Name: 골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 학습하세요 골수세포에서 MALT1 파라카스파제 활동이 선천성 면역 신호전달을 선택적으로 조절하는 메커니즘을 인간 및 마우스 모델을 통해 분석하는 방법을. 사이토카인 생성 조절 연구에 활용됩니다.

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우리에 대 한 그들의 허가 (면허 번호 4334770630127) Unterreiner 그 외 여러분 에서 여기 그림 2A 를 재현 하는 Elsevier 감사 (2017)입니다.

실험 지침 및 노바 티 스 인간의 연구 윤리 위원회의 기준에 따라 실시 했다.
1. 인간의 버 피 코트에서 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)의 준비
참고: 우리 컬렉션, 50 mL 가방에서 후에 1 일 건강 한 지원자에서 버 피 코트를 받았다. 그들은 동의에서 제공 하 고 Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz통해 수집 했다. 우리는 다르게 지정 하지 않는 한에 실 온에서 아래 절차를 사용 하 여 처리 합니다.
<ol><li>가 위 (아래 lamina 흐름) 비닐 봉지 1 리터 비 커의 살 균 하 고 깨끗 한 쌍을 준비 합니다.</li>
	<li>비 커에 버 피 코트를 전송 하 고 신중 하 게는 위.</li>
	<li>25 mL 피 펫을 사용 하 여 추가 100 mL의 인산 염 버퍼 염 분 버퍼/ethylenediaminetetraacetic 산 (PBS/EDTA: PBS 1 x pH 7.4 아니 CaCl2 및 없음 MgCl2, 보충 2 mM EDTA pH 8.0). 참고: 동일을 사용 하 여 플라스틱 그리고 pipetting 솔루션을 위아래로 천천히, 후 미리 가득 다 당 류 기반 밀도 기울기의 15 mL 50 mL의 6 원뿔 원심 분리기 튜브 25 mL 희석된 버 피 코트의 분배.</li>
	<li>적당 한 가속 (4 개의 9 설정) 800 x g 20 분 원심 브레이크를 그들의 밀도에 따라 세포의 분리에 대 한 허용 없이. 참고: 원심, 후 3 개의 레이어를 볼; 수 있습니다. 적혈구 및 granulocytes, 플라즈마, 그리고 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 포함 하는 백색 반지 사이 하는 상위 계층을 포함 하는 펠 릿.</li>
	<li>PBMC 링 10 mL 피 펫 및 새로운 50 mL 튜브에 사용 하 여 수확. 참고: 2 ~ 3 50 mL 튜브는 일반적으로 버 피 코트 당 필요 합니다. 이 단계에서 일부 플라즈마 가능성이 오염 후속 농축 단계에 영향을 주지 않습니다 있어야 수집된 PBMCs.</li>
	<li>최대 50 mL PBS/EDTA를 사용 하 여 모든 튜브 탑 하 고 감소 하는 원심 분리 시간 및 속도 (520 g, 330 x g에서 10 분, 150 x g8 분 x 15 분)와 함께 3 연속 세척을 진행 합니다. 참고: 각 단계에서 액체 폐기물 컨테이너에는 상쾌한 떨어져 부 어 있으며 셀 펠 렛 50 ml PBS/EDTA의 resuspended (펠 릿 첫 세척 후 풀링된 수 있습니다).</li>
	<li>최종 세척 후 얼음 세포의 용 해 버퍼의 25 mL에 있는 펠 릿 resuspend ( 테이블의 자료참조)를 삼투성 압력에 의해 붉은 혈액 세포를 lyse.</li>
	<li>솔루션 취소 될 때까지 품 어 (실 온에서 ≤ 5 분).</li>
	<li>분리 버퍼 (PBS 1 pH 7.4 아니 CaCl2 없음 MgCl2, 2% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충을 포함 하 고 1 mM EDTA pH 8.0 x) 25 mL를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>150 x g 8 분에 한 번 더 씻는 다. 참고: 이 단계에서 PBMCs 대량 인구로 사용할 수 있습니다 (3 단계 참조: PBMCs 및 monocytes 물질로 조건 및) monocyte 농축 처리 또는 (단계 2 참조: PBMCs에서 monocytes의 준비), 또는 사용에 대 한 아래로 냉동 (단계 5 참조: Monocytes 그리고 PBMCs 냉동/해 동 절차).</li>
</ol>2입니다. PBMCs에서 Monocytes의 준비
<ol><li>1.10 분리 버퍼에 단계에서 얻은 PBMCs resuspend 및 5 x 107셀/mL를 도달 하는 그들.</li>
	<li>모자와 14 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.</li>
	<li>추가 50 µ L monocyte 농축 항 체 세포 현 탁 액의 mL 당 칵테일의 소용돌이, 4 ° c.에서 10 분을 품 어 고</li>
	<li>셀의 mL 당 monocyte 농축 구슬의 50 µ L를 추가 합니다. 참고: 구슬 vortexed는 서 스 펜 션의 균질 성을 보장 하 철저 하 게 수 있어야 합니다.</li>
	<li>후 구슬, 곧 소용돌이 세포 현 탁 액을 추가 하 고 4 ° c.에서 5 분을 품 어</li>
	<li>튜브는 최대 10 mL 때까지 분리 버퍼 튜브의 위쪽 부분을 씻어.</li>
	<li>천천히 아래로 pipetting으로 솔루션을 혼합.</li>
	<li>분리 자석에 모자 없이 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>실 온에서 2.5 분 동안 품 어.</li>
	<li>15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 천천히 붓는 다.</li>
	<li>이 단계에서 직접 사용 monocytes (3 단계 참조: PBMCs 및 monocytes 치료 및 물질로 조건) 또는 나mmature 모nocyte 파생 Dendritic Cells (iMoDCs)으로 구분 (4 단계 참조), 또는 이후 사용에 대 한 그들을 내려 고정 (단계 5 참조).</li>
</ol>3. PBMCs 및 Monocytes 치료 물질로 조건
<ol><li>셀의 개수와 문화 매체에서 그들을 희석 (로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 10 %FBS + 1mm 나트륨 Pyruvate + 100 U/mL 페니실린 스 (펜/Strep) 5 µ M β-mercaptoethanol), 104 셀/잘 x 1.25까지.</li>
	<li>384-잘 접시의 당 세포 현 탁 액의 30 µ L를 배포 합니다.</li>
	<li>4 집중된 복합 솔루션 x 15 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 사전 품 어.</li>
	<li>10 ng/mL의 최종 농도에 lipopolysaccharide (LPS)를 추가 또는 zymosan (DZ) 100 µ g/mL의 최종 농도에 소진 하거나 일반 매체에 계속.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.</li>
	<li>분 비 되는 TNF 수준을 측정 하는 상쾌한의 10 µ L를가지고 (단계 7를 참조 하십시오: Cytokines 및 생존 능력 측정).</li>
</ol>4. iMoDCs와 물질로 조건 monocytes 분화
<ol><li>Monocytes (단계 2에서 농축)을 계산 하 고 5 분 동안 520 x g 에 세포 현 탁 액을 원심.</li>
	<li>상쾌한에서 플라스틱 및 문화 매체 추가 (RPMI + 10 %FBS 106 셀/mL x 0.4의 최종 세포 현 탁 액.</li>
	<li>80 ng/mL 재조합 인간 IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF를 추가 합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트에 잘 당 세포 현 탁 액의 5 mL을 분배.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 7 일 동안 품 어.</li>
	<li>7 일에 그들의 정품 인증 피하기 위해 부드럽게 pipetting으로 세포를 수확.</li>
	<li>5 분 동안 520 x g 에서 원심 분리기.</li>
	<li>Aspirate 진공 및 성장 인자 없이 문화 매체의 50 mL에 resuspend.</li>
	<li>520 x g 5 분에 centrifuge 고 1 x 106 셀/mL 문화 매체에서에서 resuspend.</li>
	<li>세포 현 탁 액 (105 셀)의 100 µ L 당 96 잘 플랫 바닥판의 분배.</li>
	<li>1 h 50 추가한 후 37 ° C에 대 한 사전 incubate µ L 4 x의 집중 복합 솔루션, 8 단계에서 설명한 대로 준비: 준비 화합물.</li>
	<li>9 단계에서 설명한 대로 준비 자극 (4 x 집중), 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 24 시간을 품 어</li>
	<li>96-잘 V-아래 접시에 각 잘 및 전송 셀과 상쾌한 (SN)를 혼합.</li>
	<li>475 x g 5 분에서 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>새로운 96-잘 플랫 바닥 접시에 상쾌한을 전송, 인감 및 사용까지-20 ° C에서 동결.</li>
</ol>5. monocytes 그리고 PBMCs 냉동/해 동 절차
<ol><li>
동결
	<ol>
<li>5 분 동안 520 x g 에서 PBMC 또는 monocyte 셀 준비 아래로 회전 합니다.</li>
		<li>진공은 상쾌한 발음 하 고 resuspend 1 x 107 셀/mL에서 중간에 셀.</li>
		<li>Cryotubes에 세포 현 탁 액 1 mL를 분배, 특정 냉각 장치에는 튜브를 전송 (참조 자료 테이블)-80 ° c.에 그것을 배치 하 고</li>
	</ol>
</li>
	<li>
녹고
	<ol>
<li>cryotube을 해 동 하 고 신속 하 게 문화 매체의 9 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 콘텐츠를 전송.</li>
		<li>5 분 동안 520 x g 에서 원심 분리기.</li>
		<li>Aspirate 상쾌한 진공 및 문화 매체의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 셀 더 실험적인 처리에 대 한 준비가 지금입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 마우스 비장 세포 준비 및 치료
참고: 우리는 지침과 노바 티 스 동물 복지 조직의 표준에 따라 동물 희생을 실시. 연구는 지역 정부 기관의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Kantonales Veterinäramt 더 타트 바젤). 우리는 고통을 최소화 하기 위해 만든 모든 노력 isoflurane 노출, 여 동물을 희생.
<ol><li>비장을 수확 하 고 분열 조직 기계적 조직 분쇄기 장치를 장착 하 고 가득 찬 RPMI 매체의 5 mL 튜브를 사용 하 여.</li>
	<li>분리 컴퓨터의 비장 프로그램을 사용 하 여 장기를 갈아.</li>
	<li>100 m m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 셀을 필터링 합니다.</li>
	<li>현 탁 액 50 mL 튜브 및 320 x g에서 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기로 전송.</li>
	<li>진공 aspirate는 상쾌한 차가운 세포의 용 해 버퍼의 3 mL에 셀 펠 릿 resuspend 그리고 ≤2 분 얼음에 품 어.</li>
	<li>RPMI 매체의 7 mL을 추가 하 여 세포를 중지 합니다.</li>
	<li>100 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 다시 필터링.</li>
	<li>세포 현 탁 액 330 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 아래로 회전</li>
	<li>Aspirate 상쾌한 진공 및 11 x 106 셀/mL (RPMI 보충 10 %FBS, 100 U/mL 펜/단계, 5 µ M β-Mercaptoethanol) 완전 한 매체에서에서 세포를 resuspend.</li>
	<li>플레이트 1 x 106 셀/잘 (90 µ L) 96 잘 접시 (플랫 바닥).</li>
	<li>20 x 5 µ L 집중 단계 8.3에서에서 설명한 대로 이전 RPMI 매체에 희석 복합 솔루션 추가: murine 비장 세포에 대 한 직렬 희석.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>20 x 5 µ L 집중 DZ (최종 농도 30 µ g/mL) 또는 20 배 농축 LPS + IFN-g (TLR-4) (최종 농도 1 µ M LPS 및 10 ng/mL IFN-g)를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.</li>
	<li>10 분 동안 330 x g 에서 원심 분리기.</li>
	<li>새로운 접시에 supernatants 전송, 인감 및 추가 사용까지-20 ° C에서 동결.</li>
</ol>7. Cytokines 및 생존 능력 측정
<ol><li>
HTRF (균일 시간 해결 형광)에 의해 인간 TNF를 측정 참고: 프로토콜 다음 공급 업체의 권장 사항, 간단히 아래 요약.<ol>
<li>믹스 1 볼륨 재구성된 시 약 (항 TNF는 cryptate 및 안티 TNF-XL665)의 재구성 버퍼 (50 m m 인산 버퍼 pH 7.0, 0.8 M 칼륨 불 화물 (KF), 0.2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA))의 19 볼륨.</li>
		<li>두 항 체 준비-사용 솔루션은 시 약을 분배 하기 전에 1:1 혼합.</li>
		<li>10 µ L 화이트 384-잘 접시에 3.6 단계에서 supernatants의 분배.</li>
		<li>10 µ L 항 체 혼합의 분배.</li>
		<li>커버 플레이트는 마감재와 고 하룻밤 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>접시 microplate 리더 (50-200 플래시)에 읽기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HTRF (균일 시간 해결 형광)에 의해 인간의 IL 23 측정 참고: 프로토콜 다음 공급 업체의 권장 사항, 간단히 아래 요약.<ol>
<li>검색 버퍼 # 3의 19 볼륨 재구성된 시 약 (안티 IL-23-cryptate-항 체 및 안티-일-23 d 2 항)에의 한 볼륨 믹스.</li>
		<li>두 항 체 준비-사용 솔루션은 시 약을 분배 하기 전에 1:1 혼합.</li>
		<li>10 µ L 화이트 384-잘 접시에 3.6 단계에서 supernatants의 분배.</li>
		<li>10 µ L 항 체 혼합의 분배.</li>
		<li>커버 플레이트는 마감재와 고 하룻밤 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>접시 microplate 리더 (50-200 nm 플래시)에 읽기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간의 일리노이-6, 일리노이-8, IL 1β 및 electrochemiluminescence에 의해 TNF-α 측정 참고: 모든 샘플 1/150 희석제 2에서에서 희석 했다 (첫번째 희석: 150 µ L에 10 µ L 다음 180 µ L에서 20 µ L). 프로토콜 다음 공급 업체의 권장 사항:<ol>
<li>샘플 및 희석제 2에서 표준 희석.</li>
		<li>희석제 2 1/4 직렬 배 희석을 사용 하 여 표준의 희석을 진행 합니다.</li>
		<li>세 번 세척 버퍼와 세척 접시입니다.</li>
		<li>50 µ L 샘플 또는 잘 당 표준의 분배.</li>
		<li>동요에서 실 온에서 2 h에 품 어.</li>
		<li>4 시간 PBS + 0.05%와 접시를 씻고 음식을 20.</li>
		<li>희석제 3에서 탐지 항 체 (최종 3 mL에 대 한 각 항 체의 60 µ L)의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>동요에서 실 온에서 2 h에 품 어.</li>
		<li>4 시간 PBS + 0.05%와 접시를 씻고 음식을 20.</li>
		<li>읽기 버퍼의 당 150 µ L 추가 거품을 피하고, (tripropylamine을 포함 하는 트리 기반 버퍼 ddH20에에서 2 배 희석) electrochemiluminescence immunoassays 가벼운 발생에 대 한 공동 반응으로.</li>
		<li>멀티플렉스 플레이트 리더에 (지체) 없이 접시를 읽기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 공급 업체의 프로토콜을 따르고 ELISA에 의해 TNF를 측정
	<ol>
<li>상쾌한 분석 결과 희석제 (단백질 포함 된 버퍼를 사용 하 여 준비)에 1:1 희석.<ol>
<li>키트에 설명 된 대로 시 약, 예제 및 표준 희석을 준비 합니다. 각 잘 하 50 μ의 희석제 분석 결과 추가 합니다.</li>
			<li>표준, 제어, 또는 잘 당 샘플의 50 μ를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>부드럽게 1 분 동안 접시 프레임을 활용 하 여 혼합.</li>
		<li>제공 된 접착제 스트립과 커버 하 고 실내 온도에서 2 h에 품 어.</li>
		<li>각 잘 하 고 400 μ/잘 (반복이 총에서 5 번 단계) 세척 발음.</li>
		<li>최종 세척 후 발음에 의해 모든 나머지 워시 버퍼를 제거 합니다.</li>
		<li>접시를 반전 하 고 깨끗 한 종이 수건에 대 한 오 점.</li>
		<li>각 잘 추가 마우스 TNF-α 켤레의 100 μ. 새로운 접착제 스트립 커버.</li>
		<li>실 온에서 2 h에 품 어.</li>
		<li>7.4.4 단계 에서처럼 포부/워시를 반복 합니다.</li>
		<li>각 잘 하 기판 솔루션의 100 μ를 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>각 우물에 염 산을 희석된 솔루션 (정지 솔루션)의 100 μ를 추가 합니다. 부드럽게 철저 하 게 혼합 되도록 접시를 누릅니다.</li>
		<li>450에서 광학 밀도 측정 nm (560에서 설정 수정 파장으로 nm) (해야 할 30 분 이내) microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 생존 능력
	<ol>
<li>제거한 후 supernatants PBMC 또는 monocyte 준비에서 resazurin 솔루션 (oxidation-reduction 포함) 10% 최종 농도에 세포 현 탁 액에 직접 추가 사용 하는 준비를 사용 하 여 세포 생존 능력을 평가 합니다.</li>
		<li>1-2 h 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
		<li>590에서 형광을 읽고 nm (여기 540 nm) microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 복합 준비
<ol><li>
IMoDCs에 대 한 직렬 희석
	<ol>
<li>희석 MLT-827 재고 솔루션 (10 mM (4 x 집중)를에서 8 µ M를 도달 하는 중간에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에.</li>
		<li>6 단계 1:5 직렬 희석, 매체 + 0.08 %DMSO 사용 하 여 수행 합니다. 차량 (복합) 조건에 대 한 동일한 매체 + 0.08 %DMSO 솔루션을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단 하나의 복용량 iMoDCs에 대 한 테스트
	<ol>
<li>한 가지 (4 x 집중) 4 µ M를 도달 하는 매체로 MLT-827, AFN700 및 Cpd11 재고 솔루션을 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Murine 비장 세포에 대 한 직렬 희석
	<ol>
<li>0.1%의 DMSO 최종 농도 0.01 µ m (중간에 한 가지 희석 다음 10 m m 재고 솔루션에서 얻은) 10 µ M MLT-827 솔루션을 희석.</li>
		<li>희석 단계 각 희석의 2 µ L, 우물에 38 µ L RPMI, 피펫으로 5 µ L를 추가. 참고: 모든 치료는 3 중에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 자극 준비
<ol><li>
고갈된 zymosan (DZ)
	<ol>
<li>Dz.의 10 mg을 멸 균도 무료 물 2 mL를 추가</li>
		<li>균질 재고 솔루션, 소용돌이 사전 각 사용 하는 소용돌이.</li>
		<li>-20 ° c.에 aliquot 솔루션 및 저장소 aliquots</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트 레 할 로스-6, 6-dibehenate (TDB)
	<ol>
<li>1 mg TDB, 물 목욕 15-30 s의 60 ° C에서 열에 DMSO의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>와 동 즉시 살 균 PBS, 다시 소용돌이의 900 µ L을 추가 하 고.</li>
		<li>60 ° C에서 10-15 분에 대 한 열 하 고 균질 vortexing 사전에 의해 사용 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 솔루션을 계속</li>
		<li>직렬 희석 MLT-827 화합물에 관해서는 단일 투여 준비를 수행 합니다. 참고: TDB DMSO에 준비 하기 때문에, 마지막 1 %DMSO 농도 세포 자극 중입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 작품에서 우리 인간의 신호 통로 마우스 타고 난 세포를 연구 하 고 MALT1 분해 기능에 대 한 그들의 의존성을 심문 간단한 실험 설정 사용. 이전 작업11에 확대, 우리의 연구 MALT1 paracaspase 활동 C 형 lectin 같은 수용 체 유도 cytokine 생산, TNF-α를 포함 하 여 컨트롤을 보여주었다. 반면, TLR 4 유도 하는 TNF-α MALT1 두 종에서 독립 했다. 샨 다, 이러한 데이터는 MALT1/CBM signalosome 하류 C 형 lectin 같이 수용 체의 이전 연구6,12,18에 의해 공개 됐다이의 키와 선택적 기여 뒷받침.
TLR 4 MALT1 골수성 세포에서에 신호의 명확한 독립 다른 적용 여부 셀 유형 탐험 남아 있다...

MALT1의 paracaspase 활동 (점 막 관련 림프 조직 림프 종 전 좌 단백질 1) 20081,2에서 밝혀졌다. 그 이후, 연구의 여러 세포에 항 원 수용 체 응답의 중요 한 기여를 보고 있다. 유전자 모델 마우스 뿐만 아니라 T 세포, T 세포 의존 면역 및 B-세포 림프 종 설정3,4약리학 데이터는 중요 한 역할을 지원. MALT1 paracaspase 활성화는 CARD11-BCL10-MALT1 복잡 한5, 항 원 수용 체 근 위 신호에 의해 트리거되는 조립 시 발생 하는 림프 톨에 T 또는 B 세포 수용 체의 다운스트림. 또한 유사한 CARD9-BCL10-MALT1 복잡 한 예를 들어 C 형 lectin 같이 수용 체 (CLLR)의 하류 신호를 전파에 대 한 중요 하다는 충분 한 증거가 있다, Dectin-1, Dectin 2, MINCLE에 골수성 세포6,7. Dectin-1이이 통로 곰 팡이 감염8,9에 대 한 호스트 방어에 매우 중요 하기 때문에 특히 잘 공부 되었습니다 했다. 그러나, 수용 체 통행세 같이 (TLR) 경로에서 MALT1의 의미는 논란이10남아 있다. 인간의 골수성 세포에서 최근 증거 MALT1 paracaspase 활동 TNF-생산의 하류 TLR 411의 규정에 대 한 직접적인 역할을 배제.
현재 작업에서 다양 한 실험 설정 물질로 인간의 및 마우스 골수성 세포 타고 난 신호 경로, 특정 약리 도구 억제제 및 cytokine 생산의 측정 프로브를 사용 우리.

<table><tbody><tr><td>100 &마이크로; m 나일론 셀 스트레이너</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Falcon</td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 V-바닥 플레이트</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄 - NH4Cl</td><td>시그마</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>분석 희석제 RD1-W ELISA</td><td>R& D</td><td>895038</td><td>분석 희석제</td></tr><tr><td>세포 배양 마이크로플레이트, 384 웰, 블랙</td><td>Greiner</td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>고갈 Zymosan</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>now: tlrl-zyd</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염 이수화물</td></tr><tr><td>ELISA 뮤트TNF-&알파;</td><td>R& D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 튜브</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis-Heat-inactivated</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF hu IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF hu TNF-&알파;</td><td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF 재구성 완충액</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM 인산염 완충액, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td></tr><tr><td>IFN-&감마;</td><td>R& D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis-Isoflurane</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lipopolysaccharides (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS 인체 샘플에 사용</td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>L4516</td><td>LPS 쥐 샘플에 사용</td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td>자체 제작</td> <td>-</td><td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td></tr><tr><td>자석</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 384 웰 화이트</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>Monocytes 농축 키트</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg; C 냉동 용기</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>냉각 장치(프로판올-2 포함)</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td>인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>펜/스트렙</td></tr> 포<tr><td>타슘 바이카보네이트 - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr>생존 능력 평가를 위한 <td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>Resazurin 용액</td></tr><tr><td>Propanol-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>읽기 버퍼</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>트리스 기반 완충액 함유 트리프로필아민</td></tr><tr><td>회수 세포 배양 동결 매체</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>동결 매체</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 매체(RPMI) Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ iMoDCs + 10% FBS + 1 mM 피루브산 나트륨 + 100 U/mL 펜/연쇄상구균 + 5 &micro; M &beta;-인간 PBMC 및 단핵구에 대한 메르캅토에탄올 + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &micro; 쥐 비장 세포용 M &beta;-메르캅토에탄올</td></tr><tr><td>분리 완충액</td><td>자체 제작</td><td>-</td><td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1mM EDTA pH 8.0</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>트레할로스-6,6-디베헤네이트</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P7949</td><td>폴리소르베이트 20</td></tr><tr><td>울트라퓨어 0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td></tr><tr><td>Viewseal 실러</td><td>Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>전기화학발광 멀티플렉스 분석법(IL-1&beta;, TNF-&alpha;, IL-6, IL-8)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 malt1 paracaspase 활동

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

수많은 연구에 의해 해결 되었습니다, 림프 세포, 그것의 기능 외 paracaspase MALT1 또한 패턴 인식 수용 체의 타고 난 셀 하류에 중요 한 역할을 재생 합니다. 최고의 공부는 Dectin-1 및 Dectin-2 일원 이다 C 형 lectin 같이 수용 체 가족의 SYK-및 CARD9-종속 MALT1 종속 방식에서 NF-κB 활성화를 선도 하는 캐스케이드 신호를 유도 하는. 대비, 통행세 같이 수용 체 (TLR), TLR-4, 같은 의해 NF-κB 활성화 하지만 신호는 MYD88/IRAK 종속 캐스케이드를 통해 전파 합니다. 그럼에도 불구 하 고, MALT1 TLR 4 신호에 기여할 수 있습니다 여부 불분명 남아 있다. MLT-827, MALT1 paracaspase 활동의 강력 하 고 선택적 억제제와 최근 증거가 나타냅니다 TNF-생산 하류 TLR-4 인간의 골수성 세포에서의 Dectin-1, TNF-생산 하류 반대로 MALT1의 독립적인 MALT1은 종속. 여기, 우리는 더 이상 감지, 및 마우스 세포 준비, Dectin 1, MINCLE 또는 TLR 4 통로의 자극의 다양 한 사용 패턴 인식에 MALT1의 선택적 참여 해결. 우리는 또한 넘어 TNF-, cytokines를 탐험 하 고 SYK 억제제 (Cpd11)와 IKK 억제제 (AFN700) MLT-827를 비교 하 여 추가적인 통찰력을 제공 했습니다. C-타입 lectin 같이 수용 체의 MALT1 종속성에 대 한 제공 하는 데이터 추가, 증거를-반대로 TLR 신호를 신호.

골수성 세포에서 MALT1 여러 C 형 lectin 같이 수용 체, Dectin 1, Dectin 2, MINCLE6등의 하류 활성화 신호를 릴레이합니다. (앙) ITAM는 수용 체를 포함 하는 주제에 의존 하는이 경로 (예:, Dectin-1) 또는 ITAM 주제 포함 된 공동 수용 체 (예:, FcRγ, Dectin 2, MINCLE)를 채용 하 고 SYK 키 (그림 1)을 활성화. 이 활성화 한 단백질 키 니 아 제 C isoform, 즉 PKCδ, phosphorylates CARD9, CARD9/BCL10/MALT1 복잡 한 형성 및 다운스트림 NF-κB 활성화12TRAF6의 채용 함으로써 실행을 이끌어 낸다. 대조적으로, TLR 4 통로 TRAF6 MYD88/IRAK 종속 방식으로 NF-κB...

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

따라서 원고에서 방법의 목적은 인간 및 마우스 시스템을 사용하여 골수성 세포의 신호 경로에 대한 비교 분석을 제공하는 것입니다. 그것은 어떤 신호 경로 선택 된 패턴 인식 수용 체의 하류에 관련 된 정의 하는 데 도움이. 따라서 이 메서드는 구현하기 쉽습니다.그것은 1 차적인 세포 준비 및 신호 기전의 해명에 필수적인 검증된 기준 화합물에 의존합니다. 절차를 시연하는 것은 라티바 투일과 아델레인 운터레이너, 각각 우리 그룹의 과학자 및 연구 동료가 될 것입니다. 라미나르 플로우 후드에는 멸균 된 가위, 1 리터 비커 및 비닐 봉지가 놓입니다.이전에 획득한 버피 코트를 비커에 넣고 가위를 사용하여 조심스럽게 엽니다. 25mm 파이펫을 사용하여 EDTA 2 밀리머로 보충된 PBS 100ml를 추가합니다. 천천히 위아래로 파이프를 통해 섞는다.그리고 희석 된 버피 코트 25 ml를 각각 15 ml의 다당류 기반 밀도 그라데이션으로 미리 채워진 6 개의 50ml 원심 분리 튜브로 옮긴다. 800g에서 20분 동안 튜브를 원심분리하여 중간 가속을 하여 밀도에 따라 세포를 분리할 수 있습니다. 원심분리 후 3층, 적혈구와 과립구를 함유한 펠릿, 플라즈마로 만든 상층, 말초 혈액 단핵세포를 포함하는 백색 고리가 보일 것이다.10ml 파이펫을 사용하여 PBMC 링을 수확하고 새로운 50ml 튜브로 옮습니다. PBS 및 EDTA를 통해 최대 를 차지합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원심 분리 시간과 속도가 줄어 3회 연속 세 가지 연속 세차유를 수행합니다.마지막 세척 후, 골을 다시 중단 25 얼음 차가운 lysis 버퍼의 삼투압에 의해 적혈구를 lyse. 용액이 명확해질 때까지 실온에서 배양합니다. 그런 다음 25 ml의 분리 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다.150g의 원심분리기는 8분간 세척하여 용액을 세척합니다. 상체를 붓고 분리 버퍼로 펠릿을 다시 놓습니다. 세포를 계산한 후 배양 배지에서 우물당 12, 500세포로 희석합니다.이 셀 현탁액 30ml를 384웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 다음으로 각 우물에 4배 의 농축 화합물 용액 15마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 플레이트를 미리 배양합니다. 원하는 경우 ML당 1 ng의 최종 농도에 LPS를 추가하거나 Zymosan을 ml당 100 mcg의 최종 농도로 고갈시키세요.그런 다음 이산화탄소 5 %와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 다음 날 은닉 된 TNF 알파 레벨을 측정하기 위해 10 마이크로 리터를 복용합니다. 직렬 희석을 시작하려면 MLT-827 스톡 용액을 배지로 희석하여 한 이동 중 8 마이크로몰러의 농도에 도달합니다.0.08%DMSO의 매체를 사용하여 6단계 1:5 직렬 희석을 수행합니다. 단일 용량 테스트를 준비하기 위해 MLT-827, AFN700 및 화합물 11 스톡 솔루션을 배지로 희석하여 한 번의 이동 중에도 4 마이크로몰러의 농도에 도달합니다. 먼저, 멸균 내독소가 없는 물 2ml를 고갈된 자이모산 10mg에 넣습니다.이 스톡 솔루션을 균질화하기 위해 소용돌이. 용액을 알리쿼트한 다음 알리코를 섭씨 20도에 보관합니다. 이 연구에서 인간 PBMC와 마우스 비장 세포는 고갈 된 Zymosan, Dectin-1 작용제 또는 TL4 작용제 인 lipopolysaccharide로 자극됩니다.상체에서 NTNF 알파 릴리스는 20 시간 후에 측정됩니다. 인간과 마우스 모두에서 MLT-827 화합물은 데신-1 통로에 의해 구동되는 TNF 알파 생산을 선택적으로 차단하지만 TLR4 경로에 의해서는 차단되지 않는다. LPS로 자극된 단세포에서 TNF 알파의 생산은 AFN700에 의해 거의 완전히 제거되지만 Cd11에 민감하지 않으며, 이는 NF-kappa B 활동에 대한 TLR4 경로의 의존성과 SIC 활동에 대한 의존성과 일치합니다.반면 Dectin-1 및 MODCs가 구동하는 TNF 알파 생산은 MLT-827, AFN700 및 Cpd11에 대한 민감도를 보여줍니다. 이것은 Dectin-1 통로에 있는 SIC CBM 신호 폭포의 연루를 위한 추가 증거를 제공합니다. IL-1 베타, IL-6 및 IL-23의 생산은 또한 TNF 알파와 유사한 규제 메커니즘을 나타내는 세 가지 억제제에 민감하다.그러나 IL-8의 생산에 미치는 제한된 효과는 이 사이토카인이 뚜렷한 규제 메커니즘을 가지고 있음을 시사합니다. ML당 50mcg 이상의 트레할로오스-디베헤네이트 농도를 높이면 MLT-827의 차단 효과에 따라 몰트1 파라카스파제 활동에 의존하는 TNF 알파, IL-6 및 IL-1 베타의 생산으로 이어집니다. Dectin-1을 자극하기 위해 고갈 된 자이모산의 농도가 증가함에 따라 MODCs에 도전할 때도 비슷한 결과가 나타났습니다.이 방법은 파라카파스 MALT1이 C형 렉틴과 같은 수용체 신호를 선택적으로 조절한다는 것을 보여주었습니다. 잘 특징적인 기준 화합물을 사용하는 것이 필수적입니다. 주식 솔루션희석 절차에 주의를 기울이는 다.이것은 제한된 용해도를 가진 화합물에 대 한 중요 한.

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지

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모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

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골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

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