Name: CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 배우세요 인간 말초혈액에서 CD4+ T세포 및 순환 T-포licular 보조세포(cTfh) 하위집합을 6색 유세포분석법으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 질병 진행 바이오마커 평가에 활용됩니다.

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작업 전송 블록 끝을 MJA 백혈병 영국에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

혈액 샘플은 일반 과목 (NS)에서 가져온 (n = 12) 한계 영역 림프 종 (MZL) 환자 뿐만 아니라 (n = 7) B-세포 비-Hodgkin의 림프 종 (BNHL) (6 층 환자, 2 lymphoplasmacytic 림프 종 환자와 1 학년 B-세포의 비-Hodgkin의 림프 종 하지 않으면 지정 환자). 환자는 후 부여 하는 데, 장소에서 모든 연구에 대 한 윤리적인 승인을 서 면된 동의 레스터 로얄 실에서 혈액학 클리닉에서 채용 했다. 레스터, 노스 햄프셔와 러 틀 랜드 연구 윤리 위원회 1, 06/Q2501/122 환자 샘플 및 건강 연구 기관 (HRA) NRES 위원회 동부 미들 랜드 더비에 대 한 참조에 의해 윤리적인 승인을 얻은, 14/EM/1176에 대 한 참조 일반 과목입니다.
1. 절연 CD4의+ 전체 말 초 혈액에서 T-세포
<ol><li>K2EDTA 튜브 신선한 말 초 혈액 (2 ~ 15 mL) 표준 venipuncture 및 프로세스 최대 생존을 유지 하기 위해 가능한 한 빨리 가져가 라. 참고: 표준 실험실 개인 보호 장비 (코트, 장갑, 안경)을 사용 하 고 클래스 2 Biosafety 내각에서에서 업무를 수행.</li>
	<li>혈액 및 모든 필요한 시 약 (CD4+ 농축 칵테일, 식 염 2% 태아 둔감 한 혈 청/인산 버퍼 (FBS/PBS), 밀도 그라데이션 미디어, 그리고 동결 매체 경우 셀 cryopreserving) 실내 온도에.</li>
	<li>인간의 CD4의 농축에 대 한 항 체의 상용 칵테일 피 믹스+ T 세포. 시 약의 50 µ L를 사용 하 여 혈액의 각 1 ml. 혈액의 5 ~ 15 ml 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브를 사용 합니다. 참고: 2 ~ 4 mL의 혈액을 사용 하 여, 만약 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에이 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>2%의 동등한 양으로 혼합 희석 FBS/PBS</li>
	<li>
이 희석된 혼합 밀도 그라데이션 미디어 인터페이스를 방해 하지 않도록 고 밀도 그라데이션 중간에 혈액의 확산 방지에 즉시 원심 분리를 천천히 위에 레이어.
	<ol>
<li>혈액의 2 ~ 3 mL, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 혈액의 4 ml 3 mL 밀도 그라데이션 매체의 사용, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 5 ~ 15 mL 혈액에 대 한 밀도 그라데이션 매체의 4 mL를 사용 밀도 그라데이션 매체의 15 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 ° c.에 떨어져 브레이크 1200 x g 20 분에 대 한 계층화 된 혼합물을 원심 참고: 아래 주위 온도 적혈구와 granulocytes 오염 될 수 있습니다. 낮은 속도 CD4 하면+ 실패 격리 프로세스. 종사 하는 휴식을 떠나 셀 생산량을 줄일 것 이다. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여에 어로 졸을 피하기 위해 폐쇄 될 수 있습니다로 터와.</li>
	<li>풍부한 CD4 제거+ 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에서 셀 레이어. 참고: 풍부한 셀 레이어 표준 "버 피 코트" 흰색 흐린 셀, 하지만 CD4만 닮은 것 이다+ 세포는 존재,이 자연스럽 게 작고 더 어려운 볼 수 있을 것입니다.</li>
	<li>추가 2 %FBS / PBS는 CD4에+ 10ml 2%로 두 번 다음 세척의 총 볼륨까지 셀 400 x g 에서 10 분 동안 각 세척 centrifuging 의해 FBS/PBS.</li>
	<li>펠 릿 2%에서 resuspend 셀 셀 번호 및 생존 능력을 결정 하는 중요 한 염료 (trypan blue)로 얼룩진 FBS/PBS 및 수.</li>
	<li>선택적 단계: 5 x 105 매체 (FBS에 10% 디 메 틸 sulfoxide) 1 mL aliquots에 1 x 106 셀에 resuspend. 참고: 일부 표면 마커 수준의 cryo 보전 및 해빙에 의해 변경할 수 있습니다. 그것은, 따라서, 매우 중요 한 모든 샘플 지속적으로 처리 됩니다. 분석 변수에서 차이 최소화 하기 위해 샘플 cryo 보존 하 고이 연구에서 분석에 대 한 일괄 처리 했다.</li>
</ol>2. Cytometry
<ol><li>해 동 cryopreserved CD4+ 37 ° C와 세척 한 번에 미리 따뜻하게 매체 (RPMI 1640 + L-글루타민 보충 10 %FBS 1 x 페니실린-스)에서 물 욕조에 신속 하 게 세포.</li>
	<li>매체, 400 x g 에 5 분 동안 원심 분리기의 9 mL에 셀을 추가 하 고 제거 하는 상쾌한.</li>
	<li>1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 셀 resuspend (50 µ L) 5 x 105 와 1 x 106 세포 사이 사용 하는 각 상태를 테스트할 수 있도록.</li>
	<li>얼룩이 버퍼 셀 혼합 (50 µ L). 참고: 화려한 얼룩 버퍼 두 개 이상의 BV 또는 BUV 얼룩 이러한 염료의 고유한 화학적 특성 때문에 동시에 사용 하는 경우 데이터 분석을 방해할 수 있는 다양 한 얼룩 유물을 방지 합니다. 1%의 50 µ L 단일 또는 흠 없는 조건에서 빛나는 얼룩 버퍼의 50 µ L을 대체 하실 수 있습니다 BSA/PBS.</li>
	<li>(는 "볼륨 사용" 열 에서 표 1)에 의하여 세포에 항 체를 추가 하 고 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.</li>
	<li>1% 셀 두 번 씻어 600 x g 에서 3 분 동안 각 세척 centrifuging 여 BSA/PBS.</li>
	<li>1%에서 resuspend BSA/PBS (400 µ L) 및 교류 cytometry 수집 튜브를 전송.</li>
	<li>소용돌이 흐름 cytometer에서 데이터를 취득 하기 전에 부드럽게 셀:</li>
</ol>3. flow Cytometry 컨트롤 및 설정
<ol><li>흠 없는 샘플을 사용 하 여 설정 포토 다이오드 전압 세포는 명백한 파편과 죽은 세포 (높은 측면 살포 (SSC) 지역 및 낮은 앞으로 분산형 (FSC) 지역 이벤트)16에서 분리 될 수 있다. 단일 사용 하 여 샘플, 스테인드 설정 광 전 증폭 관 (PMT) 전압 긍정적인 형광 있는지 모든 이벤트 감지 규모에 속하는 하는 동안 배경 형광에서 분별 수 있습니다. 참고: 개선은 PMT 전압에 대 한 최적의 해상도 ("최고 2" 방법19)에 대 한 최소 전압을 찾을 어렴풋이 형광 비즈를 사용 하 여 각 PMT에 대 한 CV를 것입니다.</li>
	<li>단일 얼룩을 사용 하 여 캡처 구슬 보상 매트릭스를 생성 하 여 스펙트럼 중첩에 대 한 계정. 상업적으로 이용 가능한 보상 구슬 (60 µ L), 및 부정적인 제어 구슬 (60 µ L) 1%를 추가 BSA/PBS (100 µ L), 및 소용돌이. 참고: 사용 하는 캡처 구슬 호스트 종 및 사용 되는 항 체의 IgG isotype 일치 해야 합니다. 보상 매트릭스 해야 다시 계산 어떤 협동의 로트 번호 변경, 염색 하는 경우 그들은 그들의 방출 스펙트럼 제비 사이에서 상당한 가변성을 표시할 수 있습니다.</li>
	<li>단일 항 (20 µ L) 체와 소용돌이 추가 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 품 어.</li>
	<li>10 분 동안 200 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1%BSA/PBS에서 resuspend (500 µ L) 및 소용돌이.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 수집 소프트웨어에서 지정 된 보상 매트릭스 생성기를 사용 하 여 교류 cytometer와 샘플을 획득 합니다.</li>
	<li>사용 FMO 컨트롤 ≥4 색상16를 사용 하 여 실험에 배경 형광의 주요 원천입니다, 염료 유출에 대 한 계정에 긍정적인 마커 형광에 대 한 빌 게이츠의 위치를 안내 합니다. 따라 하지만 각 조건에 대해 3 단계에서에서 설명한 대로 프로토콜 일반 세포 표면 얼룩이 하나 얼룩 단계에서 fluorophores의 생략 (CD45RA 생략 하는 곳 또한 생략 라이브/죽은 얼룩). 각 조건에 대 한 100000 세포를 획득 합니다.</li>
	<li>셀의 ≤0.5 %에서 게이트 양성을 설정 합니다. FMO 컨트롤의 그림 예 그림 2 를 참조 하십시오.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>매우 작은 파편을 제외 하는 FSC 매개 변수에 5000 단위의 임계값을 설정할 흐름 cytometer 수집 소프트웨어를 사용 합니다.</li>
	<li>10000 cTfh 세포를 중지 게이트를 사용 (CD4+ CD45RA- CXCR5+). 참고: 개별 사용자는 10000 이상 세포를 수집할 수 있습니다. 이 숫자는 의미 있는 결과 컬렉션에 대 한 시간을 제공 하기 위해 충분 한 세포를 수집 사이 타협 이었다.</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / SSC-지역 점 플롯, 파편을 제외 하는 동안 세포의 인구를 선택 하는 타원 또는 다각형 게이트 그리고 명백 하 게 죽은 세포 (높은 SSC-지역 및 낮은 FSC-지역 이벤트).</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / FSC 폭 점 플롯, 다각형을 그리기 게이트 남자 (남자는 단일 셀에 비슷한 폭 하지만 증가 지역)을 제외 하는 동안 단일 셀을 선택.</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / CD45RA 및 생존 표식 점 플롯, 라이브, CD45RA 선택 사각형 게이트 그릴- 셀 (이 표식에 대 한 낮은 형광으로).</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / CD4 점 플롯, CD4 선택 사각형 게이트 그릴+ 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).</li>
	<li>c d 4를 사용 하 여 CXCR5 점 플롯, / CXCR5 선택 사각형 게이트 그릴+ (즉, cTfh) 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).</li>
	<li>CXCR3을 사용 하 여 / CCR6 점 줄거리, 장소 쿼드로 cTfh1, cTfh 세포를 세분 하 게이트 2와 17 셀 (셀 및 로우 각 표식에 대 한). 참고: 셀 형 CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ 는 가난 하 게 특징. 우리가 이러한 셀 참조 cTfh1/1718 로 때문에 기존의 헬퍼 T 세포 (CD4+ CXCR5-)는 Th1과 Th17 쇼 표현의 CXCR3와 CCR6 사이 전환 하 고 cTfh1/1719로 설명 되었습니다.</li>
	<li>범위 도구를 사용 하 여 cTfh 세포를 세분 하는 PD 1 히스토그램을 사용 하 여 (또는 경우, 개별 cTfh1 2, 17 또는 1/17 하위 선호) PD-1-/ + 또는 안녕 인구. 참고: PD-1+ 와 PD-1안녕하세요 의 차이 문학에서 잘 정의 되지 않습니다. 임계값은 선의의 Tfh 인간의 편도 선 림프 구 정지 같은 항 체 패널 cytometry 사용 하 여 검색 하는 데 필요한 같은 PD 1 강도로 설정 했다. 또는, PD1안녕하세요 셀만 ICOS+는 ICOS에 대 한 마커 항 체 패널에 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 분석 주변 혈액 cTfh 셀, 지금까지 문학에서 확인 된 모든 관련 하위 집합의 검색을 활성화 하 간단 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 혈액 샘플 얻어질 수 있다 쉽고 효율적으로 표준 외래 환자 진료소와 직렬 샘플의 일부 임상 데이터와 동시에 수집 될 수 있습니다. 차례 차례로, 질병의 진행 이나 치료에 대 한 생체로 cTfh 하위 집합을 평가 하는 예비 연구 수 있습니다. 이러한 연구는 Tfh dysregulation 면역 등 단단하고 이용 암 특정 유형의 병에 연루는 질병에 특히 보증 될 것 이다. 또한, 질병에 cTfh 함수에서 변경 유일한 세포 표면 마커가이 프로토콜에 사용 되 고 cytometry를 사용 하 여 cTfh 셀을 정렬 하 여 조사 될 수 있습니다. MZL 환자에서 cTfh 셀 정렬 식 프로필 정상적인 과목21에 비교 될 때 유전자의 차이 찾을 수 사용할 수 있습니다.
우리는 효율적인 발견 CD4<su...

T-follicular 도우미 셀 (Tfh)는는 CD4+ 림프 조직1에서 처음 특징은 T 세포 부분 집합. 이러한 세포 PD-1, CXCR5 표면 수용 체를 표현 하 고 IL-21 및 IL-4 분 비 녹음 방송 요인, BCL-62,3의 핵 식 표시. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 그들은 어린 싹 센터에서 발견 되 고 높은 친 화력 항 체 생산1에 필수적인.
Dysregulated Tfh 응답 질병 병 인, 특히 자가 면역 질환, 그들은 autoreactive B 세포4의 확장을 추진 하는 어디에 연루 되었습니다. 그들은 또한 단단한5,6 의 림프 암7종양 microenvironment에서 역할을 재생할. 반대로, Tfh 필수적인 표면 단백질의 유전자 결함 인간 면역 결핍 증후군8T-셀 costimulator (ICOS) 결과 유도할 수 있는 등 기능. CD4+ CXCR5+ 인간의 말 초 혈액에서 순환 T-follicular 도우미 셀 (cTfh) 불린다 전지와 Tfh 세포 조직9에서 메모리 구획 될 것으로 추정 된다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 CD4 다음 cTfh 하위 집합의 분석+ 세포 주변 혈액 샘플에서 격리.
여러 cTfh 하위 집합 정의 하는 그들은 B-세포 도움을 제공 하는 효율성 다른9,10,,1112하나의 하위 집합에서 다릅니다. 대부분 눈에 띄게 면역 질환 있는 거기는 거의 항상 더 기능 PD-1에서 상대 증가 질병의 숫자에서 변경 되는 이러한 하위 집합의 상대적 비율+ 안녕 또는 cTfh2 또는 cTfh17 하위 집합 덜에 비해 기능 PD-1- 또는 cTfh1 하위 집합12. 이러한 변경의 정도 자주 질병 활동과 autoantibody titers Tfh에서의 활동을 반영 될 수 있습니다 질병에서 예 후 바이오 마커로 cTfh 하위 집합 배포의 잠재적인 역할을 나타내는 등 임상 매개 변수 연관 림프 조직9,12,,1314. 또한, 참가자에 게 서 혈액 샘플을 채취는 빠르고, 안전 하 고, 허용 하며 그래서 직렬 질병의 진행 이나 치료에 응답의 분석에 대 한 모니터링
고립 된 c d 4 사용 하 여+ T-세포 전통적인 주변 혈액 단 셀 (PBMNC) 정지 이상 분석에 대 한 cTfh 셀의 상당한 수를 확보 하는 데 필요한 시간을 줄여 높은 처리량 흐름 cytometry 실험 수 있습니다. 이 흐름을 사용 하 여 희귀 cTfh 하위 집합에서 셀 정렬 셀 정렬 (FACS) 활성화 될 때 특히 도움이 됩니다. 효율성을 투입,이 정지 "일괄 처리" 교류 cytometry 실험에 사용 되는 샘플의 사용을 cryopreserved 수 있습니다. 테스트는 CD4+ 순도 cryopreservation 하지 감소 했다.
세포 표면 마커 슈미트 외.12, 에 의해 제안 된로 두 그룹의 통합된 체계의 사용 여기에 그들의 발견, 방법의 초기 단계에서 cTfh 셀 분류를 사용 하는 다른 실험실 다른 마커 제시 하는 동안 15 cTfh 및 단일 cytometry에 그들의 9 인식된 하위 집합의 동시 식별 수 있도록 실험.
유일한 세포 표면 마커를 사용 하는 셀 고정 또는 permeabilization, 필요 하지 않은 고 따라서 다운스트림 기능 연구에 대 한 살아으로 남아 있을 수 있습니다. 이 같은 항 체 패널 FACS를 사용 하 여 정렬 하는 세포에 의해 촉진 수 있습니다. 이 패널 교류 cytometer 사용의 제한에 대 한 허용 하는 다른 마커를 포함 하도록 확장 될 수 있습니다.
멀티 컬러 흐름 cytometry 실험의 분석 특히 때 세포 인구에에서 필요가 없습니다 분명 bi 모달 배포 마커 형광는 2 차원 점 작에 게이팅의 본질적으로 주관적인 성격 때문에 도전적 일 수 있다는 cTfh 세포와 그들의 하위 집합에 대 한 케이스입니다. 이러한 이유로, 그것은 인구의 더 나은 해상도 사용 하도록 설정 하 고 전략을 자신 있게 게이팅 설정 유물을 줄이기 위해 효과적인 컨트롤을 설정 하는 것이 필수적. 이와 같이 항 체 패널 디자인과 cytometry에 대 한 기본 컨트롤 설정 실험, 즉, 보상을 사용 하 여 및 FMO 컨트롤 단계 3.4.2와 3.4.3,respectively에 설명 되어 있습니다.
모든 cTfh 세포 CD4로 정의 된+ CXCR5+ CD45RA-. 표현의 특성 Tfh 활성화 마커 PD 1의 수준 하위 집합 PD-1-의 PD-1+ 또는 PD-1안녕하세요 cTfh 셀을 식별 하기 위해 다음 확인할 수 있습니다. 그런 다음, chemokine 수용 체 CXCR3 및 CCR6의 조합을 사용 하 여, 전통적인 Th1, 2 또는 17 셀, cTfh에 의해 표현 된 차동 나타낼 수 있다 cTfh1, 또는 CXCR3의 프로 파일에 의해 17-같은 2로+ CCR6-, CXCR3- CCR6- , 및 CXCR3- CCR6+, 각각.
우리의 실험실에서 사용 하는 항 체 패널은 표 1에 표시 됩니다. 사용자 자신의 로컬 교류 cytometer에서 사용할 수 있는 레이저와 빛 필터 구성에 대 한 계정에 그들의 fluorophore 선택 적응 해야 합니다.
다음 사항을 fluorophores의 영향. 가능한 경우 밝은 fluorophores를 사용 합니다. 특히, 흐릿한 (매우 보다 적게 표현된) 표식에 밝은 사용할 수 fluorophores를 사용 합니다. 주차 마커 포함 PD-1, CXCR3 및 CCR6, 그리고 조금 적게, CXCR5. 우리는 특히 BB, BV와 BUV의 최신 사용 하 여 만든 fluorophores 우수한 밝기를 제공 하 고 이렇게 세포의 고유한 인구의 쉽게 확인 가능.
Fluorophore 선택 방출 스펙트럼 스펙트럼 중복 및 따라서 요구 하는 보상의 수준을 최소화 하기 위해 가능한 한 많이 분산. 교류 cytometry 패널 설계를 지원 하기 위해 사용할 수 있는 무료 온라인 도구를 여기서 찾을 수 있습니다: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. 방출 스펙트럼에 공간을 절약 하기 위해 우리는 모두 죽은 감지 (및 제외) APC H7 (CD45RA 활용)와 겹치는 방출 파장을 가진 생존 염료를 사용 하 여 "덤프 채널"를 고용 또는 CD45RA+ 를 사용 하는 단일 탐지기입니다.
여기, 프로토콜 cytometry 다르고 최근 설명 순환 하위 집합의 비율을 결정 하 여 말 초 혈액 CD4의 절연은+ T-세포 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>RosetteSep Human CD4+ T 세포 농축 칵테일</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 Mouse Anti-Human CD183&nbsp; 클론 1C6/CXCR3</td><td>BD 호라이즌</td><td>565223</td><td></td></tr><tr><td>BV711 마우스 안티 휴먼 CD196 (CCR6)&nbsp; 클론 11A9</td><td>BD 호라이즌</td><td>563923</td><td></td></tr><tr><td>BV421 쥐 안티 휴먼 CXCR5 (CD185)&nbsp; 복제&nbsp; RF8B2</td><td>BD Horizon</td><td>562747</td><td></td></tr><tr><td>BB515 마우스 안티-휴먼 CD4&nbsp; 복제 &nbsp; RPA-T4</td><td>BD 호라이즌</td><td>564419</td><td></td></tr><tr><td>PE 마우스 안티-휴먼 CD279&nbsp; 클론 MIH4</td><td>BD Pharmingen</td><td>557946</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 마우스 Anti-Human CD45RA 클론&nbsp; HI100</td><td>BD Pharmingen</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정 가능한 원적외 데드 셀 염색 키트, 633 또는 635nm 여기용</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34973</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD CompBead</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II 유세포 분석기</td><td>BD 생명과학</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 6.1.3</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td>유세포분석기 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>Treestar Inc.</td><td></td><td>유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Anti-CXCR3 항체</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>565223</tr><tr><td>Anti-CCR6 항체</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>563923</tr><tr><td>Anti-CXCR5 항체</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>562747</tr><tr><td>항-CD4 항체</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>564419</tr><tr><td>항-PD-1 항체</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>557946</tr><tr><td>Anti-CD45RA 항체</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>560674</tr><tr><td>생존 마커</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>L34973</td><td></td></tr></tbody></table>

cd4의 격리+ t-세포 및 분석의 순환 t-follicular 도우미 (ctfh) 6 컬러 flow cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

탈 T follicular 도우미 (Tfh) 셀 활동은 자기 면역 조건에서 감지 하 고 B-세포 비-Hodgkin의 림프 종에서 림프 노드 microenvironment 분석은 그들의 존재는 임상 결과와 관련. T follicular 도우미 셀 (cTfh), 혈액에 Tfh 셀의 순환 메모리 구획 순환의 하위 집합 또한 질병에서 불안정 하 고 따라서 잠재적인 새로운 예측 생체를 나타냅니다. 주변 혈액 기반 테스트 상대적으로 비 침략 적 이며 간단한 직렬 모니터링 수 있기 때문에 유리 하다. 이 문서는 CD4 격리 하기 위한 방법을 설명 합니다+ T-세포, 인간의 혈액과 cytometry cTfh 세포와 그들의 다양 한 하위 집합의 비율을 열거 하 여 추가 분석에서 (cTfhPD-1-/ + / 안녕, cTfh1, 2, 17, cTfh1/17). 이러한 하위 수준 다음 림프 종으로 일반 과목과 환자 사이 비교 되었다. 우리는 방법을 정기적으로 수집한 환자 자료에서 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 충분히 강력한 발견. 기술 분석에 대 한 설명 셀 정렬 및 RT-PCR 같은 다운스트림 응용 프로그램에 쉽게 적응 될 수 있다.

높은 CD4+ 순도 c d 4를 사용 하 여 달성 되었다+ 회사에 의해 했다 모든 혈액 샘플에서 신뢰할 수 있는 격리 프로토콜 테스트 (의미: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (그림 3).
CTfh의 식별 (CD4+ CXCR5+ 세포) 대표 정상적인 주제에(그림 4)제공 됩니다. CD4 내의 총 cTfh 세포의 비율+ 세포 했다 29.4%의 중앙값 (간 사분 위 수 범위 (IQR) = 10.8) 12 일반 과목에 걸쳐. 간세포 암 종17,<sup class=...

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

이 방법은 건강하고 병들게 한 상태에서 순환 하는 T-여포 도우미 세포 하위 집합 사이의 차이점을 입증 하는 데 도움이 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플이 일괄 처리 될 수 있으며 셀이 다운스트림 기능 분석을 위해 살아 있다는 것입니다. 이 기술은 임상 심각도의 마커와 상관 관계를 맺을 때 질병 진행을 위한 바이오마커로서 순환하는 T-여포 도우미 서브셋의 평가를 용이하게 합니다. 이 절차의 데모를 돕는 것은 박사 루시아 파이 될 것입니다

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+Vδ1+γδ T 세포의 저농도 집단을 자기 라벨링 기반으로 분리하는 프로토콜을 보여줍니다. FITC-conjugated anti-Vδ1 antibodys, magnetic anti-FITC microbeads 및 anti-CD4 antibody-coated superparamagnetic beads의 조합을 사용하여 CD4+Vδ1+ T cell은 PBMC 집단에서 성공적으로 정제될 수 있습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포에서 CD4+ Vδ1+ γδ T 세포의 선택적 분리

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

많은 실험 시스템은 면역 반응의 T 세포의 발달 및 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하는 데에 이용되고있다. 여기 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전 적 접근 경로를 규정하는 식별 경제적 시간 효율적이고, 무엇보다도 매우 유익하다 설명한다.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 ​​있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

여기에 제시된 것은 염료 희석을 이용한 항원 단백질 또는 펩티드에 반응하여 증식CD4+ T 세포를 측정하기 위한 프로토콜이다. 이러한 분석종은 희귀 항원 특이적 T 세포에 특히 민감하며 항원 특이적 세포의 복제를 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다.

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화

본 프로토콜은 전처리된 종양 세포를 사용한 동종 공동 배양 시스템에서 인간 T 세포 자극의 생체 외 분석을 가능하게 하는 실험 워크플로우를 설명합니다.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

배우세요 인간 말초혈액에서 CD4+ T세포 및 순환 T-포licular 보조세포(cTfh) 하위집합을 6색 유세포분석법으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 질병 진행 바이오마커 평가에 활용됩니다.

CD4의 격리⁺ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

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