압 강하제 관리와 함께 단순화 된 수술 기술을 사용합니다.

확장 기준 기증자 모델로서의 정맥 우회술이 없는 돼지 간 이식

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

이 프로토콜은 AAV8 전달 small hairpin RNA의 intrasplenic injection이 어떻게 문맥 주사와 동일한 유전자 knockdown 효율을 간에서 달성하는지 설명하며, 이는 수술 전후 및 수술 후 사망률과 합병증이 훨씬 낮은 더 간단한 절차를 나타냅니다.

아데노 관련 바이러스 혈청형 8(AAV8)로 전달되는 작은 헤어핀 RNA의 비장내 주입을 통한 간의 효율적인 유전자 녹다운

학습하세요 돼지 간세포를 이용한 ex vivo 유전자 치료와 자가 이식 기법으로 유전성 티로시네미아 1형을 치료하는 방법입니다. 이 기술은 면역억제 위험을 줄이고 다양한 간 질환 치료에 적용할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료

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