질병 모델링에 대 한 인간의 3D 폐 조직 문화 (3D-Ltc)의 생성
2019년 2월 12일
여기, 우리는 생물 학적 및 생물 의학 연구에 모델 인간의 폐 질병에 3D 폐 조직 문화를 생성 하는 데 적합 한 절제 환자 조직에서 인간의 정밀 컷 폐 agarose 가득 조각의 준비에 대 한 프로토콜 제시.
이 방법은 잠재적인 치료로 주요 실험실 사실 인정의 번역을 위한 자연적인 3D 구조 및 조성에 있는 살아있는 인간 조직의 조사를 허용합니다. 이 기술은 특히 개별 사망한 환자 폐 조직 견본의 시각화를 위해 외과적으로 제분되거나 이식된 인간 폐 조직에서 조직 배양의 생성을 가능하게 합니다. 질병없는 폐 조직은 높은 현면적 해결에서 초기 병기 메커니즘의 분석을 가능하게 폐 질환 ex vivo를 모델링하기 위해 3D 조직 배양으로 사용할 수 있습니다.
먼저 정초된 폐 샘플을 멸균 15센티미터 배양 접시에 15밀리리터의 재배 배지에 넣고 티슈 페이퍼로 덮인 멸균 금속 트레이에 넣고, 30밀리리터 주사기를 섭씨 42도 낮은 융점 아가로즈로 채웁니다. 주변 정맥 카테터에서 외고를 제거하고 카테터를 30 밀리리터 주사기에 부착합니다. 조직의 손상되지 않은 부분에서 환기 조직에서 0.5 ~ 3 mm 직경의 기관지인 기관지와 가능한 한 기관지에 카눌라를 부드럽게 삽입합니다.
집게를 사용하여 카누라 주변의 기관지 벽을 압축하여 인접한 폐 동맥을 동시에 고정하고 카눌라 주변의 기관지를 밀봉하고 수술 용 클램프를 사용하여 아가로즈 누출을 방지하십시오. 다음으로, 포셉을 사용하여 배양 접시에서 폐 조직을 들어 올리고 주사기를 사용하여 카누라를 통해 아가로스를 수동으로 전달하며 초당 0.3 밀리리터보다 빠르지 않습니다. 폐 조직이 조직을 과도하게 팽창하지 않고 완전히 채워지면 즉시 카눌라를 제거하고 기관지클을 고정하십시오.
아가로즈 고형화를 용이하게 하기 위해 30분간 배양 배지에 있는 조직을 침수하고, 추가 적인 기관지 개구부를 위한 아가로즈 충진 절차를 반복한다. 그런 다음 아가로즈로 채워진 폐 조직 섹션을 섭씨 4도 에 슬라이스 할 때까지 저장합니다. 정밀 절단 폐 슬라이스의 경우, 세포 배양 접시의 바닥에 핀셋으로 부드럽게 누르면 붕괴되지 않는 폐 조직 내에서 고체 아가로즈 채워진 영역을 식별합니다.
1~1.5입방센티미터 블록을 단단히 채운 부위의 한쪽은 여전히 흉막으로 덮여 있고, 시아노아크라일레이트 접착제를 사용하여 각 조직 블록의 복수면을 진동홀더에 부착한다. 조직의 단지 2 ~ 3 마일로미터가 슬라이스 남아있을 때까지, 긴 조직 블록을 통해 전체 방법을 슬라이스. 집게를 사용하여 각 500 마이크로미터 섹션을 재배 매체를 함유하는 12웰 플레이트의 1웰로 이송하여 얻어진다.
모든 조직이 단면되었을 때, 각 우물에서 개별 10센티미터 배양 요리로 샘플을 옮기고 정밀 절단 폐 슬라이스의 상부 표면에 4밀리미터 생검 펀처를 직교로 배치합니다. 그런 다음, 시계 방향으로 및 반시계 방향으로 회전하여 펀처를 이동시키고 폐 샘플의 조직 펀치를 얻습니다. 그들은 얻을로 96 웰 플레이트의 개별 우물에 신선한 세포 배양 배지에 각 펀치를 배치.
모든 조직 펀치를 얻을 때, 최대 5 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 인간 3-D 폐 조직 배양에서 면역형광을 사용하여 세포 핵에서 섬유네크틴의 면역 라벨링은 보존된 폐포 구조 ex vivo의 이미징을 허용한다. 인간 정밀 절단 폐 슬라이스 펀치를 48 시간 동안 섬유질 사이토카인 칵테일으로 처리하면 섬유증관련 세포외 매트릭스 구성 요소, 콜라겐 타입 원 및 섬유 넥틴 유전자의 중요한 유도를 포함하여 인간 폐 3-D 조직 배양에서 섬유증과 같은 변화가 발생합니다.
추가적으로, 중간엽 마커 vimentin의 단백질 수준은 3-D 폐 조직 배양 펀치의 처리 후에 4명의 환자 중 3에서 위로 통제됩니다. 이러한 절차에 따라, 정량적 실시간 PCR에 의한 RNA 분석, 또는 서양 블로팅에 의한 단백질 분석과 같은 다른 방법은 조직 내에서 각각 유전자 및 단백질 발현을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 개발 후, 이 기술은 실험용 폐학 분야의 연구를 위한 길을 열어주었으며, 폐 생물학을 식히고 인간 조직 샘플에서 독성 및 약리학 연구를 수행했습니다.
살아있는 인간 조직은 잠재적으로 감염되고 개인 보호 장비 및 적절한 조직 저장, 운송 및 폐기물 취급과 같은 예방 조치를 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 기억하십시오.
개요
본 논문은 절제된 환자 조직으로부터 아가로스로 충전된 인간 정밀 절편 폐 조직을 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 절편은 생물학 및 의생명 연구에서 인간 폐 질환 모델을 위한 3D 폐 조직 배양을 생성하는 데 적합합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생의학 연구
- 폐 질환 모델링
- 3D 조직 배양 기술
배경
- 인체 폐 조직은 자연적인 3D 구조 내에서 질병을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
- 이 방법은 개별 환자의 폐 샘플을 시각화할 수 있게 해줍니다.
- 또한 높은 시공간 해상도로 초기 병리 기전을 분석하는 것을 가능하게 합니다.
- 살아있는 인체 조직의 감염성 특성으로 인해 예방 조치가 필요합니다.
연구 목적
- 3D 폐 조직 배양물을 제작하기 위한 프로토콜을 개발합니다.
- 폐 질환의 ex vivo 연구를 용이하게 합니다.
- 인체 폐 조직의 유전자 및 단백질 발현 분석을 가능하게 합니다.
사용된 방법
- 저융점 아가로스를 이용한 폐 조직 샘플 준비.
- 아가로스가 채워진 폐 단면의 정밀 절단.
- 조직 구조 시각화를 위한 면역 라벨링 기술.
- PCR 및 웨스턴 블로팅을 이용한 유전자 및 단백질 발현 분석.
주요 결과
- 사이토카인 처리 후 폐 조직 배양에서 섬유화 유사 변화 유도.
- 제1형 콜라겐 및 피브로넥틴 유전자의 발현 증가.
- 처리된 시료에서 중간엽 마커인 비멘틴의 단백질 수준 증가.
- 실험 폐과학 및 약리학 분야의 추가 연구 가능성.
결론
- 이 기술은 폐 생물학에 대한 이해를 증진시킵니다.
- 이는 독성학 및 약리학 연구를 위한 플랫폼을 제공합니다.
- 향후 연구는 더 나은 질병 모델링을 위해 이 방법을 기반으로 발전할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
정밀 절편 폐 슬라이스(precision-cut lung slices)에서 유도된 인간 3D 폐 조직 배양은 실제 인간 조직 구조 내에서 질병 메커니즘과 약물 반응을 연구할 수 있는 생리학적으로 유의미한 ex vivo 모델을 제공합니다. 이 접근 방식은 개별 환자의 질환 조직 또는 종양 주변 폐 샘플에서 화합물의 효과를 직접 평가함으로써 타겟 검증 및 기전적 리스크 감소를 지원합니다. 또한, 이 모델은 세포 다양성, 세포외 기질 구성 및 중개 연구의 관련성에 중요한 생체 역학적 특성을 유지함으로써 전임상 평가의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 3D 구조와 세포 유형의 다양성이 보존된 온전한 인간 폐 조직에서 치료 가설을 검증할 수 있습니다.
- 운용적 가치: collagen Type I 및 fibronectin과 같은 섬유화 관련 바이오마커의 약물 유도 변화를 측정함으로써 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 과학적 가치: 질병 관련 인간 조직 내 초기 병리 기전의 시공간적 분석을 통해 경로 규명을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 멀티웰 플레이트 기반의 화합물 스크리닝에 적합한 표준화되고 재현 가능한 조직 펀치를 생성합니다.
- 운영적 가치: 면역형광법, qPCR 및 웨스턴 블로팅을 통해 용량-반응 및 시간 경과 분석을 위한 정량적 판독을 가능하게 합니다.
- 과학적 가치: 생검 펀칭을 통해 제한된 환자 샘플로부터 조직 수율을 높여, 분석의 확장성과 반복 능력을 향상시킵니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 정밀 절편 폐 조직(precision-cut lung slices)에서 사이토카인으로 유도된 섬유화 유사 변화를 이용하여, 세포하 수준에서 인간 특이적 섬유화 과정을 모델링합니다.
- 운영적 가치: in vivo 연구 이전에 인간 조직 내에서 표적 결합 및 작용 기전을 평가할 수 있는 질환 관련 시스템을 제공합니다.
- 과학적 가치: 분자적 판독값과 조직 수준의 기능적 결과 사이의 상관관계 분석을 가능하게 하여 중개 바이오마커의 정렬을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 타겟 가설 검증부터 리드 물질 발굴, 전임상 검증에 이르는 발견 연속체에 부합하며, 인체 조직 반응을 기반으로 한 반복적인 최적화를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 온전한 인간 폐 절편에서 폐포 구조와 세포 반응의 시각화를 가능하게 하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 96-웰 포맷의 화합물 라이브러리 스크리닝을 위해 일관된 크기와 생존력을 가진 분석 준비 완료된 조직 펀치를 제공합니다.
- 분석: 유전자 발현(qPCR), 단백질 수준(western blot) 및 구조적 이미징(immunofluorescence)을 포함한 다중 분석 판독을 통해 처리 조건을 비교할 수 있게 합니다.
- 중개 연구: 인간 조직의 복잡성을 유지하고 환자 층화 반응 분석을 가능하게 함으로써 발견 연구와 전임상 연구 사이의 가교 역할을 합니다.
- 기업적 재사용: 여러 프로젝트와 치료 영역에 걸쳐 적용할 수 있는 폐 질환 모델링을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 인간 폐 조직을 직접 사용하여 종 간 번역 격차를 줄임으로써 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 아가로스 매립 및 정밀 절편 제작을 통해 조직 준비 과정을 표준화하여, 사용자 및 사이트 간 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 인간 조직 기반의 초기 효능 및 독성 신호를 제공하여 go/no-go 결정에 근거를 제시합니다.
- 포트폴리오 영향: 질환 또는 종양 주변 인간 폐 샘플에서의 기전적 효과를 바탕으로 화합물의 리스크 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 인체 조직 취급, 무균 기술 및 바이브라톰(vibratome) 기반 절편 제작에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 외과적으로 절제된 폐 조직과 구조 보존을 위한 저융점 아가로스(low melting-point agarose)의 확보가 필요합니다.
- 살아있는 인체 조직의 감염 가능성으로 인해 표준화된 배양 조건과 오염 제어가 필수적입니다.
- 반복 실험 간 샘플의 균일성을 보장하기 위해 생검 펀치 크기와 회전 기술의 최적화가 수반됩니다.
- 조직 생존 가능 시간의 제한이 있으므로, 절제 후 신속한 처리와 배양 시작이 필요합니다.
