Name: 수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 공동면역침전법과 비드상 효소 활성 분석을 이용하여 세포막 수용체와 효소 간의 기능적 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 수용체 효소 상호작용과 효소 활성을 동시에 평가할 수 있어 세포 신호전달 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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이 프로젝트는 NIH 교부 금 1R01AI125640-01 '과 류 마티스 연구 재단에 의해 투자 되었다.

1입니다. 세포의 transfection
<ol><li>씨앗 HEK 293T 세포도 12 10 cm 접시 (접시 당 5 x 106 세포)는 전날 transfection (그림 1). 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 계산을 수행 합니다. 각 접시에 대 한 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 DMEM의 10 mL을 사용 합니다. 5% CO2에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>셀은 80-90% 합칠, 일단 transfect 5 HEK 293T 격판덮개 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 다음 플라스 미드 중 하나: SHP2을 표현 하는 벡터, PD 1 GFP 표현 벡터 [PD 1의 야생 유형 (WT) 버전], ITIM 돌연변이 버전 (Y223F )의 PD 1 GFP 표현 벡터와는 ITSM 돌연변이 (Y248F)의 버전 PD 1 GFP 표현 벡터 (그림 1). 참고: 두 접시 WT PD-1-GFP-표현 벡터와 페 될 것입니다. 한 추가 판 비 페 셀 컨트롤 (그림 1) 될 것입니다.</li>
	<li>10 cm 번호판에 부착 세포에 대 한 제조 업체의 프로토콜에 의하여 transfection를 수행 합니다. 참고: PD 1의 돌연변이 버전에 각 주제에 티로신 (Y) phosphorylated 수 없습니다 페닐알라닌 (F)에 의해 대체 되었다.</li>
	<li>5 접시와 immunoprecipitation (그림 1) 전에 표현한 단백질 금액 [입력; 일컬어 전체 세포 lysate (WCL)]의 측정에 대 한 비 페 제어로 봉사 한 추가 접시의 두 번째 동일 집합 transfect</li>
	<li>37 ° C에서 48 h, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 transfected 세포를 품 어. 참고: 해당 transfection 성공적으로 발생 되도록 GFP 식 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다.</li>
</ol>2. 추진 Transfected 세포 인 산화
<ol><li>부 화, 다음 30% H2O2의 50 µ L와 신선한 pervanadate (100 m m 재고)에서 나트륨-orthovanadate의 50 µ L를 혼합 하 여 준비 합니다. 참고: 혼합 노란 색으로 변경 해야 합니다. Pervanadate는 티로신 잔류물13의 인 산화를 촉진 하는 세포 투과성 인산 가수분해 효소 억제 물. 이 분석 결과에서 튼튼하게 PD 1의 꼬리의 인 산화를 유도 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>PD 1의 태그 버전 phosphorylate PD 1 GFP transfected 세포에서 미디어를 제거 하 고 각 10 cm 접시 (8 접시 표현 결과 10 µ L pervanadate (2.1 단계)의 함께 (하지 않고 혈 청 또는 항생제) 일반 DMEM의 10 mL를 추가 PD 1의 다른 버전) (그림 1). 15 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 접시를 놓습니다. 참고: SHP2 페 셀 (2 개의 격판덮개; 그림 1) 그리고 이후이 번호판 활성 SHP2 효소에 대 한 소스로 사용할 것입니다 두 비 페 제어 접시 pervanadate와 함께 처리 되지 않습니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 5 mL로 세포 세척. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
</ol>3입니다. Immunoprecipitation
참고: 다음 단계 수행 해야 또는 얼음에 4 ° c.에
<ol><li>세포의 용 해 버퍼 (50 m m Tris HCl pH 7.2, 250 mM NaCl, 0.1 %NP-40, 2 mM EDTA, 10% 글리세롤) protease 억제제 (세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 녹 1 태블릿)와 1mm 나트륨 orthovanadate 보충. 셀에 500 µ L의 얼음 세포의 용 해 버퍼를 추가 및 제거 하 고 즉시 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 격판덮개에서 세포를 수집. 참고: 그것은 SHP2 페 접시와 비 페 컨트롤 플레이트 인산 가수분해 효소 활동을 유지 해야 하므로 PD 1 GFP 페 번호판에 대 한 사용할 수 세포의 용 해 버퍼에만 나트륨 orthovanadate를 추가 하는 것이 중요.</li>
	<li>1.5 mL 찬 튜브는 lysates 전송 및 0.005 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 그들을 회전.</li>
	<li>lysates에서 포스트 핵 표면에 뜨는 (PNS)를 수집, 4 ° C에서 10000 x g 에서 10 분 동안 lysates 아래로 회전 하 고는 supernatants 새로운 튜브로 전송 합니다. 펠 릿을 삭제 합니다. 6 판 (그림 1)의 두 번째 세트의 supernatants 나중 WCL 분석을 위한 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>
첫 번째의 PD 1 GFP 페 lysates에서 PD-1-GFP의 immunoprecipitation에 대 한 안티-GFP 구슬의 준비 (4 판) 설정 (그림 1).
	<ol>
<li>구슬의 침전을 방지 하기 위해 부드럽게 열기 전에 구슬 가진 병을 흔들어. 각 조건 마다 슬러리에서 안티-GFP 구슬의 40 µ L을 제거 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 3 분 동안 500 x g 에서 회전 시키십시오 고 구슬 씻고 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 플라스틱 피 펫 팁 및 손실을 방지 하기 위해 agarose 구슬 사이의 접촉을 최소화 하기 위해 중요 하다. 다른 튜브에 비즈를 전송 하기 전에 200 µ L 팁의 가장자리를 잘라 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>(샘플) 당 세포의 용 해 버퍼의 80 µ L에 구슬 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>씻어 구슬 lysate 셀에 직접 (PNS) 첫 번째 세트 (4 판)의 PD 1 GFP 표현 세포에서 추가 (단계 3.3). GFP 태그 immunoprecipitate 단백질에 4 ° C에서 30 분 동안 0.005 x g 에서 회전 합니다.</li>
	<li>워시 (orthovanadate) 없이 차가운 세포의 용 해 버퍼의 1 mL와 구슬 3 번. 2500 x g 10에서 튜브 원심 s. 참고: 구슬에 세포의 용 해 버퍼를 추가 하는 경우 추가 구슬에 직접 팁 그들을 건드리지 않고. 아래로 세척 동안 플라스틱 필요가 있다.</li>
	<li>똑같이 lysate 첫 세트 (한 접시; 단계 3.3)에서 활성 SHP2의 분할 하 고 씻어 PD 1 GFP 함유 구슬 (WT PD-1-GFP와 두 개의 서로 다른 phosphdeficient 돌연변이, Y223F 및 Y248F)의 3 관에 그것을 추가. 비 transfected 세포 lysate에서 WT PD-1-GFP 구슬의 두 번째 튜브에는 볼륨의 1 / 3를 추가 합니다. 나머지 2/3를 삭제 합니다.</li>
	<li>부드러운 회전 (0.005 x g) 4 ° C에서 4 h 구슬을 품 어.</li>
	<li>3.6 단계에서 보고 된 구슬 (pervanadate 또는 orthovanadate) 없이 차가운 세포의 용 해 버퍼의 1 mL로 두 번 세척.</li>
	<li>80 µ L의 샘플 확인 각 관에서 총 볼륨 100 µ L (구슬의 20 µ L) 및 세포의 용 해 버퍼의 80 µ L 당 (하지 않고 pervanadate 또는 orthovanadate) 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 두 개의 신선한 1.5 mL 튜브 각 튜브에서 50 µ L를 전송. 참고:이 단계에 따라 있을 것입니다 구슬 및 세포의 용 해 버퍼를 포함 하는 혼합물으로 채워진 2 개의 관: 1 개의 관 서쪽 blotting에 의해 co immunoprecipitated SHP2를 테스트 하는 데 사용 됩니다 및 두 번째 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 대 한 사용 됩니다.</li>
</ol>4. 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과
<ol><li>구슬 인산 가수분해 효소 워시 버퍼 (30mm Hepes pH 7.4와 120 m m NaCl)로 한 번 씻는 다. 상쾌한을 완전히 제거 합니다.</li>
	<li>구슬를 분석 결과 버퍼 (30mm Hepes pH 7.4, 120 m m NaCl, 5mm DTT, 10 m m p-nitrophenylphosphate)의 100 µ L을 추가 하 고 부드러운 동요에서 30 분 동안 30 ° C에서 품 어. 참고: 보육 시간 다 수 있지만 버퍼 dephosphorylation 시 노란색으로 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>반응 종료 때 버퍼 노란색 1 M NaOH의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>2500 x g 10 s 및 전송 50 µ L의 절반 영역의 두 웰 스 (잘 당 50 µ L와 중복) 상쾌한에 스핀 다운 96 잘 접시에. 405에서 흡 광도 읽고 nm.</li>
	<li>PD-1-GFP의 제어 야생-타입 버전 상대 광학 밀도 (OD)로 결과 표현 한다.</li>
</ol>5. SHP2 서쪽 오 점 분석
<ol><li>구슬 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.</li>
	<li>2 x Laemmli 버퍼의 20 µ L 추가 ( 자료 표참조) 구슬 및 5 분 동안 95 ° C에 종 기.</li>
	<li>입력의 단백질 농도 측정 컨트롤 (2) 사용 하 여 설정를 BCA 키트 ( 자료 표참조). 새로운 튜브에 가장 희석된 샘플의 30 µ L를 전송. 입력된 컨트롤과 가장 희석된 샘플으로 동일한 농도에 세포의 용 해 버퍼의 나머지 부분을 희석 하 고 그들의 각각에서 새로운 튜브 30 µ L를 전송. 참고:이 단계에 따라 있을 것입니다 30 µ L 각각 4 튜브 비슷한 단백질 농도에서 lysates 제어 입력을 나타내는.</li>
	<li>동등한 lysates와 95 ° C 5 분 스핀에서 종 2 x Laemmli 버퍼의 구슬 아래로 볼륨과 4-20 %SDS 페이지 트리 기반 젤에 상쾌한 로드 추가 ( 자료 표참조) 서 부에 대 한 분석 오 점. 또한, 두 번째 집합의 각 샘플에서 50 µ L를 로드 합니다.</li>
	<li>서쪽 오 점 분석 프로토콜에 따라 이전12설명 계속.</li>
</ol>

<ol><li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment%3A+the+current+arsenal+of+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li>
<li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li>
<li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li>
<li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation%2C+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li>
<li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46(2012).</li>
<li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li>
<li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li>
<li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70%2FCD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li>
<li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037(2013).</li>
<li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li>
<li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor%2C+pervanadate%2C+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li>
<li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li>
<li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20890902">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).</li>
<li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

수용 체-효소의 상호 작용은 세포내 시그널링을 위한 중요 한. 많은 효소 SH2 도메인 동일한 수용 체의 꼬리를 장식 phosphorylated tyrosines에 바인딩 통해 수용 체에 채용 됩니다. 그러나, 효소는 종종 닫힌된 비활성 conformations 통합 하며 활성화 다른 도메인의 동일한 수용 체에 의해 중재 될 수 있는 구조적 변경11 . 분석 결과 설명 여기 측정 이러한 상호 작용에 의해 유도 된 활동 뿐 아니라 효소 및 수용 체 사이 상호 작용.
P-nitrophenylphosphate (pNPP)를 활용 하 여 SHP2를 기판으로 색도계 분석 결과 사용 했습니다. pNPP는 효소15의 광범위 한 번호를 공개한 비 선택적 기판 고 인 기증자. Phosphorylated 재조합 펩 티 드 대체 기판으로 사용할 수 있습니다 (예., 그 공작 석 녹색 분석 결과에 사...

촉매 수용 체와 수용 체 티로신 kinases는 막 횡단 단백질에 extracellular ligand의 바인딩 세포내 측면1에 효소 활동을 하면. 다른 kinases와 그들의 세포질 꼬리를 가수분해 등 특정 효소를 모집 하는 동안 일부 수용 체 수용 체 및 효소 기능 보유. 수용 체의 꼬리를이 효소의 촉매 조치는 효소의 채용은 항상 동일한 단백질 도메인2에 의해 통제 되지 않는 두 개의 별도 프로세스. 불행 하 게도, 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 평가 하기 위해 특정 도구가 있다. 여기에 설명 된 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 정품 인증에서 수용 체의 꼬리에는 효소의 채용을 해 부하는 유용한 방법입니다. 이 분석 결과 항 체 코팅 구슬에 의해 태그 수용 체의 immunoprecipitation를 사용합니다. 그 후, 효소 활동 분석 결과 구슬에 서쪽 오 점 분석 수행 됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 단백질 도메인은 수용 체와 효소 (서쪽 오 점 분석에 의해 평가) 간의 상호 작용에 필요한 폭로 이며 도메인 (구슬에 의해 측정 하는 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무 효소 활동 분석 결과)입니다. 그것은 인간의 질병의 병 인에서 그들의 개입으로 인해 수용 체 관련 된 효소의 기능을 별도 공부를 위한 도구를 개발 하는 중요 한. 또한, 추가이 단백질의 행동의 메커니즘을 이해 하는 것은 소설 치료 개입의 디자인을 도울 수 있다.
프로그램 된 죽음-1 (PD-1) T 세포의 표면에는 금지 수용 체 이며, 과도 한 T 세포 응답을 제한 하는 데 필요한. 최근 몇 년 동안에서 안티-PD-1 항 체 여러 악성1,2의 치료에 연루 되었습니다. PD 1 결 찰 확산, 접착, 및 여러 cytokines3,,45의 분 비를 포함 하 여 다양 한 T 세포 기능을 멈출. PD 1은 면역학 시 냅 스, 그것은 T 세포 수용 체 (TCR)7colocalizes T 세포와 항 원 제시 세포6, 사이의 인터페이스를 지역화 됩니다. 그 후,는 티로신 인산 가수분해 효소 SHP2 [Src 상 동 2 (SH2) 도메인 티로신 인산 가수분해 효소 2] PD-1, 인접 복잡 한 TCR 및 그것의 관련 된 키 티로신 잔류물의 dephosphorylation로 이어지는 세포질 꼬리를 모집 신호 분자3,,45,,89. PD 1의 세포질 꼬리 두 티로신 모티프는 immunoreceptor 티로신 근거한 금지 주제 (ITIM), 및 immunoreceptor 티로신 기반 스위치 모티브 (ITSM)10에 포함 되어 있습니다. 두 모티프는 PD 1 결 찰9,10시 phosphorylated는. Mutagenesis 연구 SHP2 PD-1 신호 및 기능에 있는 그의 역할은 분명 ITIM 반대로 모집4ITSM에 대 한 기본 역할을 계시 했다.
SHP2 중 하나는 닫힌 (접혀) 채택, 구조 또는 오픈 (확장), 활성 구조11저해. SHP2 바인딩 또는 활성화 PD 1의 각 꼬리 도메인의 기여는 아직 해명 하지. 이 질문에 대답, 우리는 PD-1와 그것의 활동12의 꼬리에 SHP2의 채용의 병렬 테스트 수 있도록 분석 결과 개발 했다. 우리는 공동-immunoprecipitation와 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 테스트 하는 구슬에 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 고용. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 PD 1의 ITSM PD 1의 ITIM 완벽 하 게 확장 하 고 효소를 활성화 하는 데 필요한 동안 PD-1, 꼬리 SHP2 모집 충분 한지 보여줍니다.
여러 인접 한 도메인 그들의 세포질 꼬리에 있는 많은 수용 체가 있다. 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 단백질 모집 또는 효소 활성화에 필요한 특정 도메인의 역할을 파악할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>미세 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.25%) 페놀 레드</td><td>Gibco 25200114</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td>소 태아 혈청</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토마이신</td><td>피셔</td><td>BP295950</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민이 없는 DMEM 고포도</td><td>당 Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>SuperFect 트랜스펙션 시약</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SHP2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-280</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; GFP-아가로스</td><td>MBL</td><td>D153-8</td><td></td></tr><tr><td>안티-GFP</td><td>로슈</td><td>118144600</td><td></td></tr><tr><td>안티-액틴</td><td>산타크루즈</td><td>SC-1616</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>오르토바나데이트</td><td>시그마</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>30%</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>EDTA 무함유</td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS 시료 완충액 (2x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td>Modified Laemmli 완충액</td></tr><tr><td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td><td>Invitrogen</td><td>XP04205BOX</td><td>15-well</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membranes</td><td>General Electric</td><td>10600004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Sodium 염화물</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>N-2- 히드 록시 에틸 피페 라진 -N-2- 에탄 술폰산</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D1532</td><td>Dithiothreitol</td></tr><tr><td>pNPP</td><td>시그마</td><td>20-106</td><td>p- 니트로 페닐 포스페이</td></tr>트 <tr><td>NaOH</td><td>시그마</td><td>S8045</td><td>수산화 나트륨</td></tr><tr><td>BCA</td><td>Fisher</td><td>23225</td><td>Bi Cinchoninic Acid assay</td></tr></tbody></table>

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 co-immunoprecipitation

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

수용 체 관련 된 효소는 세포 활성화의 주요 중재자. 이 효소는 통제, 적어도 부분에서 수용 체의 세포질 꼬리와 물리적 상호 작용을 통해. 종종 상호 작용 특정 단백질 도메인을 통해 발생 하 고 효소의 활성화에 결과. 단백질 사이 상호 작용을 공부 하는 여러 방법이 있다. 공동-immunoprecipitation은 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용에 필요한 도메인을 공부 하는 데 사용 됩니다, 있다 아무 분석 문서를 동시에 모집된 효소의 활동에 특정 도메인의 기여. 따라서 여기 설명 하는 방법을 결합 단백질과 관련된 효소 활성화 사이 상호 작용의 동시 평가 구슬 효소 활동 분석 결과 공동 immunoprecipitation. 이 프로토콜의 목표 단백질 및 효소와 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무는 도메인 간의 실제 상호 작용에 대 한 중요 한 도메인을 식별 하는 것입니다. 이 분석 결과의 중요성을 설명, 특정 수용 체로 단백질 도메인에 기여할 효소, 수용 체의 세포질 꼬리의 바인딩 다른 도메인은 동일한 효소의 기능을 조절 하는 데 필요한.

기여의 ITSM의 PD-1 SHP2 바인딩을 설정 하는 동안 PD 1의 ITIM의 역할은 보다 적게 명확 하다. SHP2 두 SH2 도메인 PD-1 (한 티로신은 ITSM에서)와 다른은 ITIM 두 순차 phosphotyrosines 바인딩할 수 있기 때문에, 우리는 PD 1의 ITIM 안정화 여 SHP2 활동을 용이 하 게 하는 동안 PD 1의 ITSM PD-1, SHP2를 앵커 가설의 구조적 상태11,14을 엽니다. 이 테스트 하려면 우리는 결합 된 공동-immunoprecipitation 및 수용 체-효소의 상호 작용 및 활성화의 병렬 평가 대 한 분석 결과 효소 활동을 개발 했다. 강포한 유형 GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (ITIM 돌연변이), 또는 GFP-PD-1 Y248F (ITSM 돌연변이) 이후 pervanadate (<strong cl...

여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

이 방법은 수용체 효소 상호 작용 및 효소 활성화에서 다른 단백질 도메인의 중요성과 같은 세포 신호 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수용체 효소 상호 작용의 수반되는 테스트와 효소 활성에 대한 이러한 상호 작용의 기능적 결과를 수반하는 것입니다. 각 플레이트에 대해 10%의 FBS와 1%페니실린 및 연쇄 절제술로 보충된 DMEM 10밀리리터를 사용하십시오.이식 전날, 세포 수를 계산하기 위해 혈류계를 사용하여 12 10센티미터 플레이트로 인간 배아 신장 293-T 세포를 종자. 5%C02에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 일단 세포가 80 에서 90%의 응수되면, 지질 계 형 형 질광제를 사용하여 5 개의 플레이트를 트랜스펙트하십시오.10센티미터 플레이트의 준수 세포에 대한 제조업체의 지침에 따라 경전을 수행합니다. 그런 다음 면역 침전 전에 발현 된 단백질 량의 측정을 위한 비감염 된 대조군역할을 하는 1 개의 추가 플레이트와 함께 5 개의 플레이트의 동일한 두 번째 세트를 트랜스펙트합니다. 48시간 동안 5%의 CO2에서 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 전감염된 플레이트를 배양한다.형광 현미경을 사용하여 GFP 발현에 대한 세포를 검사하고 형질이 성공적으로 발생했는지 확인합니다. 100밀리머 나트륨 orthovanadate의 15 마이크로리터를 과산화수소 30%의 마이크로리터 50마이크로리터와 혼합하여 신선한 퍼바나데이트 혼합물을 준비합니다. 태그가 지정된 버전의 PD-1을 인광하려면 PD-1-GFP 전세포로부터 미디어를 제거한다.일반 DMEM 10밀리리터와 각 플레이트에 10마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 그 후, 세척당 PBS 의 5 밀리리터를 사용하여 얼음 차가운 PBS에서 세포를 세 번 세척하십시오.면역 침전을 수행하는 동안 모든 단계는 얼음이나 섭씨 4도에서 수행되어야합니다. 10 밀리리터의 완충제에서 억제제 1정을 용해시켜 프로테아제 억제제로 용해 완충제를 보충한다. 또한 PD-1-GFP-전감염 플레이트에 사용될 완충제에 소도바나데이트 나트륨 1밀리머를 첨가한다.500 마이크로리터의 얼음 냉기 용해 버퍼를 세포에 추가하여 PD-1-GFP-전세포가 함유된 플레이트에만 나트륨 orthovanadate를 함유한 리시스 버퍼를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 즉시 제거하고 수집합니다. 용양을 1.5 밀리리터 콜드 튜브로 옮기고 중력0.005배, 섭씨 4도에서 30분 동안 회전합니다.용사에서 핵 후 상체를 수집하려면 10, 000 배 의 중력및 섭씨 4도에서 10 분 동안 아래로 회전하십시오. 수퍼네이너츠를 새로운 튜브로 옮기고 펠릿을 폐기합니다. 나중에 WCL 분석을 위해 얼음에 6 개의 플레이트의 두 번째 세트에 대한 슈퍼 네이너티츠를 저장합니다.안티 GFP 구슬을 준비하기 시작하려면 침전을 방지하기 위해 열기 전에 구슬이 들어있는 병을 부드럽게 흔들어 줍니다. 각 조건당 슬러리에서 항 GFP 구슬 의 40 마이크로리터를 제거합니다. 원심분리기는 중력 500배, 섭씨 4도에서 3분간.상체를 제거하여 구슬을 세척하여 피펫과 구슬 사이의 접촉을 최소화하여 손실을 방지하십시오. 샘플당 리시스 버퍼의 80 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다. 4개의 플레이트의 첫 번째 세트의 PD-1-GFP 표현 세포로부터 세척된 구슬을 셀 용해에 직접 추가합니다.GFP 태그 단백질을 면역침전을 위해 섭씨 4도에서 30분 동안 중력0.005배에서 회전합니다. 각 세척에 대해 orthovanadate를 포함하지 않는 차가운 용해 버퍼 1 밀리리터를 사용하여 구슬을 세 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 원심 분리기는 10초 동안 2, 500배 의 중력에서 분리됩니다.활성 SHP2의 용액을 첫 번째 플레이트 세트에서 3개의 동일한 부분으로 나누고 세척된 PD-1-GFP 함유 구슬을 포함하는 세 개의 튜브 각각에 일부를 추가합니다. 비감염 된 세포에서 용해 부피의 1/3을 야생 형, PD-1-GFP 구슬의 두 번째 튜브에 추가합니다. 나머지 2/3을 폐기합니다.구슬을 섭씨 4도에서 4시간 동안 배양하고 무게는 0.005배의 부드러운 회전으로 바짝 배양합니다. 그 후, 각 세척에 대해 차가운 용해 버퍼 1 밀리리터를 사용하여 구슬을 두 번 씻으시다. 각 샘플에 80마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하여 각 튜브의 총 부피가 100 마이크로리터임을 보장합니다.컷 파이펫 팁을 사용하여 파이펫을 부드럽게 위아래로 섞습니다. 그런 다음 각 튜브에서 50 마이크로리터를 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮습니다. 구슬을 인산세척 버퍼로 한 번 씻으시다.그런 다음 상체를 완전히 제거합니다. 100 마이크로리터의 분석 버퍼를 구슬에 넣고 부드러운 동요 하에서 30분간 섭씨 30도에서 배양합니다. 완충제가 노란색으로 변하면 수산화 나트륨의 1개의 어압 액면의 50 마이크로리터를 추가하여 반응을 종료합니다.원심분리기는 10초 동안 2, 500배의 중력에서 분리됩니다. 그 후, 96웰 플레이트에서 상체를 하프 영역의 두 개의 우물로 옮긴다. 405 나노미터에서 흡수체를 읽고 PD-1-GFP의 제어 야생 형 버전을 통해 상대 광학 밀도로 결과를 표현한다.먼저 구슬을 2, 000배, 섭씨 4도에서 30초 동안 회전하고 상수체를 제거합니다. 2회 Laemmli 버퍼20마이크로리터를 넣고 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다. BCA 키트를 사용하여 입력 컨트롤의 단백질 농도를 측정합니다.가장 희석된 시료 30마이크로리터를 새로운 튜브로 옮기습니다. 리시스 버퍼를 사용하여 입력 컨트롤의 나머지 부분을 가장 희석된 샘플과 동일한 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석된 각 입력 컨트롤의 30마이크로리터를 새 튜브로 옮기습니다.lysates에 두 번 Laemmli 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 5 분 동안 섭씨 95도를 끓입니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 전에 30초 동안 2, 000배 의 중력 및 섭씨 4도에서 구슬을 회전시합니다. 본 연구에서는, 결합된 공동 면역침전및 효소 활성 분석은 수용체 효소 상호 작용 및 활성화의 병렬 평가를 위해 개발된다.당연히, SHP2는 ITSM이 돌연변이되었을 때 PD-1에 묶지 못했습니다. 놀랍게도 ITIM의 돌연변이 버전은 제한된 범위로만 SHP2 결합을 억제했습니다. 그럼에도 불구하고, SHP2-인산염 활성 분석은 ITIM과 ITSM이 효소 활동에 동등하게 필수 불가결하다는 것을 보여줍니다.이것은 SHP2가 휴식 조건 하에서 자동 억제 된 형태로 접힌 2 단계 활성화 모델을 보여줍니다. PD-1의 활성화시, SHP2는 인광 ITSM에 모집된다. 그러나 ITIM은 SHP2를 활성 형태로 전개하기 위해 인광이 되어야 합니다.개발 후, 이 기술은 수용체 효소 상호 작용에서 단백질 도메인의 기능을 탐구하는 세포 신호 의 분야에서 연구원을위한 길을 열 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

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여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

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정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

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thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.

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수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

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