Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

내 실험실은 유방암과 폐암에서 하마 통로의 역할을 연구하고있다, 최근에, 우리는 하마 신호 활동을 모니터링하는 새로운 바이오 센서를 개발했다. 이 방법은 하마 통로가 요인에 어떻게 반응하는지 및 다른 신호 경로와 상호 작용하는 방법과 같은 셀룰러 신호 네트워크에 대한 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 큰 감도이며 많은 수의 샘플을 신속하고 동시에 처리할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 시험관 내 및 생체 내 하마 신호 경로의 조절기를 조사하기 위해 기본 및 번역 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 우선, DH5-알파 박테리아 액체 배양에서 신선한 미니 준비 LATS-BS 플라스미드. 트랜스펙트 1시간 전에 플레이트에서 배지를 흡인하고 각 웰에 500 마이크로리터의 성장 매체를 추가합니다.

한 가지 중요한 점은 LATS 바이오센서가 최대의 발현과 활동을 얻기 위해 신선하게 준비되어야 한다는 것입니다. 또한, 항상 하마 경로의 업스트림 레귤레이터를 사용하는 것이 좋습니다, 같은 MSD등, luciferase 분석기를 수행 할 때 긍정적 인 제어로. 이 후 세포를 인큐베이터로 되돌리게 합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이, 액션 A, DNA 용액 및 용액 B, 희석된 폴리머 기반 형질 방출 시약을 준비한다. 그 후 즉시 솔루션 B를 솔루션 A에 추가하고 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞습니다. 실온에서 15분 동안 샘플을 배양하여 형질 복합체가 형성되도록 합니다.

그런 다음 부드러운 소용돌이와 접시의 각 우물에 드롭 현명한 경질 복합체의 총 볼륨을 추가합니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, 트랜스페션 복합체가 포함된 미디어를 제거하고 신선한 완전한 매체로 대체합니다.

그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 하루 더 배양합니다. 증류수로 적량의 5배 지속효과 리시스 버퍼를 희석시다. 그런 다음 접시에서 미디어를 완전히 흡인시합니다.

각 웰에 PBS의 1 밀리리터를 추가하고, 분리 된 세포와 잔류 성장 매체를 제거하기 위해 부드럽게 접시를 소용돌이. 그런 다음 PBS를 완전히 흡인시합니다. 다음으로 각 웰에 1xPLB250 마이크로리터를 추가합니다.

배양판을 15분 동안 흔들플랫폼에 배치하여 PLB로 셀 모노레이어의 커버리지를 보장합니다. 그 후, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 lysate를 전송합니다. 80°C의 저장온도에서 LAR-2를 제거하고 실온에 상평합니다.

그런 다음 적절한 양의 에세이를 위해 Renilla 검출 시약을 준비하십시오. Renilla 검출 시약을 50배 기판과 버퍼에 추가합니다. 다음으로, 각 세포의 10 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브로 분배합니다.

그런 다음 2초 사전 측정 지연을 수행하기 위해 광미계를 프로그래밍한 다음 10초 측정 기간을 수행합니다. 조심스럽게, LAR-2 시약의 20 마이크로 리터를 하나의 튜브로 옮기고, 빠르게 위아래로 파이펫을 섞어 넣습니다. 그런 다음 즉시 튜브를 발광계에 넣고 판독을 시작합니다.

판독 후, 광미계에서 샘플 튜브를 제거하고, 렌닐라 시약의 20 마이크로 리터를 추가하고, 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 그런 다음 샘플을 발광계에 넣고 다음 판독을 시작합니다. 첫째, 텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이 HEK293 광고세포배양, 분리, 카운트 및 플레이트.

그런 다음, 트랜스퍼션 1시간 전에 접시에서 미디어를 흡인하고 5밀리리터의 신선한 완전한 성장 매체로 대체하십시오. 마지막으로, 액솔루션 A에 희석된 용액 B를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 그런 다음, 샘플을 15분 동안 실온에서 배양한 후 경질하면서 플레이트에 십부전 복합체의 총 부피를 첨가합니다.

섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, 트립시니화하고 세포를 계산합니다. 플레이트 10, 000 ~ 20, 000 셀은 96웰 플레이트의 각 웰내로, 우물당 100 마이크로리터의 총 부피로 한다.

이 후, 하루 더 세포를 배양. 루시파라아제를 수행하기 1~4시간 전에 하마 통로를 조절할 수 있는 에이전트를 추가하여, 최종 농도인 10 마이크로몰러를 잘 한다. 다음으로, 세포에서 미디어를 완전히 흡인하고 PBS의 100 마이크로 리터로 각각의 우물에서 세포를 씻는다.

그런 다음 각 웰에 20 마이크로리터의 PLB를 추가합니다. 15분 동안 흔들리는 플랫폼에 문화판을 놓습니다. 그런 다음, LAR-2 시약 20 마이크로리터를 플레이트의 각 웰로 옮기고 파이펫을 위아래로 혼합합니다.

이 직후 플레이트 를 읽는 광미계에 접시를 놓고 읽기를 시작합니다. 이 프로토콜의 첫 번째 부분에서 LATS-BS는 LATS 키나아제 활동에 미치는 영향을 평가하기 위해 다른 유전자와 결합되었습니다. 두 번째 프로토콜에서 LATS-BS는 HEK293-AD로 변형되었고 세포는 96웰 플레이트로 전달되었습니다.

40 회광 후, 세포는 하마 신호의 다른 알려진 작은 분자 조절으로 처리되었다, 루시파아제 분석다음. 이러한 연구 결과의 해석을 해석할 때, 단백질과 약물 치료가 바이오 센서 활동에 영향을 미치는 피드백 경로를 활성화할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 후보자와 하마 신호 경로 사이의 관계를 확인하기 위해 추가 실험이 필요합니다.

이 절차에 따라 양적 실시간 PCR 또는 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 사용하여 LATS 키나아제 활동에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 많은 생물학 및 생화학 프로세스에 있는 LATS 키나아제와 하마 신호 통로의 역학 그리고 활동을 탐구하는 암 생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 스크리닝을 위한 약이 극단적으로 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오, 적절한 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.