Name: Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 배우세요 PEG 매개 변환법을 이용한 프로토플라스트 단백질 발현 및 엽록체로의 단백질 수입 과정 연구 방법입니다. 이 기술은 생체 내 조건에서 단백질 역학을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품 농업 과학 기술 개발 (프로젝트 번호에 대 한 협동 연구 프로그램의 지원으로 수행 되었다 PJ010953012018), 농촌 진흥청과 국립 연구 재단 (한국) 그랜트 과학기술부와 ICT (No. 2016R1E1A1A02922014), 한국.

1입니다. 애기 식물의 성장
<ol><li>1 L Gamborg B5 준비 (B5) 매체 B5 매체의 3.2 g를 추가 하 여 비타민, 자당의 20 g, 2-(N-morpholino) 탄 술 폰 산 (MES), 이온을 제거 된 물 약 800 mL의 0.5 g과 수산화 칼륨 (KOH)와 5.7에 pH를 조정. 추가 더 이온된 물 phytoagar 고압 121 ° c.에 15 분의 1 나 추가 8 g 총 볼륨을가지고</li>
	<li>55 ° C까지 냉각 및 깨끗 한 벤치에 페 트리 접시 (지름에서 9 c m, 높이 1.5 c m) B5 매체의 20-25 mL를 붓고 매체를 허용 합니다. 2-3 일 건조 접시, 깨끗 한 포장으로 그들을 포장 하 고 사용까지 냉장고에 보관.</li>
	<li>애기 thaliana 소독 씨앗 지속적으로 2-3 분 동안 흔들어 하 여 원심 분리기 튜브 (e-튜브)에서 70% (v/v) 에탄올의 1 mL는 상쾌한 제거, 1% (v/v) 염소 용액 1 mL를 추가 및 2-3 분 위해 지속적으로 흔들 준비 100 -페 트리 접시 당 150 씨앗입니다.<ol>
<li>supernatants 제거 하 고 증류수의 1 mL와 함께 씨앗을 씻어. 4 배속이이 단계를 반복 합니다. 씨앗 발 아 동기화를 3 일 동안 4 ° C에서 소독된 씨앗을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100-150는 micropipette를 사용 하 여 b 5 판에 씨앗을 뿌리 다을 외과 테이프와 접시를 봉인.</li>
	<li>2 주 동안 100 µmol·m-2·s-1 빛의 강도, 70% 상대습도 20 ° C 온도에 16 h/8 h 명암 주기 성장 방에 식물을 성장 한다.</li>
</ol>2입니다. 플라스 미드의 준비
참고: 고 순도 플라스 변환; 사용 해야 상용 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 것이 좋습니다.
<ol><li>플라스 미드 정화 (Rbc-nt:GFP) DNA 분리 kit를 사용 하 여. DNA를 집중, 1.5 mL 튜브에 에탄올 강수량을 수행 하 고 증류수의 100 µ L에서 DNA 펠 릿을 분해. 260에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 플라스 미드의 농도 결정 nm. 희석의 최종 농도에 플라스 미드 ~ 2 µ g / µ L.까지 사용-20 ° C에서 유지 플라스 미드.</li>
</ol>3입니다. Protoplasts의 격리
<ol><li>다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>0.25% (w/v) macerozyme, 1.0% (w/v) cellulase, 400 m m D-마 니 톨, 8 m m 칼슘 염화 물 (CaCl2), 0.1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 포함 효소 솔루션을 준비 하 고 5mm MES. 5.6 코와 pH를 조정 합니다.<ol>
<li>효소 솔루션 0.45 μ m 기 공 크기와 셀 루 로스 아세테이트 필터 단위를 사용 하 여 필터링 합니다. -20 ° c.에 계속 50 mL 원뿔 튜브에 효소 솔루션의 aliquot 25 mL 효소 솔루션 (RT) 실 온에서 해 동 하 고 사용 직전에 잘 섞는다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>솔루션 이온된 물과 압력솥의 100 mL에 자당의 21 g을 용 해 하 여 21% (w/v) 자당 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>W5 154 m m 염화 나트륨 (NaCl), 125 mM CaCl2, 5mm 염화 칼륨 (KCl), 5 mM 포도 당, 및 1.5 m m MES 솔루션을 준비 합니다. 코와 고압 솔루션 5.6 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>MaMg 솔루션 포함 400 m m D-마 니 톨, 15 m m 염화 마그네슘 (MgCl2), 준비 및 5mm MES. 코와 고압 솔루션 5.6 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>1 M D-마 니 톨 및 1 M 칼슘 질산염 재고 솔루션을 페그 솔루션을 준비 합니다. 압력솥이이 솔루션.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그대로 잎 조직에서 2 주 오래 된 식물에서 수확 ~ 수술 칼과 장소를 사용 하 여 1-2 B5 판 50 mL 원뿔형으로 수확된 잎 관 효소 솔루션의 포함 25 mL. 어둠 속에서 부드러운 동요와 함께 회전 통에 가로로 효소 솔루션와 잎 조직을 포함 하는 원뿔 튜브를 놓습니다. 그것은 8-12 h 잎 조직의 전체 소화 걸립니다.</li>
	<li>부 화 후 8-12 h, 메시 140 µ m 기 공 크기를 통해 신선한 배양 접시에 (잎 조직에서 발표 하는 protoplasts를 포함 하는) 효소 솔루션을 붓는 다. 신중 하 게 21% (w/v) 자당 솔루션의 15 mL 위에 포함 하는 원생 동물 효소 솔루션을 레이어 하 고 낮은 가속 및 감속 설정 진동 물통 회전자에 10 분 동안 98 x g에서 원심.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게는 protoplasts 맨 위 레이어 (효소 솔루션)와 인터페이스에서 사이 전송 효소 솔루션 및 자당 솔루션 W5 솔루션의 30 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에. 51 x g 6 분에이 튜브 원심 이 단계에서 protoplasts 펠 릿 원뿔 튜브의 하단에 있을 것입니다.</li>
	<li>Protoplasts 펠 렛을 방해 하지 않고 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 상쾌한을 삭제 합니다. W5 솔루션의 25 mL를 추가 하 고 부드럽게는 protoplasts resuspend. 원생 동물 솔루션 안정화를 위해 적어도 1 시간 동안 4 ℃ 냉장고에서 품 어.</li>
</ol>4. 폴 리 에틸렌 글리콜을 사용 하 여 원생 동물 전이
<ol><li>준비 하는 40 %50 mL 원뿔 튜브로 던지다 8000의 4 g, 1 M 마 니 톨 솔루션의 4 mL, 1 mL의 1 M Ca (3)2, 및 1.8 mL 증류수를 추가 하 여 솔루션을 던지다 하 고 잘 섞으십시오. PEG 40 %20-30 미 장소는 전자 레인지에서가 열 하 여 분해 냉각을 위한 RT에서 못 솔루션. 참고: 40% 못 솔루션을 신선 하 게 준비 되어야 한다 모든 시간. Protoplasts는 하지 수송과 완전히 냉장고에 4 ° C 인큐베이션 기간 동안, 만약 원심 2 분 46 x g에 소재.</li>
	<li>신중 하 게 하지만 완전히는 상쾌한을 제거 하 고 추가 MaMg 솔루션 5 x 106/mL의 농도를 원생 동물 펠 릿. 참고: 원생 동물의 수는 현미경으로 본 hemocytometer에 의해 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>각 빈 13 mL 플라스 미드 DNA의 장소 10 µ g 라운드-하단 튜브와는 피 펫을 사용 하 여 원생 동물 솔루션의 300 µ L를 추가 합니다. 참고: 피 펫 팁의 끝 잘라 되어야 합니다. Protoplasts 샘플링 됩니다 때마다 원생 동물을 포함 하는 솔루션 protoplasts의 동일한 수 각 관에 추가 되도록 pipetting 앞 resuspended 한다.</li>
	<li>부드럽게 튜브를 회전 하 여 protoplasts와 플라스 미드 DNA를 혼합 하 고 즉시 추가 40%의 300 µ L를 피 펫을 사용 하 여 못 솔루션. 튜브를 회전 하 여 부드럽게 하지만 완전히 혼합 하 고 실내 온도;에 30 분 동안 품 어 튜브를 거의 수평으로 기울기와 여러 번 회전.</li>
	<li>W5 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 비슷한 방식으로 손으로 튜브를 회전 하 여 부드럽게 하지만 완전히 혼합. 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>두 번 더 사용 하 여 1.5 mL 그리고 W5 솔루션의 2 mL 각각이 단계를 반복 합니다. W5 솔루션의 최종 추가 후 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>4 분 삭제는 상쾌한 46 x g에서 centrifuge 고 W5 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 부드럽게 하지만 완전히 혼합. 어두운 약 실에 있는 22 ° C에서 품 어.</li>
</ol>5. 엽록체에는 단백질의 분석
참고: protoplasts의 페그 중재 변환 후 보육 시간 범위 8에서 24 시간.
<ol><li>
형광 현미경 검사 법
	<ol>
<li>손질 팁 그리고 신중 하 게 피 펫을 사용 하 여 슬라이드 유리에 원생 동물 솔루션의 장소 10 µ L는 protoplasts의 손상을 방지 하려면 coverslip 커버.</li>
		<li>장소 여기/방출 필터 장착 형광 현미경의 스테이지의 슬라이드는 녹색 형광 단백질 (GFP)와 엽록소 자동 형광 관찰에 대 한 설정 합니다.</li>
		<li>냉각된 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 및 프로세스 이미지 의사 컬러 이미지를 생산 하는 이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
총 단백질 추출 및 Immunoblotting
	<ol>
<li>2.5% (w/v) 나트륨 dodecylsulfate (SDS), 그리고 2% (v/v) 2-mercaptoethanol을 포함 하는 변성 버퍼를 준비 합니다. 참고: 엽록체로 단백질 가져오기 교통 펩 티 드 immunoblot 분석 통해 안티-GFP 항 체를 사용 하 여 처리의 정도 측정 하 여 측정할 수 있습니다.</li>
		<li>원심 분리기 튜브 및 4 분 46 x g에서 원심 분리기로 protoplasts를 전송 합니다.</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 변성 버퍼의 80 µ L를 추가 합니다. 5에 대 한 적극적으로 소용돌이의 SDS 샘플 버퍼 (250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 0.5 M DTT, 10% (w/v) SDS, 0.05% (w/v) Bromophenol 파랑 및 50% (v/v) 글리세롤) x 5를 추가 하 고. 잘 혼합 하 고 10 분 동안 삶아.</li>
		<li>이 단백질 샘플 표준 SDS 페이지를 안티-GFP 항 체와 immunoblotting 주제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15012188">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li>
<li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li>
<li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li>
<li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Transport+into+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li>
<li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li>
<li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li>
<li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li>
<li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dynamin-like+protein%2C+ADL6%2C+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li>
<li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li>
<li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li>
<li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 엽록체에 단백질 가져오기 공부 애기 의 protoplasts의 사용에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 메서드는 강력한 단백질 가져오기 프로세스를 조사. 이 간단 하 고 다재 다능 한 기술은 엽록체를 의도 화물 단백질을 대상으로 조사 하기 위한 유용 합니다. 이 메서드를 사용 하 여, protoplasts는 매우 일찍 완전히 성숙한 잎에서 배열 하는 많은 다른 성장 단계에서 식물에서 얻을 수 있는 애기11,12 의 잎 조직에서 준비 된다. 그러나, 해야 합니다 주의 원생 동물 준비를 위해 사용 되는 식물을 성장 하는 때. 하나로 protoplasts 건강 한 식물에서 준비 못 중재 변환에 관련 된 많은 단계를 견딜 수 있는 매우 건강 한 식물을 사용 해야 합니다. 또 다른 중요 한 경고는 신선한 솔루션을 사용 하는 이다. 크게 솔루션의 농도에서 약간의 변화는 약하고 매우 삼투성...

엽록체는 식물에서 가장 중요 한 세포 중 하나입니다. 엽록체의 주요 기능 중 하나는 광합성1수행입니다. 엽록체는 또한 지방산, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 수많은 이차 대사 산물1,2의 생산에 대 한 많은 다른 생 화 확 적인 반응을 실시합니다. 모든이 반응은 엽록체 단백질의 다른 종류의 많은 수를 필요로합니다. 그러나, 엽록체 게놈에는 약 100만 유전자3,4포함 되어 있습니다. 따라서, 엽록체는 cytosol에서 그들의 단백질의 대부분을 가져와야 합니다. 사실, 대부분의 엽록체 단백질 번역4,,56후는 cytosol에서 가져올 수을 표시 했다. 식물 세포에는 엽록체에는 cytosol에서 단백질을 가져올 특정 메커니즘이 필요 합니다. 그러나, 이러한 단백질 가져오기 메커니즘 지난 몇 십년에 대 한 조사는, 비록 우리가 아직 이해 하지 않습니다 완전히 그들 분자 수준에서. 여기, 우리 protoplasts를 준비 하 고 protoplasts에 있는 유전자를 표현 하는 것에 대 한 자세한 방법을 제공 합니다. 이 메서드는 elucidating 자세히 엽록체로 단백질 가져오기 기본 분자 메커니즘에 대 한 중요 한 될 수 있습니다.
단백질 가져오기는 많은 다른 방법을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 생체 외에서 단백질 가져오기 시스템7,8의 사용을 포함. 체 외에서이 방법을 사용 하 여-번역 된 단백질 선구자는 순화 된 엽록체에 생체 외에서인 큐베이 팅 및 단백질 가져오기 SDS 페이지 뒤에 서쪽 오 점 분석에 의해 분석 된다. 이 방법의 장점은 엽록체로 단백질의 각 단계 세부에서 공부 될 수 있다입니다. 따라서,이 방법은 널리 사용 되었습니다 단백질 가져오기 분자 기계 구성 요소를 정의 하 고 교통 펩 티 드에 대 한 시퀀스 정보 부. 더 최근에, 잎 조직에서 protoplasts의 사용을 포함 하는 또 다른 방법은 개발 되었다 고 단백질 가져오기 엽록체9,10으로 공부를 널리 사용 되고있다. 이 방법의 장점은 그대로 세포의 생체 외에서 시스템 보다 가까이 세포 환경을 제공 하는 protoplasts. 따라서, 원생 동물 시스템 관련된 cytosolic 이벤트 등 어떻게 신호를 표적으로 하기의 특이성 결정은이 과정의 많은 추가 측면을 해결 수 있습니다. 여기, 우리는 단백질 가져오기 엽록체로 공부 하는 protoplasts의 사용에 대 한 자세한 프로토콜 제시.

<table><tbody><tr><td>비타민을 포함한 GAMBORG B5 매체</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0210.0050</td><td></td></tr><tr><td>SUCROSE</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td></td></tr><tr><td>MES MONOHYDRATE</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td></td></tr><tr><td>한천, 분말</td><td>JUNSEI</td><td>24440S1201</td><td></td></tr><tr><td>미세 기공 수술 테이프</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>수술 블레이드 스테인리스 No.10</td><td>FEATHER</td><td>사용할 수 없는</td><td></td></tr><tr><td>원추형 튜브, 50ml</td><td>SPL 생명 과학</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>사용할 수 없는</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 ONOZUKA R-10</td><td>야쿠르트 제약 공업</td><td>사용할 수 없음</td><td></td></tr><tr><td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td> <td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>0219463505-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Twister</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-96TW</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 용 스크린 컵</td><td>SIGMA</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>스크린</td><td>SIGMA</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>HILGENBERG</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>실험실용 원심분리기 / 벤치탑</td><td>비전 Scientific</td><td>VS-5500N</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>JUNSEI</td><td>19015S0350</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>SIGMA</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td><td>BIO BASIC</td><td>GB0219</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨</td><td>DUKSAN</td><td>40</td><td></td></tr><tr><td>질산칼슘 사수화물</td><td>SIGMA</td><td>C2786-500G</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜)</td><td>SIGMA</td><td>P2139-2KG</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>SIGMA</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>튜브 13ml, 100x16mm, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>55.515</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>MARIENFELD</td><td>1000412</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 안경</td><td>MARIENFELD</td><td>101030</td><td></td></tr><tr><td>계수 챔버</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 2 이미징 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>사용할 수 없음</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브 1.5ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2- 메르캅토에탄올</td><td>SIGMA</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트(SDS), 프로테믹스 등급</td><td>VWR</td><td>M107-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS, 초순수 등급</td><td>VWR</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-디티오트레이톨), 생명공학 등급</td><td>VWR</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루 나트륨 염 ACS</td><td>VWR</td><td>0312-50G</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>JUNSEI</td><td>27210S0350</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.V. 단클론 항체 (JL-8)</td><td>TAKARA</td><td>632381</td><td></td></tr></tbody></table>

protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

엽록체는 식물, 광합성 등 많은 보조 metabolites의 지질 생산에에서 다양 한 세포질 과정을 담당 하는 필수적인 세포 기관이 이다. 엽록체는 이러한 다양 한 생리 적 과정에 대 한 단백질의 많은 수를 요구 한다. 이상의 엽록체 단백질의 95 %cytosolic 리보솜에서 번역 후 핵 인코딩되고는 cytosol에서 엽록체에 가져온 있습니다. 따라서, 적절 한 가져오기 또는 엽록체를이 핵 인코딩 엽록체 단백질의 엽록체 식물 세포의 적절 한 작동에 필수적입니다. 핵 인코딩 엽록체 단백질 포함 엽록체를 특정 대상에 대 한 신호 순서. 분자 기계는 엽록체 또는 cytosol로 이러한 신호를 인식 하 고 가져오기 프로세스를 수행. 단백질 가져오기 또는 vivo에서엽록체를 타겟팅의 메커니즘을 조사, 우리 신속 하 고 효율적인 원생 동물 기반 방법을 개발 애기의 엽록체로 단백질 수입 분석 하. 이 방법에서는, 우리 애기의 잎 조직에서 분리 된 protoplasts를 사용 합니다. 여기, 우리는 단백질 엽록체로 가져올 메커니즘을 조사 하기 위해 protoplasts를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

엽록체에 단백질의 수입 두 가지 방법을 사용 하 여 시험 될 수 있다: SDS 페이지 중재 분리 후 형광 현미경 검사 법 및 immunoblot 분석. 여기, 우리는 Rbc 사용-nt:GFP, 융합 건설 Rbc GFP 융합 교통 펩 티 드를 포함 하는 79 N 맨끝 아미노산 잔류물을 인코딩. 대상 단백질 Rbc에서에서 녹색 형광 신호 단백질은 엽록체로 가져오면-형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 검사 nt:GFP 엽록소 자동-형광에서 빨간 형광 신호와 병합 해야 합니다. 2 개의 신호의 가까운 중복 단백질 가져오기를 엽록체로 나타냅니다. 종종 GFP 신호는 엽록체에 걸쳐 확산 또는 개별 단백질에 따라 엽록체를 통해 약하게 확산 신호와 엽록체의 센터에서 집중 된다. 단백질의 가져오기 immunoblot 분석 GFP 항 체를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 총 단백질 protoplasts에서 준비 하 고 SDS 페...

여기는 못 중재 변환 메서드를 사용 하 여 protoplasts로 단백질을 표현 하는 프로토콜에 설명 합니다. 관심, 단백질 및 단백질 현지화 및 다양 한 실험 조건에 대 한 가져오기 프로세스의 효율적인 조사의 쉬운 표현 제공 합니다 vivo에서.

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

이 신비는 엽록소에 단백질 입력과 같은 세포 생물학의 필드에 있는 몇몇 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 엽록소에 단백질 입력이 en vivo 조건하에서 연구될 수 있다는 것입니다. 이준호와 강향주가 수술절차를 시연할 예정이다.우선, 2주 된 식물에서 1~2개의 B5 플레이트에서 잎 조직을 수확하십시오. 수술용 칼을 사용하여 잎을 수확하고 효소 용액 25밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 튜브를 회전 셰이커에 수평으로 놓고 어둠 속에서 섭씨 22도에서 부드러운 교양으로 배양하여 8~12시간 동안 만 만 잎이와 줄기만 용액에 남아 있습니다.인큐베이션을 완료한 후, 140마이크로미터 모공 크기의 메쉬를 통해 방출된 프톱라스트를 함유한 효소 용액을 신선한 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 50 밀리리터 원추형 튜브에 21% 자당 용액의 15 밀리리터 위에 신중하게 솔루션을 레이어링합니다. 가장 낮은 가속 및 감속 설정으로 98 gs에서 스윙 버킷 로터에서 튜브를 원심 분리합니다.그 후, 파투라 파이펫을 사용하여 효소 용액을 함유하는 최상위 층과 효소 용액과 자당 용액 사이의 인터페이스에서 프톱서스트를 조심스럽게 제거합니다. 이 솔루션을 W5 용액 30밀리리터를 포함하는 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 혼합하는 것을 반전시십시오. 6 분 동안 51 gs에서 튜브를 원심 분리합니다.파이펫을 사용하여 펠릿의 프톱라스트를 방해하지 않고 이 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. W5 용액 25밀리리터를 추가하고 프토플라스트를 부드럽게 다시 중단합니다. 안정화를 위해 4°C 의 냉장고에 최소 1시간 동안 인큐베이션을 사용해 보임합니다.섭씨 4도 의 배양 후, 2 분 동안 46 gs에서 그들을 원심분리하여 프토플라스트를 완전히 펠렛. 수퍼네텐트를 완전히 제거하고 프토플라스트 펠릿에 MANG 솔루션을 추가하여 밀리리터당 6회에서 10배까지 5회 달성합니다. 파이펫을 사용하여 플라즈마 DNA 10마이크로그램과 300마이크로리터의 프토플라스트 용액을 신선한 13밀리리터 라운드 바닥 튜브에 추가합니다.튜브를 손으로 부드럽게 회전한 다음 즉시 새로 준비된 40% PEG 용액 300마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 거의 수평으로 기울이고 손으로 여러 번 부드럽게 회전하여 완전히 섞습니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.그런 다음 W5 용액 1 밀리리터를 넣고 튜브를 손으로 부드럽게 회전시켜 완전히 섞습니다. 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 처음 1.5 밀리리터를 추가한 다음 W5의 밀리리터 2개를 추가하고 최종 첨가 및 혼합 후 30분 동안 배양하여 두 번 더 반복합니다.46 gs에서 튜브를 원심 분리한 다음 상체를 폐기합니다. 펠릿에 W5 용액 2밀리리터를 넣고 부드럽게 섞어, 하지만 완전히 이전과 같은 방식으로 섞습니다. 어두운 챔버에서 섭씨 22도에서 18 시간 동안 배양하십시오.플로레시언 현미경을 사용하여 단백질 수입을 분석하려면 트리밍 팁이 있는 파이펫을 사용하여 프로토프스트 용액 10마이크로리터를 유리 슬라이드에 배치합니다. 커버 슬립을 사용하여 프스토플라스트가 손상되지 않도록 솔루션을 조심스럽게 덮습니다. 녹색 형광 단백질과 엽록소 자동 형광을 관찰하기 위해 설정된 흥분 입학 필터와 형광 현미경의 단계에 슬라이드를 놓습니다.냉각 충전 커플 장치 카메라를 사용하여 이미지를 캡처하고 상상하는 편집 소프트웨어를 사용하여 의사 색상 이미지를 생성합니다. 총 단백질 추출 및 면역 블로팅의 경우, 프토플라스트 용액에서 1밀리리터를 제거하고 나머지 1밀리리터를 섞는다. 이 프토플라스트 용액을 원심분리기 튜브와 원심분리기46gs로 4분간 전송합니다.원심분리를 완료한 후 상체를 제거하고 80마이크로리터의 디나처레이션 버퍼를 추가합니다. 소용돌이는 5초 동안 활발하게 합니다. XDS 샘플 버퍼 5개에 넣고 잘 섞고 10분간 끓여 자연을 제거합니다.표준 STS 페이지와 항GFP 항체를 가진 면역 블로팅으로 진행하십시오. RbcS 및 TGFT는 GFP에 융합된 이동 펩티드를 함유하는 RBCS의 79말단 말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 융합 구조로, 플로레스션 현미경 검사법과 면역블로팅에 의해 엽록소로 단백질의 수입을 연구하는 데 사용되었다. 플로레시언 현미경검사법에 의해 검사될 때, 대상 단백질의 녹색 형광 신호는 엽록소 자동 동체로부터의 적색 형광 신호와 병합되어 단백질이 엽록소로 수입함을 나타냅니다.총 단백질을 분리한 후 면역블롯에서 두 개의 단백질 밴드가 관찰되어 단백질이 엽록소로 적절히 수입되었다는 것을 보여줍니다. 상부 대역은 엽록소로 가져온 후 처리된 형태에 전체 길이 전구체 및 하부 대역에 해당한다. 단백질의 가공된 형태의 양은 시간에 따라 증가하여 단백질이 엽록소로 수입된다는 것을 시사합니다.이 발달에서, 이 기술은 세포 생물학의 필드에 있는 연구원이 아라비도시스에 있는 단백질 피곤또는 막 스레드 따기를 탐구하는 도로를 포장했습니다.

studying-protein-import-into-chloroplasts-using-protoplasts

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

여기에서 우리는 스트레스 고립 된 엽록체로 단백질 가져 오기를 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 상기 방법은 신속하고 간단하고 엽록체 단백질 가져올 다른 스트레스 조건의 결과 및 대응하는 조절 메커니즘을 연구에 적용 할 수있다.

스트레스 식물에서 분리 된 엽록체로 단백질 가져 오기의 분석

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

여기 선물이 엽록체의 정화에 대 한 검증 및 테스트 프로토콜 가져오기 단백질 복합물 (복잡 한 TIC TOC) 탭-태그를 사용 하 여. 1 단계 선호도 격리 프로토콜 잠재적으로 어떤 단백질에 적용 될 수 있습니다 그리고 질량 분석에 의해 새로운 상호 파트너를 식별 하는 데.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

여기, 우리 애기 잎 (봉투, 기질, 그리고 thylakoids), 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 그대로 엽록체를 정화 하는 방법을 설명 차동 centrifugations, 연속 Percoll 기울기의 조합을 사용 하 고 불연속 자당 기온 변화도입니다. 메서드는 subplastidial 및 immunoblotting과 proteomics에 의해 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 귀중 한.

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다.  따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.

골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

여기 우리는 혐 기성 단백질 정화, 혐 기성 단백질 농도, 그리고 산소 전극 시스템을 사용 하 여 후속 운동 특성에 대 한 프로토콜을 제시. DesB, 더 안정적이 고 적극적인 정화 하 고 혐 기성 환경에서 저장 한 dioxygenase 효소 효소를 사용 하 여 메서드를 보여 줍니다.

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

배우세요 PEG 매개 변환법을 이용한 프로토플라스트 단백질 발현 및 엽록체로의 단백질 수입 과정 연구 방법입니다. 이 기술은 생체 내 조건에서 단백질 역학을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

더 많은 동영상 탐색