Name: 대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 성인 쥐 척수에서 고품질 핵을 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱을 수행하는 방법을. Dounce 균질화기와 기계적 용해를 활용한 이 기술은 뇌신경과학 및 질병 연구에서 유전자 발현 프로파일 분석에 필수적입니다.

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이 작품은 NINDS 교내 프로그램에 의해 지원 되었다 (1 지아 NS003153 02) 및 NIDCD (1 지아 DC000059 18). 우리는 L. 리 및 그들의 기술 지원 및 유용한 토론, C.I. Dobrott C. Kathe 원고를 검토 하기 위한 감사 합니다.

모든 동물 일 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었다. 샘플은 남성과 여성의 ICR/CD-1 야생-타입 마우스, 8 사이 균형 그리고 12 주 오래 된, 모든 실험을 위해 사용 되었다. 마우스 로컬 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 되어야 합니다.
1입니다. 준비 재료 및 버퍼의
<ol><li>모든 버퍼 사용의 날을 준비 하 고 미리 얼음에 진정 ( 표 1참조).<ol>
<li>세제-기계 세포를 사용 하 여 세제 세포의 용 해 버퍼 (샘플 당 > 500 μ), 낮은 자당 버퍼 (> 6 mL 샘플 당), 자당 밀도 버퍼 (> 견본 당 12.5 mL), 및 물의 resuspension 솔루션 (> 1 mL)을 준비.</li>
		<li>소형 기계 세포를 사용 하는 경우 준비 침투성 세포의 용 해 버퍼 (> 5 mL 샘플 당), 히 매체 (> 5 mL 샘플 당), 낮은 자당 버퍼 (> 3 mL 샘플 당), 자당 밀도 버퍼 (> 견본 당 12.5 mL), 및 물의 resuspension 솔루션 (> 1 mL).</li>
		<li>그냥 프로토콜을 시작 하기 전에 dithiothreitol (DTT)의 25 μ 자당 밀도 그라데이션 버퍼의 25 ml DTT의 또 다른 25 μ 낮은 자당 버퍼의 25 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>종이 타 올 또는 단일 핵을 캡처하는 데 사용 되는 미세 채널을 방해할 수 있습니다 벤치 프로텍터에서 섬유 샘플의 오염을 최소화 하기 위해 알루미늄 호 일 해 표면 커버.</li>
	<li>스프레이 해 도구 및 벤치 공간 RNase 오염 솔루션. 또한, RNase 오염 솔루션 Dounce 균질 화기 튜브 (세제 기계 세포 세포의 용 해를 사용 하 여) 하는 경우와 오크 리 지 튜브의 내부를 스프레이. Dounce 및 오크 리 지 튜브 초순, RNase 무료 물으로 씻어.</li>
	<li>미리 모든 컬렉션 튜브 (50 mL 원뿔, 오크 릿지)과 Dounce 균질 화기 튜브 얼음에 침착 해.</li>
	<li>화재 폴란드어 파스퇴르 펫의 시리즈 (소형 기계 세포 세포의 용 해를 사용 하 여) 하는 경우.</li>
</ol>2입니다. 척수의 준비
<ol><li>신선한 조직에 사용 하 여, CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사. 안락사를 다음 샘플에서 머리 오염을 최소화 하기 위해 70% 에탄올과 마우스의 코트 스프레이.</li>
	<li>날카로운 RNase 무료 수술가 위 마우스를 목을 벨. 다음, 부드럽게 복 부 리프팅 집게와 피부와 내부 장기를 노출 하는 신체의 길이 따라 절 개.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 신체 구멍에서 내부 장기를 당겨서 마우스 내장을 들어낸. 영역을 청소 하거나이 오염 물질을 소개 수 있습니다 장기 제거 종이 타 올을 사용 하지 마십시오. L2 및 L3 척추 척추 사이의 척추 열을 잘라가 위를 사용 하 여. 참고: 연습,이 단계는 30 초 미만에서 얻을 수 있습니다.<ol>
<li>척수를 추출 하려면 3 mL 주사기 25 G ¼ 인치 바늘으로 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 적합. 척추 칼럼의 성 례의 끝에 바늘의 끝을 놓습니다. 손가락 두 개를 사용 하 여 바늘의 팁 주위 단단한 물개를 만들고 rostrally 척수를 추출 하는 플런저에 눌러 척추를 꼬집어. 얼음 처럼 차가운 PBS와 페 트리 접시에 척수를 놓습니다.</li>
		<li>이 시점에서 조직 동결-80 ° C에서 저장 하거나 세제-기계 (3 단계) 또는 소형 기계 (4 단계) 세포에 대 한 즉시 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동된 조직를 사용 하 여 드라이 아이스에 조직 유지, 세제-기계 (3 단계) 또는 소형 기계 (4 단계) 세포를 진행 합니다.</li>
</ol>3. 세제-기계 세포 세포의 용 해
<ol><li>미리 냉장된 Dounce 균질 화기에서 요 추 척수를 놓고 500 mL 미리 냉장 세제 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 참고: 마우스 요 추 척수는 뜻의 325.5 mg ± 63.9 mg 표준 오차 (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g 조직의 성공적으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5 선 유 봉 ('느슨한' 유 봉)의 다음 5-10 스트로크 유 봉 B의 ('꽉' 유 봉) Dounce. 뇌졸중 사이 세포 솔루션에서 균질 화기 해제 방지 하 고 거품을 소개 하지 마십시오.</li>
	<li>미리 냉장된 50 mL 원뿔 튜브와 낮은 자당 버퍼의 1 mL와 함께 prewet 40 m m 여과기를 놓습니다.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼에서 원유 핵을 포함 하는 Dounce 균질 화기에 낮은 자당 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 2-3 번 pipetting으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>미리 냉장된 50 mL 원뿔 튜브에 40 m m 스 트레이너를 통해 원유 핵 준비를 전달 합니다.</li>
	<li>3 mL 낮은 자당 버퍼 및 세포의 용 해 버퍼의 500 mL를 최종 볼륨을 데리고 40 m m 스 트레이너를 통해 추가로 1 mL 낮은 자당 버퍼를 전달 합니다.</li>
	<li>풀링 같은 원뿔 튜브에 여러 코드를 결합 하는 경우 3.1-3.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 3200 x g에서 샘플을 원심 원심 분리는 완료 되 면는 상쾌한을 가만히 따르다. 5 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>4. 소형 기계 세포 세포의 용 해
<ol><li>조직 문화 접시에 침투성 세포의 용 해 버퍼의 5 mL에 요 추 척수를 놓습니다. 척수, 이등분 다음 봄이 위를 사용 하 여 코드 3-4 m m 조각으로 잘라 봄이 위의 무뚝뚝한 끝을 사용 하지만 말하다 하지 마십시오. 참고: 조직의 50mg-1.5 g 수 성공적으로 사용.</li>
	<li>소용돌이 치는 2-3 시간 15 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>침투성 세포의 용 해 버퍼 희석 히 매체의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>10 시간 5 mL 혈 청 학적인 피 펫, 또는 직물의 조각을 모두는 피 펫의 개방을 통해 원활 하 게 이동 될 때까지 조직 triturate</li>
	<li>3 화재 광택 파스퇴르 펫 점차적으로 좁은 직경의 시리즈와 triturate (~ 900-600 m m).<ol>
<li>각 피 펫에 대 한 triturate, 5-15 시간 허용 정착, 상쾌한 천연된 핵 포함의 1-2 mL을 제거 하 고 미리 냉장된 50 mL 원뿔 튜브 40 m m 스 트레이너를 통해 전달 하는 조직.</li>
		<li>작은 크기의 파스퇴르 피 펫으로 분쇄, 후에 homogenate 피 펫 팁을 통해 원활 하 게 흐르는 확인 하십시오. 50 mL 원뿔 튜브에 40 m m 스 트레이너를 통해 나머지 솔루션을 전달 합니다. 주: triturations의 총 수를 조정할 수 있습니다 원하는대로. 마우스 척수의 meninges, 유지 되지만 척수의 모든 보이는 덩어리를 triturate 하는 것이 중요 하다. 40 m 스 트레이너를 통해 나머지 homogenate를 전달 합니다. 분쇄 하는 동안 거품을 소개 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 1000 x g에서 필터링 된 샘플을 원심 원심 분리는 완료 되 면 가만히 따르다 고는 상쾌한 삭제. 5 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>5. 균질 및 자당 밀도 그라데이션
<ol><li>3 단계 또는 4 후 낮은 자당 버퍼의 3 mL를 사용 하 여 펠 릿 resuspend. 부드럽게 펠 릿은 물의 resuspension 촉진 하기 위하여 벽에서 제거 하는 소용돌이 친다. 2 분 동안 얼음에 앉아서는 오크 리 지 튜브에 정지를 전송 샘플을 보자.</li>
	<li>균질 화기를 사용 하 여 15-30 s, 유지 하는 얼음에 샘플에 대 한 낮은 자당 버퍼에 핵을 균질 1 설정. 참고: 사용 15 s 한 요 추 척수 또는 30을 사용 하는 경우 사용 하는 경우 s 풀링된 샘플 또는 전체 척수.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫, 레이어 밀도 레이어를 방해 하는 거품을 만드는 것이 아니라 돌 낮은 자당 버퍼 homogenate 아래 밀도 자당 버퍼의 12.5 mL를 사용 하 여.</li>
	<li>3200 x g 4 ° c.에 20 분에 관을 원심</li>
	<li>원심 분리는 완료 되 면 즉시 터치 모션에 상쾌한을 가만히 따르다. 참고: 낮은 볼륨 및 최종 샘플 청소기를 원하는 경우 삭제 될 수 있습니다 자당 버퍼의 잔여 볼륨 (400 mL 미만)만이 잔여 핵을 포함 하는 볼륨과 핵 수확량을 최대화 하기 위해 보존 될 수 있습니다.</li>
	<li>100 mL-1 mL의 물의 resuspension 솔루션을 사용 하 여 벽에 남은 핵 resuspend. 수 초 '싫은' 세제 기반 준비 남아 하지 마십시오.</li>
	<li>30-35 m m 기 공 크기 스 트레이너를 통해 핵을 필터링 하 고 미리 냉장된 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>핵 핵 10 X 목표 아래 계산 하는 hemocytometer를 사용 하 여 항복을 결정 합니다. 참고: Trypan 블루 핵, 파란색 표시는 시각화를 추가할 수 있습니다. 세포질 파편의 양을 note합니다</li>
	<li>단계 6 또는 7로 이동 합니다.</li>
</ol>6. 대규모 병렬 snRNA 시퀀싱: 학술 플랫폼7
<ol><li>(예를 들어, 드롭-Seq) 대규모 병렬 snRNA 시퀀싱을 수행 방법은 앞에서 설명한 다음 수정7 :4<ol>
<li>ML 당 225 핵의 최종 농도에 핵을 조정 합니다.</li>
		<li>ML 당 250 구슬의 농도에 바코드 비즈를 준비 합니다.</li>
		<li>0.7 %sarkosyl 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다.</li>
		<li>구슬, 핵를 위한 분 당 35 mL 및 석유에 대 한 분 당 200 mL에 대 한 분 당 35 ml의 유량을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 대규모 병렬 snRNA 시퀀싱: 상용 플랫폼26
<ol><li>(예를 들어, 크롬 단일 세포 유전자 식 솔루션) 상용 플랫폼을 사용 하 여 대규모 병렬 snRNA-연속 수행 제품 제조 업체의 지침26 다음과 같은 수정:<ol>
<li>리버스-전사, 다음 추가 PCR 주기 주기에서 핵 세포에 비해 감소 cDNA에 대 한 보상 대상된 셀 복구에 기반 하는 cDNA 증폭에 대 한 계산된 수를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

우리는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 프로토콜의 궁극적인 목표는 다운스트림 transcriptional 분석에 대 한 높은-품질 RNA를 포함 하는 핵을 분리 하는. 우리는 모든 척수에서 세포 유형의 프로필 위해 snRNA-Seq 방법 적응. 처음에, 우리는 전형적인 세포 분리 방법 효과 없었다 단일 셀 RNA 시퀀싱, 척수 신경은 세포 죽음에 특히 취약 발견. 또한, 세포 분리 방법 hundred-fold 몇몇까지 여 다양 한 활동 및 스트레스 반응 유전자의 표정을 유도. 3 , 4 , 16 단일 셀 준비와 관련 된 단점을 감안할 때, 우리와 다른 사용 핵 대안입니다. 16 , 17 , 18 , <sup cla...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

신 경계는 다양 한 형태학, 생화학, 및 electrophysiological 속성을 표시 하는 셀의 이기종 그룹의 구성 됩니다. 대량 RNA 시퀀싱은 다른 조건 하에서 유전자 발현에서 조직 전체의 변화를 결정 하는 데 유용한 동안, 단일 세포 수준에서 transcriptional 변화의 감지를 걸로 하겠습니다. 단일 셀 transcriptional 분석의 최근 발전 기능적인 그룹 분자 그들의 레 퍼 토리를 기반으로 이기종 세포의 분류를 가능 하 게 하 고 했다 최근에 활성화 된 뉴런의 집합을 검색 하는 데도 수 있습니다. 1 , 2 , 3 , 4 지난 10 년 동안, 단일 셀 RNA 시퀀싱 (scRNA-Seq)의 개발은 개별 셀, 셀 형 다양성으로 볼의 유전자 발현의 연구 활성화. 5
대규모 병렬 scRNA-Seq, 같은 확장 가능한 접근의 출현 순서 이질적인 조직, 중앙 신경 시스템의 많은 영역을 포함 한 플랫폼을 제공 하고있다. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 그러나 15 , 단일 세포 분리 방법 세포 죽음 뿐만 아니라 유전자 발현 실험 변경 발생할 수 있습니다. 16 최근 작품 내 생 transcriptional 프로필의 보존 수 있도록 단일 셀 시퀀싱 방법 적응 했다. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 이러한 전략 즉시 이른 유전자 (IEG) 식 다음 감각 자극 또는 동작을 감지 하는 데 특히 적합 했습니다. 3 , 4 미래에,이 전략 또한 사용 될 수 조직 질병 상태 또는 스트레스에 대 한 응답에서 동적인 변화를 공부 하. 이러한 메서드의 단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-Seq) 스트레스 유도 세포 분리를 포함 하지 않는 및 (척수), 같은 조직 분리 하기 어려운 뿐만 아니라 냉동에 사용할 수 있습니다 유망 접근은 조직. 4 , 17 , 18 , 19 이전 핵 격리 방법에서 적응,20,,2122,23,25 snRNA-Seq 일반적으로 활용 하 여 신속한 조직 장애 및 셀 차가운 조건, 원심 분리, 및 세포에서 핵의 분리에서 세포. 4 핵 여러 미세 물방울 캡슐화 플랫폼에서 다운스트림 차세대 시퀀싱에 대 한 격리 수 있습니다. 4 , 7 , 24 , 25 이 메서드는 시간에 순간에 세포의 수천의 transcriptional 활동 현황에 대 한 수 있습니다.
절연 및 시퀀싱, 각각 그들의 자신의 이점 및 불리 하기 전에 세포에서 핵을 방출 하기 위한 여러 전략을 확인 하 고 있습니다. 여기, 우리가 설명 및 다운스트림 대규모 병렬 snRNA-Seq에 대 한 성인 척수에서 핵의 격리 수 있도록 두 개의 프로토콜 비교: 세제 기계 세포 및 소형 기계 세포. 세제-기계 세포 완전 한 조직 장애 및 핵의 높은 최종 수익률을 제공합니다. 소형 기계-세포 조직 장애, 수량 및 최종 핵 수확량의 순도 사이의 균형을 선택 하기 위한 기회를 제공의 제어도 포함 되어 있습니다. 이러한 접근 비교 RNA 수확량, 핵, 그리고 셀 형 프로 파일링 당 유전자의 감지 된 숫자를 제공 하 고 또한 둘 다에 사용할 수 있습니다 성공적으로 snRNA-이

<table><tbody><tr><td>설탕</td><td>Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Crystalgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>시그마 Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>최대 절전 모드 -A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Crystalgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>0.04% BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0.2 U/ &뮤; L RNAse 억제제</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>일회용 면 플러그 붕규산염-유리 파스퇴르 피펫 피셔</td><td>사이언티픽</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>유리 티슈 Dounce (2mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>유리 대형 클리어런스 유봉</td><td>Kimble</td><td>885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>유리 작은 클리어런스 유봉</td><td>Kimble</td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>분산 도구(S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain(0.4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers, 30 &mu; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F15-6 x 100y 고정각 로터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>스테로로지컬 피펫: 5 mL, 10 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes 바코드 비드</td><td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &mu; m)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios 세포 분류기</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>크롬 i7 멀티플렉스 키트, 96 rxns</td><td>10X 유전체학</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>크롬 단일 세포 3' 라이브러리 및 겔 비드 키트 v2, 4 rxns</td><td>10X 유전체학</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>크롬 단일 세포 A 칩 키트, 16 rxns</td><td>10X 유전체학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시(60mm x 15mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

대규모 병렬 단일 핵 rna 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

개별 셀의 유전자 발현 프로 빙 셀 유형과 셀 상태 식별 수 있습니다. 단일 셀 RNA 시퀀싱 transcriptional 프로필 셀, 특히 중추 신 경계와 같은 다른 유형의 조직에서에서의 공부에 대 한 강력한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 분리 방법 단일 셀 시퀀싱에 필요한 실험 변경 유전자 표현과 세포 죽음에 발생할 수 있습니다. 또한, 이러한 방법을 따라서 보관에 대 한 연구 및 바이오-은행 소재를 제한 하는 신선한 조직에 일반적으로 제한 됩니다. 단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-Seq)는 그것은 정확 하 게 세포 유형 식별, 냉동 또는 해리, 어려운 조직의 연구 주어진 transcriptional 연구에 대 한 매력적인 대안 이다 분리 유발 감소 전사입니다. 여기, 선물이 다운스트림 snRNA-이 대 한 핵의 신속한 격리에 대 한 높은 처리 프로토콜 이 메서드는 신선 또는 냉동 척수 샘플에서 핵의 분리를 가능 하 게 하 고 두 대규모 병렬 드롭릿 캡슐화 플랫폼 결합 될 수 있다.

여기, 우리는 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 성인 마우스 요 추 척수에서 핵의 격리를 수행합니다. 프로토콜 관련 세 가지 주요 구성 요소: 조직 장애 및 세포 세포의 용 해, 균질, 고 자당 밀도 원심 분리 (그림 1). 초 이내에, 세제 기계 세포 세포와 조직 파편 (그림 2A표 2) 핵의 많은 수와 원유 핵 준비 나왔고. 15 분 후, 소형 기계 세포 적은 파편, 하지만 또한 적은 핵 (그림 2B표 2) 원유 핵 준비 나왔고. 두 준비는 균질을 받았다 (그림 2C 및 D) 및 자당 농도 0.04 %BSA PBS에서 물의 resu...

여기, 선물이 빠르게 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 조직에서 높은-품질 핵을 분리 하는 프로토콜. 우리는 세제-기계 및 소형 기계 조직 장애 및 셀 세포 옵션을 둘 다 핵의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다를 포함 합니다.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

단세포 RNA 시퀀싱은 특히 중추 신경계와 같은 이질조직에서 세포의 전사 프로파일을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 RNA 염기서열분석용 핵을 격리하는 방법을 제공한다. 세포 대신 핵을 사용하여, 이 방법은 동결된 조직뿐만 아니라, 하기 어려운 조직에 적용될 수 있습니다.더욱이, 이 방법은 질병 또는 상해 다음 세포에 있는 세포 모형 특이적 변경을 연구하기 위하여 적용될 수 있다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 안락사로 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 내부 장기를 노출하기 위해 신체의 길이를 따라 절개를합니다.집게를 사용하여 신체 구멍에서 내부 장기를 당겨 마우스를 eviscerate. 이 오염 물질을 도입 할 수 있기 때문에, 지역을 청소하거나 장기를 제거하기 위해 종이 타월을 사용하지 마십시오. 가위를 사용하여 L2와 L3 척추 척추 사이의 척추 컬럼을 잘라냅니다.척수를 배출하려면 25 게이지 1/4 인치 바늘로 얼음 차가운 PBS가 들어있는 3 밀리리터 주사기를 착용하십시오. 바늘 끝을 척추 기둥의 성추끝에 놓습니다. 두 손가락을 사용하여 척추를 꼬집어 바늘 끝 주위에 단단한 씰을 만들고 플런저를 눌러 척수를 roste없이 배출합니다.추한 PBS를 곁들인 페트리 접시에 척수를 놓습니다. 코드의 요추 부분만 필요한 경우 척수의 성추와 흉부 부분을 다듬습니다. 이 시점에서, 조직을 동결하고 영하 80도에서 저장하거나, 여기에 설명된 바와 같이 세제 기계식 세포 용해 또는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 저혈압 기계적 용해에 즉시 사용한다.세제 기계식 세포 용액을 결정하기 위해 요추 척수를 미리 냉각된 둔균질제에 넣고 500마이크로리터의 미리 냉장 된 세제 용액 버퍼를 추가하십시오. 느슨한 유봉의 5 스트로크로 두드리고, A, 그리고 5 ~ 10 스트로크의 단단한 유봉, B.피하기 뇌졸중 사이에 용액의 외부 균질화제를 들어 올리고, 거품을 도입하지 마십시오. 이제 40미크론 스트레이너를 미리 냉각된 50밀리리터 원뿔 튜브 위에 놓고 저당 버퍼 1밀리리터로 미리 젖습니다.리시스 버퍼에 원유 핵을 함유한 Dounce 균질화제에 저자산완충제 1밀리리터를 넣고 2~3회 배로 하여 부드럽게 섞는다. 40 미크로른 여과기를 통해 조핵 준비를 미리 냉각된 50 밀리리터 원추형 튜브에 전달합니다. 40 미크론 스트레이너 위에 1밀리리터 저자당 버퍼를 추가로 전달하여 최종 부피를 저자산 완충제의 3밀리리터와 500 마이크로리터의 용액 버퍼에 전달합니다.여러 코드를 결합하고 동일한 원전 튜브에서 냉각하는 경우 이러한 단계를 반복합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 3200회 G로 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상체를 감소시다.우리는 낮은 자당 버퍼의 세 밀리리터를 사용하여 팔레트를 일시 중단합니다. 부드럽게 소용돌이하여 벽에서 펠릿을 제거하여 재서스펜션을 용이하게 합니다. 샘플을 2분 동안 얼음 위에 앉은 후 서스펜션을 오크 리지 튜브로 옮기습니다.균질화제를 사용하여 15~30초 동안 저당버퍼에서 핵을 균질화하여 얼음 위에 샘플을 유지합니다. 그런 다음, 밀도 자당 버퍼의 12.5 밀리리터를 층으로 서학적 파이펫을 사용, 낮은 자당 버퍼 homogenate 아래, 밀도 층을 방해 거품을 만들지 않도록주의. 3200회 G의 튜브를 원심분리하여 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.원심분리가 완료되면 즉시 상체를 깜박이는 동작으로 디게팅합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 즉시 원심분리기에서 오크 리지 튜브를 제거하고 신속하게 상퍼를 데칭하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 100 마이크로리터를 1밀리리터에 사용하여 정지용 용액을 사용하여 벽에 남아 있는 핵을 중단합니다.세제 기반 준비로 남아있는 myelin 찡그린 얼굴을 피하십시오. 이러한 단계를 신속하게 수행하지 못하면 다운스트림 단일 핵 RNA 시퀀싱을 방해할 수 있는 과도한 세포 이물질 또는 myelin을 사용하여 핵 을 준비할 수 있습니다. 30 내지 35 미크론 모공 크기의 여과기를 통해 핵을 걸러내고 미리 차가운 튜브에서 수집합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 단일 핵 RNA 시퀀싱을 진행하기 전에 혈류계를 사용하여 10 x 목표하에서 핵을 계산하는 핵 수율을 결정한다. 세제 기계적 용해 프로토콜을 사용하여 분리된 핵의 밝은 필드 및 상피성 이미지는 10 x로 도시된다. 이러한 핵은 편견없는 방식으로 분리되어 단일 세포의 수준에서 내인성 유전자 발현 프로파일의 연구를 허용합니다.여기에 도시된, 마우스 요추 척수로부터, 대규모 병렬 액적 캡슐화 플랫폼을 사용하여 단일 핵 RNA 시퀀싱의 대표적인 tSNE 플롯이다. 신선하거나 냉동 된 조직에서 분리 된 핵은 상업 및 학술 플랫폼 모두에서 시퀀싱에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 척수와 같은 어려운 조직을 사용하여 단세포 수준에서 전사 프로파일을 탐구할 수 있게 합니다, 또는 biobank 물질과 같은 동결된 조직조차.이 절차를 시도하는 동안, 안락사와 세포 리시스 사이의 시간을 줄이는 것이 중요합니다. 또한 세포 리시스에서 재발에 이르는 솔루션에 도입된 거품을 최소화하고 조심스럽게 애완 동물 핵을 구입하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 핵은 특정 세포 유형을 격리하기 위해 팩 선별과 같은 대체 응용 분야에 사용될 수 있다.

isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

종양 내 이질성은 진모를 포함한 종양의 내재된 특징입니다. 우리는 단일 핵 RNA 및 ATAC 염기서열 분석 연구를 위한 신선한 동결 신경교종 조직에서 단 하나 핵을 격리하기 위하여 완충과 그라데이션 원심분리의 조합을 이용하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다.

단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq를 위한 신선한 냉동 뇌 종양에서 핵 절연

여기에서 우리는 수질 신장 세포 유형의 표현을 개선하고 효소 조직 해리로 인한 유전자 발현 아티팩트를 방지하는 냉동 마우스 신장에서 고품질 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

이 프로토콜은 우수한 자궁경부 및 성상 신경절, 세포 해리, 동결보존, 핵 분리 및 해시태그 바코딩을 포함하는 단일 핵 시퀀싱을 위한 상세하고 낮은 입력 샘플 준비를 설명합니다.

단일 핵 RNA 시퀀싱을 위한 마우스 교감신경 신경절의 바코드된 항체를 사용한 저입력 핵 분리 및 멀티플렉싱

여기에서는 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 및 관절 다중오믹스(RNA-seq 및 ATAC-seq)에 대해 급속 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

이 연구는 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 고품질 핵을 분리하는 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜을 설명합니다.

단일 핵 염기서열분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 단일 핵을 분리하기 위한 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜

이 프로토콜은 조직 해리 조건, 단일 세포 현탁액의 동결 보존 및 분리된 핵 평가에 대한 권장 사항을 포함하여 10x Genomics 플랫폼을 사용하여 다중 종양 시퀀싱을 위해 고형 종양 검체에서 핵을 분리하는 데 신뢰할 수 있고 최적화된 접근 방식을 제공합니다.

Multiome Sequencing을 위한 신선 및 냉동 고형 종양 검체에서 최적화된 핵 분리

근육 간 지방 조직(IMAT)의 생물학은 인체 조직의 접근성이 제한되어 있기 때문에 대부분 탐구되지 않았습니다. 여기에서는 이 고유한 지방 저장소의 세포 구성을 식별하기 위해 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위한 냉동 인간 IMAT의 핵 분리 및 라이브러리 준비에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

인간 근육 간 지방 조직에서 핵 분리 및 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열분석

배우세요 성인 쥐 척수에서 고품질 핵을 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱을 수행하는 방법을. Dounce 균질화기와 기계적 용해를 활용한 이 기술은 뇌신경과학 및 질병 연구에서 유전자 발현 프로파일 분석에 필수적입니다.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

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