Name: Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 학습하세요 Dictyostelium discoideum에서 유세포측정법을 이용한 고처리량 거대세포음식작용 측정 방법입니다. 이 기술은 유전자 돌연변이와 억제제 농도의 영향을 단일세포 수준에서 분석하여 면역학 및 암 연구에 활용됩니다.

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우리는 의료 연구 위원회 영국 코어 (U105115237) RRK 자금에 대 한 감사 합니다.

1입니다. 세포와 자료의 준비
<ol><li>설명된23으로 셀 Klebsiella aerogenes, 같은 박테리아와 함께에서 또는 HL5 같은 영양소 매체에 SM 한 천 배지에서 배양. 참고: 성장 하는 박테리아에 macropinocytosis에 결함이 녹아웃 돌연변이 macropinocytosis의 속도 증가 시킬 수 있습니다 이차 돌연변이의 축적을 방지 하기 도움이 됩니다. 최적의 결과 대 한 주식에서 셀 도금 후 4 아래 통로 번호를 유지. 돌연변이 격리 후 즉시 냉동된 주식으로 저장 되어야 합니다.</li>
	<li>SM 한 천 배지에서 세포 배양을 SM 매체에 합류 K. aerogenes 성장. SM 한 천 격판덮개에 박테리아의 200-300 μ를 추가 하 고 확산. (다른 세균성 접시에서 전송) 하는 경우 셀의 메 마른 루프를가지고 고 접시의 한 가장자리에 확산. 주일에 22 ° C에서 품 어.</li>
	<li>50 mg/ml 물에 Tetra-메 틸-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran을 분해, 1 mL aliquots로 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 및-20 ° c.에 저장 Aliquots는 무기한으로 보관 될 수 있습니다. 참고: 155 kDa, 대량에서 싸게 구입할 수 있습니다 하지만 작은 dextrans 측정 macropinocytosis Dictyostelium24에 효과적으로이 방법으로 사용 되는 일반적인 크기입니다. 캐스케이드 또는 알 렉 사-647, 같은 다른 비-quenchable dextrans 다른 fluorophores 필요한 경우 대안이 있습니다.</li>
</ol>2. (선택 사항)으로 양적 질적 측정 변환
<ol><li>
현 탁 액 셀을 사용 하 여 액체 이해 분석 결과 수행 합니다.
	<ol>
<li>300 x g 3 분에 axenically 성장 세포를 작은, 삭제는 상쾌한 고 1 x 107 셀/mL 영양소 중에 resuspend. TRITC-dextran 0.5 mg/mL을 추가 하 고 180 rpm, 22 ° c.에 흔들</li>
		<li>희석 0.8 mL 샘플 얼음 주식2 0, 30, 60, 90, 120 분 세척에서 0.7 mL로 한 번 얼음 주식2 버퍼23 벤치탑 원심 분리기에서 1.5 ml, 같은 버퍼에 1 ml resuspend 및 얼음에 저장. 참고: 동일한 결과 생성 즉시 또는 모든 샘플 수집 된 일단 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
액체는 세포에 의해 내 면의 볼륨을 결정 합니다.
	<ol>
<li>574의 544 및 방출 파장의 여기 파장을 사용 하 여 형광을 측정 하기 위해 fluorimeter을 설정 10 nm 슬릿 nm. TRITC-dextran의 희석 일련을 설정 하 고 위해 주어진 형광을 측정 하는 데 사용할 dextran의 볼륨. 보정 곡선을 만듭니다.</li>
		<li>섹션 2.1 세포 현 탁 액의 0.9 mL를 사용 하 여 셀에 의해 내 면 형광을 측정 합니다. 보정 곡선24를 사용 하 여 셀 당 내 액체의 볼륨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 mL 얼음 차가운 주식2에 별도로 각 시간 지점에서 세포의 나머지를 희석. 5 mL 폴리스 티 렌 흐름 cytometry 튜브 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 각 시간 지점에서 세포는 서로 다릅니다 그리고 그들의 형광을 기록 교류 cytometer 설정 (섹션 3.4와 3.5 참조).</li>
	<li>위의 설정을 사용 하 여 교류 cytometer에서 교정 구슬의 형광을 측정 하 고 그것을 기록 합니다. 참고: 이것은 교류 cytometer에 모든 미래 형광 측정에 대 한 참조: 다시 사용 하기 전에 구슬을 실행 하 고 그래서 그들은 같은 형광 설정을 조정. 이 매우 좁은 정의 된 피크를 줄 것 이다. 주위에 형광 피크 게이트 퍼 팅 수 있습니다 쉽게이.</li>
	<li>세 번을 반복 하 고 2.2 및 2.3 서로 대 한 섹션에서 얻은 세포 형광 데이터. 적합 선 플롯 하 고 방정식을 사용 하 여 양적 단위로 cytometry에서 질적 데이터를 변환.</li>
</ol>3. 측정 유체 통풍 관
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> 그림 1: macropinocytosis의 높은 처리량 측정의 도식. (A) SM 접시에 성장 Dictyostelium K. aerogenes 박테리아 (노란색)와 시드. 주식2 버퍼의 25 mL로 세포 먹이 앞 (오렌지), 이미 개발 된 셀 피 (녹색), 수확. 소용돌이, 해리를 300 x g에 3 분 원심 분리 하 여 펠 렛 다음 주식2 버퍼, 삭제는 상쾌한 때마다 50 mL에 3 번 세척. 1 x 105 셀/ml HL5 성장 매체에 resuspend 하 고 편평한 바닥 96 잘 접시의 샘플 당 3 개의 우물으로 50 µ L를 추가 합니다. (B) 희석 TRITC-dextran HL5 성장 매체에 1 mg/ml에서 50 mg/mL의 재고 솔루션 24 h. 22 ° C에서 품 어. (0 분 이해 컨트롤 웰 스 제외), 각 샘플에 50 µ L을 추가 하 고는 dextran 0 분 이해 컨트롤에 추가 하는 후 h 1에 대 한 22 ° C에서 품 어. (C)는 언론에 즉시 가만히 따르다, 초과 매체를 제거 하 고 씻어 웰 스 작성 얼음 주식2 버퍼의 목욕에 잠수함을 조직에 접시를 두 드려. 버퍼를 가만히 따르다 하 고 다시 건조 두 드려. 5mm 나트륨 아 지 드 주식2엠씨 셀을 분리 해체의 100 µ L를 추가 합니다. 내 면된 형광 측정 cytometer 흐름을. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol><li>
플랫 96-잘 조직 문화 접시 (그림 1A)를 설정 합니다. 분석 결과; 전에 24 h HL5 매체 (포함 100 µ g/mL의 dihydrostreptomycin, 100 µ g/mL 암 피 실린 및 50 µ g/mL 대)에 그들을 전송 하 고 박테리아에 성장 하는 세포를 사용 하 여 macropinocytosis를 박테리아24에 성장 하는 세포에서 낮은 레벨에서 upregulated 될 수 있습니다. 또는, 다른 밀도에서 희석되 셀 오류를 줄이기 위해 분석 결과 전에 24 h에 대 한 잠복기 axenic 문화에서 직접 셀을 희석.<ol>
<li>25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에서 주식2 에 먹이 앞에서 베스트 셀. Vortexing와 3 분. 에 대 한 300 x g 에서 펠 릿 세포 분열 삭제는 상쾌한, resuspend 펠 릿 그리고 300 x g 주식2, 박테리아를 제거 하는 상쾌한 때마다 삭제의 50 mL에서 3 분에 3 번 세척.</li>
		<li>(는 hemacytometer 또는 다른 셀 카운트 시스템을 사용 하 여) 셀 밀도 결정 하 고 HL5 포함 항생제 1 x 105 셀/ml로 희석. 각 조건에 대 한 3 개의 우물을 사용 하 여 각 음에 50 μ를 플라스틱. 22 ° C 24 h. 0 분 이해 제어를 설정 하는 기억에서 품 어. 참고:는 대체 매체, 예를 들면 SIH, VL6 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TRITC-dextran (그림 1B)에 포함 된 셀을 로드 합니다.
	<ol>
<li>Dextran 사용 매체에 1 mg/mL를 희석 (이 증가 될 수 있다 2.5-5 m g/mL를 매우 낮은 통풍 관에 포함 된 셀을 평가할 때). 각 잘 (주는 TRITC-dextran 0.5 mg/mL의 최종 농도)을 50 μ를 추가 하 고 이로써 상당한 dextran 축적 하지만 dextran exocytosis 아직 시작 하지는 22 ° C 1 시간에 접시를 반환. 참고: 리피터 피 펫이이 단계 더 빠르게 할 수 오류를 줄일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry (그림 1C)에 대 한 셀을 준비 합니다.
	<ol>
<li>세척, 직전 0 분 이해 컨트롤에 50 μ dextran 포함 된 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>매체를 가만히 따르다와 조직에 건조 두 드려. 얼음 주식2, 플레이트를 잠수 하 여 세척 한 다음 가만히 따르다. 참고: 준수 결함을 가진 일부 변종 예: 중부의 두 homologs의 녹아웃이이 단계 동안 분리 될 수 있습니다 (탈 라-/ talB-)25. 작업 셀 라인을 제대로 연결 하 고 필요한 경우 미디어를 발음을 할 때 주의 사용 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 5mm 나트륨 아 지 드 주식2MC (주식2 + 2mm MgSO4 및 100 μ M CaCl2)에 용 해의 100 μ를 추가 합니다. 주의: 나트륨 아 지 드는 매우 독성이 있습니다. 먼지가 면 및 안전 유리를 사용 하 여 분말을 작업할 때. 항상 착용 장갑 및 연구실 코트. 열을 방지 하 고 산으로 혼합 하지 마십시오. 참고: 셀 빠르게 분리 하 고 exocytosis 방해24입니다. 이것을 확인 하는 현미경을 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry에 의해 측정 유체 통풍 관
	<ol>
<li>값을 변환 상대적 절대 것 계획, 비즈를 사용 하 여 표준화 흐름 cytometer 설정 (섹션 2 참조). 사용 하 여 셀 (그림 2B) 섹션 2 앞으로 분산형 및 측면 분산형 설정 적절 하 게 셀 (그림 2A), 기계, 차단 되지 않습니다 보장을 dextran 함께 로드 하 고 매개 변수를 조정 하는 또는, (그림 2C) 내 면된 형광을 측정 합니다.</li>
		<li>높은 처리량 샘플링 시스템을 연결 하 고 플레이트를 추가 합니다. (TRITC-dextran 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 자극 582 nm 채널 또는 유사한 측정을)에 대 한 형광을 측정 하는 프로토콜 설정 세포 현 탁 액 및 실행의 최대 65 μ의.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
교류 cytometry 결과 분석
	<ol>
<li>앞으로 분산형 및 사이드 분산형 (그림 2A)를 사용 하 여 셀에 게이트. 통계 옵션을 사용 하 여 셀의 메디아 형광을 계산 합니다. 하나의 샘플을 사용 하 여 이러한 매개 변수를 설정 하 고 모든 샘플에 적용. 참고: 앞으로 분산형/사이드 분산형 프로필 다른 돌연변이 또는 억제제를 사용 하 여 샘플 사이의 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>각 조건에 대 한 3 개의 우물의 의미를 확인 하 고 빼기 0 분 이해 합니다. 중 2 절에서 결정 하는 수식을 사용 하 여 정량 값으로 변환 또는 컨트롤에 정상화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 유체 이해 시간-과정 수행
<ol><li>섹션 3, 각 시간 점 및 스트레인/조건에 대 한 3 개의 우물에서 세포를 설정 합니다.</li>
	<li>다른 우물에 dextran 이라는 매체를 순차적으로 추가 합니다. 전형적인 시간 과정 측정 유체 이해 0, 30, 60, 90, 120 및 180 분 180 분 시간 포인트 우물, 120 분 시간 지점에 대 한 우물에 그것을 추가 하 여 다음 60 분에 나중에 대 한 매체 dextran 포함 된 추가 등 (그림 3A).</li>
	<li>0 분 50 μ dextran 포함의 추가 매체 즉시 가만히 따르다와 섹션 3.3에서 접시를 씻어. 3.5 섹션에 설명 된 대로 분석 합니다.</li>
</ol>5. 복용량 응답 곡선
<ol><li>섹션 3, 각 스트레인 및 조건에 대 한 3 개의 우물에에서 설명 된 대로 세포를 설정 합니다.</li>
	<li>포함 하는 화합물의 두 번 원하는 최대 최종 농도 에서 1 mg/mL dextran 매체로 관심의 화합물을 희석. 처음으로 자동차의 동일한 비율으로 dextran와 매체를 포함 하는 두 번째 튜브를 준비 합니다. 소용돌이를 섞어입니다.</li>
	<li>샘플 (그림 4A) 당 매체를 포함 하는 200 μ dextran의 화합물의 희석 시리즈를 만듭니다. 소용돌이를 섞어입니다. 매체의 50 μ 1 h 위해 각 샘플에 추가 합니다.</li>
	<li>세척 및 분석 섹션 3.3 이후에 설명 된 대로.</li>
</ol>6. 식 균 작용 및 막 이해
<ol><li>막 이해 측정, 섹션 3에에서 설명 된 대로 셀을 준비 합니다. 10 μ M의 최종 농도 20 μ M FM 1-43를 포함 하는 매체의 50 μ를 추가 합니다. 후, 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry에 대 한 셀을 준비 합니다. 585 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다. 참고: 막 매매 하는 것은 액체 단계 보다 더 빠른, 10 분 1 h26보다 사용 하기 더 적절 한 시간 포인트입니다. 형광 막에 통합 하는 경우에 대체 염료 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>
붙일 이라는 구슬 또는 박테리아를 사용 하 여 측정 하는 식 균 작용. 그들은 앞으로 하 여 Dictyostelium 에서 사이드24분산형 형광 효 모를 사용할 수 없습니다. 섹션 3에서에서 설명한 대로 셀을 설정 하 고 설명된27분석.<ol>
<li>측정을 먹어서 구슬의 노란-녹색 구슬 세척 하 고 같이 cytometry 준비 하기 전에 1 h 5 x 107 구슬/mL (1.75, 2 μ m) 또는 1 x 108 구슬/mL (1, 1.5 μ m)의 최종 농도에 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 표시 추가 3.3 섹션입니다. 525 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다. 참고: 높은 농도 세포 분리 이어질 것입니다.</li>
		<li>박테리아의 식 균 작용을 측정, 텍사스-레드 분류 대장균 bioparticles 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry 준비 하기 전에 섹션 3.2 ~ 1 x 108 박테리아/mL 1 h에에서 설명 된 대로 추가 합니다. 610 nm 채널 또는 유사한, 자극 하는 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

다른 방법으로 유체 통풍 관을 평가 하는 낮은 처리량, macropinocytosis, 막 통풍 관의 높은 처리량 측정을 허용 하는이 방법에서는, 중요 한 단계는 제자리에서 세포와 세포를 분리 하려면 나트륨 아 지 드를 사용 하 여 세척 또는 Dictyostelium에 의해 식 균 작용입니다. 세포 표면에 부착 하 고 매체 아니다, 그들은 그들 주위 매체 처음 던져진 동안 왼쪽 연결 하 고 버퍼에 침수에 의해 변경 고 다시 던져진. 나트륨 아 지 드, 셀룰러 ATP 고갈 시킨다 고 막30depolarizes, 세포를 분리 하는 데 사용 하 고 또한 세포 생존24를 영향을 주지 않고 exocytosis를 방지 합니다.
이유 왜 특정 스트레인 또는 조건 변경 유체 통풍 관을 확립 유체 통풍 관의 매우 정확 하 게 측정을 매우 신속 하 게 준다 cytometry macropinocytosis Dictyostelium 에 의해 측정을 사용 하 여 추가 조사를 사용 하 여 현미경 검사 법은 필요한24. 또한 주목 해야 한다 그 이전에 게시 결과, 경우에 따라 표시 유체 이해에 차이 (이 경우) 처럼 표면에 성장 하는 돌연변이 체 긴장에 의해 또는 서 스 펜 션 (표준 프로토콜)로31떨고. 이 메서드를 사용 하는, 드문 경우에, 명백한 유체 글귀 결함 보고는 의미 합니다. 또한, 식 균 작용을 측정할 때 입자의 낮은 농도 에서만 사용할 수 있습니다. 먹어서가이 기법으로 판별할 수 있는 최대 속도 여전히 긴장과 조건24사이 식 균 작용에 관련 된 차이 측정 가능 하지만 실제 최대 보다 훨씬 이다. 식 균 작용의 최대 속도 확인 하려면 통풍 관 대체 프로토콜27에 의해 정지를 떨고에 측정 해야 합니다. 그래서이 수정 해야 합니다에 따라 교류 cytometer 설정할 때 셀 비즈를 phagocytosed 측면 분산형, 증가 했다.
그러나 Cytometry 포유류 세포32에서 유체 이해를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 그리고 액체의 더 높은 비율 단계 이해 다른 endocytic 경로 의해 Dictyostelium 에서 보다는 관심사. 또한, 세포는 더 내 면된 dextran의 endocytic 진행 수 있도록 37 ° C에서 트립 신을 사용 하 여 분리 일반적으로. 얼음 처럼 차가운 나트륨 아 지 드 표면 (윌리엄스, 관찰 되지 않은),이 기술을 더 최적화 없이 포유류 세포에 적용 되지 않습니다 만들기에서 분리 하는 세포를 발생 하지 않습니다.
Macropinocytosis의 높은 처리량 측정 Dictyostelium 세포에 억제제, 유전자 변이 또는 유전자 최저의 효과 대 한 신속 하 고 저렴 하 게 화면에 사용 될 가능성이 있다. 돌연변이 직접 부모에 비해 항상 한다. 독자는 Dictyostelium 스트레인에 대 한 기본 설정이 없습니다 이전, DdB 등 NC4 비 axenic 긴장 더 "야생-타입" axenic 것 들 보다는 하 고 axenic 긴장33으로 효과적으로 조작할 수 있습니다. 그렇지 않으면, Ax2 긴장 되는 axenic는 적은 게놈 중복34, 동안 a x 4의 많은 변종 중부 A 녹아웃 해야와 긴장 피해 가능 하면23. 이전에 게시 긴장 가장35Dicty 재고 센터 주문할 수 있습니다.
이 기술은 다른 조건, 저 해제 및 Dictyostelium에 의해 macropinocytosis에 돌연변이의 효과로 가능 했던 것 보다 더 큰 조사 가능성을 허용 한다.

2세포 면역에 의해 항 원 샘플링을 포함 하 여, 병원 체 항목 호스트 셀3, 암 세포 확산4 macropinocytosis에 의해 대규모 일반적인 유체 통풍 관은 여러 생물 학적 상황1, 중요 한과 프리온 질병5의 확산. 포유류 및 Dictyostelium 세포, 말라6,7, 파이 (3,4,5) P38,,910 (비록는 지질의 정확한 본질은 두11다릅니다) 활성화 Ras12,13, 그리고 활성화 된 Rac14,15 macropinocytosis에 의해 효율적인 유동성 통풍 관에 대 한 중요 하다 macropinocytic 패치는 어떻게 하는 것에 대 한 많은 의문점이 남아 있지만 형성, 조직 되 고 결국 내 면. Macropinocytosis의 보다 포괄적인 이해를의 개발을 허용 하도록 더 많은 단백질 macropinocytosis, 그리고 어떻게 그들은 다양 한 생물학 문맥에서 중요 하다의 후속 결정에 대 한 중요 한 발견 다양 한 조건에 대 한 치료 대상.
Dictyostelium macropinocytosis을 공부에 대 한 이상적인 모델 시스템입니다. 표준 실험실 긴장에 제정 macropinocytosis의 높은 수준을 의미 그 유체 통풍 관 이상 90% macropinocytosis6인. Macropinocytosis를 전적으로 macropinocytosis 때문에 유체 통풍 관의 비율은 훨씬 낮은 포유류 세포와는 달리 액체 통풍 관을 결정 하 여 측정 될 수 있습니다. Macropinocytosis는 너무 잘 정의 하 고이 시스템에 쉽게 시각된12 마찬가지로 조사에 대 한 뚜렷한 장점을 핵심 보존된 구성 요소는 macropinosome의 다른 시스템에 제공 여러 규제 신호 될 수 있습니다 16 , 17.
포유류 세포에 의해 macropinocytosis를 측정 하는 데 사용 표준 기법 dextran 긍정적인 소포18차지 하는 셀의 영역을 결정 하는 현미경 뒤 짧은 기간 동안 dextran와 펄스 후 세포를 고정 한다. 그러나이 기술은 macropinosomes Dictyostelium19에 보고 되었습니다 하 고 내 면 볼륨을 의미 하는 셀의 단일 평면 고려만 셀을 입력 시 축소의 가능성에 대 한 고려 하지 않습니다. 명확 하지 않습니다. Macropinosomes는 주어진된 시간에, 내 면의 수를 계산의 대체 기술,20같은 단점이 있다. Dictyostelium 를 사용 하 여 이러한 문제를 피할 수 그러나, Dictyostelium 에 의해 유체 통풍 관 측정에 대 한 기존 기술을 상대적으로 노동 집약, 대형을 사용 하 여 셀 및 dextran21양의 있습니다. 셀은 형광 dextran 및 예제는 fluorimeter를 사용 하 여 내 면된 형광의 결정에 대 한 다양 한 시간 지점에서 제거에 높은 밀도에서 동요. 이 낮은 처리량 남아 있지만 cytometry 얻을 인구 수준, 해상도22, 보다는 오히려 단일 셀에 의해 셀이 방법이으로 준비를 분석할 수 있습니다.
여기, 형광 dextran 레이블로 사용 하 여 내 면된 유체 측정 표준 기술을 96 잘 접시 형식에 적응 cytometry 높은 처리량 샘플링 (HTS) 첨부 파일을 사용 하 여 분석 하는 샘플입니다. 셀 시간, 얼음 처럼 차가운 버퍼에 침수에 의해 세척 하 고 5mm 나트륨 아 지 드, exocytosis 중지를 사용 하 여 분리의 미리 정해진 길이 아닌 quenchable 형광 dextran은 먹인 다. 각 잘에서 셀 다음 cytometry에 의해 분석 된다. 이 방법은 위의 방법의 한계를 극복 하 고 적은 리소스를 사용 하 여 관련된 노동 감소 하는 동안 긴장/조건 다 수의 유체 통풍 관의 동시 비교를 허용 하도록 설계 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>LSR_II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences-Other</td><td></td> <td>유세포 분석기도 이 역할을 수행할 수 있습니다(예: BD</td></tr><tr><td>TRITC-dextran (155 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287</td><td>기타 담금질 성 dextrans 및 기타 크기의</td></tr> LSRFortessa는 <tr><td>HL5 매체</td><td>Formedium</td><td>HLGCFG</td><td></td></tr><tr><td>96-well 조직 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>모든 평평한 바닥 조직 배양 처리 된 96 웰 플레이트는</td></tr><tr><td>Dihydrostreptomycin sulfate</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>PHR1517</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Formdium</td><td>AMP50</td><td></td></tr>, <tr><td>Kanamycin monosulfate</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr>, <tr><td>Sodium azide</td>, <td>VWR</td><td>103694M</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate hydrate</td><td>VWR</td><td>25169.295</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>VWR</td><td>1.02382.0250</td><td></td></tr><tr><td>포프샤트 이수소</td><td>칼륨 VWR</td><td>1.04877.1000</td><td></td></tr><tr><td>인산수소 이수소 칼륨</td><td>VWR</td><td>1.05104.1000</td><td></td></tr><tr><td>형광계</td><td>Perkin-Elmer</td><td>LS 50 B</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Thermofisher</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>플루오레브라이트 YG-카르복시 마이크로스피어 1.00 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &micro; m</td><td>Polysciences</td><td>09719-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy 마이크로스피어 1.75 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>17687-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy 마이크로스피어 2.00 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>09847-5</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red E. coli bioparticles</td><td>Thermofisher</td><td>E2863</td><td></td></tr><tr><td>Flow-set fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607007</td><td>Calibration Beads</td></tr><tr><td>SM 한천</td><td>Formedium</td><td>SMACFG</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m 주사기 필터</td><td>Elkay Laboratory Products</td><td>E25-PS22-50S</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 폴리스티렌 튜브</td><td>Corning</td><td>352058</td><td>유세포 분석기에 맞는 튜브를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>70 &마이크로; m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>반복 피</td>펫 <td>Eppendorf</td><td>M4-SK</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 반복 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30089650</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>70920</td><td></td></tr><tr><td>노코다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1404-2MG</td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry 여 dictyostelium discoideum macropinocytosis의 높은 처리량 측정

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis에 의해 대규모 일반적인 유체 통풍 관은 특정 암 세포, 항 샘플링, 호스트 세포 내 습 및 신경 퇴행 성 질환의 확산의 확산에 대 한 중요 하다. Dictyostelium discoideum 아메바의 일반적으로 사용 되는 실험실 긴장 매우 높은 유체 흡수 속도 영양소 매체, 90% 이상의 이다 macropinocytosis 때문에 성장 하는 때 있다. 또한, 많은 포유류 macropinocytosis의 알려진된 핵심 구성 요소 macropinocytosis를 공부 하는 우수한 모델 시스템을 만드는 존재도 있습니다. 여기, 형광 dextran 레이블로 사용 하 여 내 면된 유체 측정 표준 기술을 96 잘 접시 형식에 적응 cytometry 높은 처리량 샘플링 (HTS) 첨부 파일을 사용 하 여 분석 하는 샘플입니다.
셀 시간, 얼음 처럼 차가운 버퍼에 침수에 의해 세척 하 고 5mm 나트륨 아 지 드, exocytosis 중지를 사용 하 여 분리의 미리 정해진 길이 아닌 quenchable 형광 dextran은 먹인 다. 각 잘에서 셀 다음 cytometry에 의해 분석 된다. 메서드 또한 막 통풍 관 및 형광 구슬 또는 박테리아의 먹어서 측정 적용할 수 있습니다.
이 메서드는 높은 처리량, 노동 및 리소스 효율적인 방식으로 Dictyostelium 에 의해 유체 통풍 관의 측정을 허용 하도록 설계 되었습니다. 그것은 여러 변종 (예: 녹아웃 유전자의 돌연변이)의 동시 비교를 허용 한다 (예: 다른 미디어에서 세포 또는 억제제의 다른 농도로 처리) 병렬에서 시간 과정을 단순화.

일단 기술 수행을 셀 dextran 로드 되며 분석 (그림 1)에 대 한 준비 흐름 cytometer는 차단 되지 않습니다 확인 하 고 그림 2A에 표시 된 셀 처럼 앞으로 분산형/사이드 분산형 프로 파일을 조정. 컴퓨터 차단 되 면 그림 2B에 표시 하는 것을 볼 것 이다 하 고 계속 하기 전에 차단 해야. 매개 변수 표시 제어 axenic 세포는 긴 시간 지점에서 높은 내 면된 dextran 형광 및 짧은 것 들에서 낮은 내 면된 형광을 확인 (그림 2C).
돌연변이 차이점을 찾고, 그것은 가능성이 있을 것 세 가지 고기 중 하나입니다. 돌연변이 정상적인 유체 이해를 할 수 있습니다., 그들은 부분적인 결함을 가질 수 있습니다. 또는 유체 통풍 관을 완전히 폐지 될 수 있습니다. 표준 실험실 긴장 Ax2, 돌연변이 50% 감소 유체 글귀 (Ax2 rasG-14)이 경우 그림 2D 표시 정상적인 유체 글귀와 스트레인 고 하나 폐지 유체 글귀 (Ax3 gefB-28). 평균 평균 유체 통풍 관 (섹션 3.5)를 가져오고 ( 그림 3B)와 같이 내 면 액체의 볼륨을 계산 하거나 컨트롤에 데이터를 비교 하 여 그것을 사용 하 여 ( 그림 4B 에서 것과 같이 그리고 4 C).
그림 3A와 같이 유체 이해 시간 과정을 수행할 때 내 면된 형광 60-90 분, 후는 dextran exocytosed 될 시작 증가 한다 고 고원 (그림 3B)에 도달 하면. 표준 시간 포인트 60 분 사용 하는 좋은 신호를 얻을 수 있습니다 따라서 다른 돌연변이/조건에서 macropinocytosis를 비교 하 고 신호가 손실 exocytosis. 뮤턴트 exocytosis 방해 심각 고원29를 도달 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.
대부분의 경우에 높은 억제 물 농도에 거의 아무것도에 아래로 갈 것 이다 때 치료 세포 Dictyostelium ( 그림 4A에서최대 설정)에서 macropinocytosis에 대 한 효과적인 억제제로 1 시간에 내 면 dextran (그림 4B)입니다. 그러나 일부 억제제 100% 효과가 되지 않을 수 있습니다,, 예를 들면 nocodazole만 심하게 추가 될 때 macropinocytosis에 의해 유체 통풍 관의 50%까지를 억제 (그림 4C). 억제제는 효과가 있다면, 셀 컨트롤로, dextran의 비슷한 금액을 internalize 것입니다 그리고 형광 감소 표시 되지 않습니다. 이 기술은 억제제 치료를 최적화 소요 된 시간을 줄이고 다른 억제제와 억제 물 농도 매우 신속 하 게, macropinocytosis에 의해 유체 통풍 관에 영향에 대 한 상영 될의 큰 범위 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> 그림 2: 흐름 cytometer 및 대표 데이터의 설정. (A) 셀을 쉽게 구분할 수 있도록 앞으로 산포 (FSC) 및 셀 측면 살포 (SSC) 프로 파일을 설정 해야 합니다. Ax2 셀 모양을의 예가 표시 됩니다. (B) 교류 cytometer 차단 된 경우,이 예제와 같이 셀 매우 낮은 측면 분산형이 있다. 레이저는 fluorophores을 제대로 자극 하지 것입니다 그리고 기계 되어야 하지 차단 된 계속 하기 전에. 기계를 차단 하는 동안 얻은 모든 데이터를 폐기 해야한다. (C) 형광 설정 해야 0 분 이해 예제는 셀에 대 한 인 큐베이 팅 되었습니다 때 낮은 형광 형광 매체에 더 이상 201824윌리엄스 및 케이에서 가져온이 예제와 같이. (D) 예 정상 macropinocytosis (Ax2, 녹색)으로 1 시간에 대 한 TRITC dextran와 인 큐베이 팅 하는 셀의 macropinocytosis (Ax2 rasG-, HM172614, 오렌지)을 감소 하 고 macropinocytosis (Ax3 gefB-폐지 HM177628, 블루)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> 그림 3: 96 잘 접시에서 액체 이해 시간-과정을 수행. (A) Dextran 추가 해야 샘플의 각 집합에 순차적으로, 동일한 끝 시간. 다음 우물을 세척, 분리 하 고, cytometry에 의해 내 면된 형광을 측정. 예 배는 dextran을 추가 하려면 여기에 표시 됩니다. (B) 유체 이해 시간-과정 Ax2 셀의 96 잘 접시에서 수행합니다. 윌리엄스 &amp; 케이에서 가져온 201824, 오차 막대 표시 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> 그림 4: 유체 글귀 복용량 응답 곡선. (A) 의,이 경우는 PI3K 억제제 LY294002, HL5 1 mg/mL TRITC-dextran 이중 원하는 최종 최대 농도에서 포함 된 화합물을 추가. HL5 성장 매체 + 1 mg/mL dextran 차량 조건 당 200 µ L 매체의 희석 시리즈를 생성 하기 위해 다양 한 비율에서 혼자 포함 믹스. 세척 하 고 내 면된 형광을 측정 하기 전에 웰 스 1 h에 정상적으로 추가 합니다. ((B)) Ax2 세포 A에서 LY294002 포함 된 매체와 인 큐베이 팅에 대 한 유체 글귀 복용량 응답 곡선. 윌리엄스 &amp; 케이 201824에서 적응. 유체 통풍 치료 컨트롤에 정규화 됩니다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차를 표시. ((C)) Ax2 세포는 nocodazole와 인 큐베이 팅에 대 한 유체 글귀 복용량 응답 곡선. 윌리엄스 &amp; 케이 201824에서 적응. 유체 통풍 치료 컨트롤에 정규화 됩니다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차를 표시. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Macropinocytosis, 대규모 일반적인 유체 이해, 임상 생물학 면역학, 감염, 암, 및 신경 퇴행 성 질환 등의 많은 분야에서 중요 하다. 여기, 기존 기술을 높은 처리량, 단일 셀 해상도 macropinocytosis 모델 유기 체 Dictyostelium discoideum 를 사용 하 여 macropinocytosis의 측정 cytometry 흐름 수 있도록 적응 되었습니다.

Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

이 방법은 특정 유전자, 단백질 또는 분자 경로가 거대세포증가증에 관여하는지 여부와 같은 딕티오스텔리움(Dictyostelium) 및 거대세포증가증(macropinocytosis) 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시간, 유전적 돌연변이, 억제제 농도 및 배지 구성과 같은 많은 변수를 병렬로 테스트할 수 있어 단일 세포 해상도를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 박테리아가 있는 SM 한천에서 배양된 세포를 얻습니다.공급 전선에서 50ml 원심분리 튜브에서 25ml의 KK2 버퍼로 세포를 수확합니다. 튜브를 소용돌이쳐 세포를 해리시키고 300G에서 3분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 상등액을 버리고 펠릿을 50ml의 새 KK2 완충액에 재현탁합니다.원심분리하여 상층액을 제거하고 세척할 때마다 50ml의 KK2 완충액에 재현탁하여 이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 혈구계 또는 기타 세포 계수 장치를 사용하여 세포 밀도를 결정합니다. 항생제를 포함하는 HL5 매체로 세포를 100의 농도에 희석하십시오, 밀리리터 당 000의 세포.각 조건에 대해 3개의 웰을 사용하여 바닥이 평평한 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 희석된 세포 용액 50마이크로리터를 피펫팅합니다. 섭씨 22도에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 사용된 배지에서 TRITC-dextran을 밀리리터당 1밀리그램으로 희석합니다.각 웰에서 밀리리터당 0.5밀리그램의 최종 TRITC-덱스트란 농도를 얻기 위해 각 웰에 50마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 22도에서 1시간 동안 배양합니다. 유세포 분석을 위한 세포 준비를 시작하려면 50마이크로리터의 덱스트란 함유 배지를 0분 업데이트 대조군에 추가합니다.다음으로, 플레이트에서 매체를 디캔팅하고 티슈를 두드려 건조시킵니다. 플레이트를 얼음처럼 차가운 KK2 버퍼에 담가 세척한 다음 플레이트에서 버퍼를 디캔팅합니다. KK2MC에 용해된 얼음처럼 차가운 5밀리몰의 아지드화나트륨이 포함된 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.Text Protocol에 설명된 대로 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 유체 업데이트를 측정합니다. 앞서 설명한 대로 각 균주 및 상태에 대해 3개의 웰이 있는 바닥이 평평한 새로운 96웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 일반적인 시간 코스의 경우 유체 흡수량을 0, 30, 60, 90, 120 및 180분으로 측정하도록 계획하십시오.50마이크로리터의 덱스트란 라벨링 배지를 180분 시점 웰에 추가합니다.60분 후 덱스트란 라벨링 배지를 120분 시점 웰에 추가합니다. 전체 플레이트에 대해 이와 같이 매체를 순차적으로 계속 추가합니다.0분에서 50마이크로리터의 덱스트란 함유 배지를 0분 대조군 웰에 추가합니다. 그런 다음 즉시 매체를 디캔팅하십시오. 플레이트를 얼음처럼 차가운 KK2 버퍼에 담가 세척한 다음 플레이트에서 버퍼를 디캔팅합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유세포 분석을 사용하여 플레이트를 분석합니다. 앞서 설명한 대로 각 균주 및 상태에 대해 3개의 웰이 있는 바닥이 평평한 새로운 96웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 덱스트란을 함유하는 배지를 제조합니다.이 배지를 사용하여 관심 화합물을 원하는 최대 최종 농도의 두 배인 농도로 희석합니다. 그런 다음 차량의 동일한 비율로 덱스트란을 함유한 배지가 있는 두 번째 튜브를 준비합니다. 와류로 두 솔루션을 혼합합니다.이러한 용액을 사용하여 샘플당 200마이크로리터의 덱스트란 함유 배지에서 관심 화합물의 희석 계열을 생성합니다. 볼텍싱으로 각 샘플을 혼합합니다. 이 배지 50마이크로리터를 각 샘플 웰에 추가합니다.1시간 후 플레이트에서 매체를 디캔팅합니다. 플레이트를 얼음처럼 차가운 KK2 버퍼에 담가 세척한 다음 플레이트에서 버퍼를 디캔팅합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유세포 분석을 사용하여 플레이트를 분석합니다.대표적인 유세포 분석 데이터는 세포분석기가 차단되지 않고 세포의 전방 산란 및 측면 산란 프로파일이 적절하게 설정되면 세포를 쉽게 구별할 수 있음을 보여줍니다. 돌연변이 간의 차이점을 찾을 때 세 가지 표현형 중 하나가 있을 가능성이 높습니다. 돌연변이는 정상적인 유체 흡수를 가질 수 있고, 부분적인 결함이 있을 수 있으며, 유체 흡수가 완전히 폐지될 수 있습니다.평균 중앙값 유체 흡수는 내재된 유체의 부피를 계산하는 데 사용됩니다. 유체 흡수 시간 과정에서는 내재화된 형광이 60-90분 동안 증가합니다. 그 후 dextran은 exocytosed되기 시작하고 고원에 도달합니다.평균 중앙값 유체 흡수는 거대세포증가증에 효과적인 억제제로 세포를 치료할 때와 같이 대조군과 데이터를 비교할 때도 사용됩니다. 처리된 세포에서 1시간 내에 내재화된 덱스트란은 감소하는 것으로 보이며 더 높은 억제제 농도에서는 거의 0으로 떨어집니다. 모든 억제제가 완전히 효과적인 것은 아니며, 예를 들어 노코다졸(nocodazole)은 거대세포작용(macropinocytosis)에 의한 체액 흡수를 최대 50%까지만 억제합니다.이 절차에 따라 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 특정 조건에서 유체 흡수가 다를 수 있는지 여부, 예를 들어 거대세포증가증이 감소한 세포가 더 적거나 더 작은 거대피노좀을 만드는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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연구

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Biology

생물학

이 비디오는 인간 백혈구에 의한 FITC 표지 병원성 진균 포자의 식세포작용을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 식세포작용된 포자는 counterstaining을 통해 세포 부착 포자에서 식별한 후 유세포 분석을 수행합니다.

인간 식세포에 의한 Fungal Spore Phagocytosis의 정량적 유세포 분석 측정

이 동영상은 생쥐의 눈에서 유리체강내 전달 후 형광 생체 입자의 미세아교세포 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석을 보여줍니다. 유세포분석법은 CD11b를 발현하는 살아있는 세포를 검출하고 녹색 형광을 보이는 식세포 미세아교세포를 Ly6C 발현 단핵구 및 Ly6G 발현 호중구를 포함한 다른 골수성 세포와 구별합니다.

유세포 분석을 사용한 유리체 내 전달 형광 입자의 미세아교세포 흡수 측정

이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

여기는 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 평가 하기 위한 방법에 설명 합니다. 현미경 기반 분석 결과에서 우리 전단 흐름 간략 한 자극에 따라 붙일 표시 된 바이오 센서의 지역화를 검사 합니다. 우리는 또한 화학적 심각한 기계적인 자극에 응답에 대 한 관심의 다양 한 단백질의 활성화를 테스트합니다.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

멀티웰 마이크로플레이트를 사용하는 자동화된 해석은 단일 실험에서 다양한 조건의 평가를 허용함으로써 경로 조절기관을 식별하는 데 유리한 접근 방식입니다. 여기에서는 잘 확립된 매크로피노솜 이미징 및 정량화 프로토콜을 96웰 마이크로플레이트 형식으로 조정했으며 멀티 모드 플레이트 판독기를 사용하여 자동화를 위한 포괄적인 개요를 제공합니다.

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

학습하세요 Dictyostelium discoideum에서 유세포측정법을 이용한 고처리량 거대세포음식작용 측정 방법입니다. 이 기술은 유전자 돌연변이와 억제제 농도의 영향을 단일세포 수준에서 분석하여 면역학 및 암 연구에 활용됩니다.

Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정

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