Name: 체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 건조 필름법을 이용한 양이온성 나노리포솜 제조 방법으로 체외 전사된 mRNA를 효율적으로 세포에 전달하고 단백질 발현을 증가시키는 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. 양이온 Nanoliposomes (그림 1)의 생성
<ol><li>DC-콜레스테롤 (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] 콜레스테롤 염)과 마약 (dioleoyl phosphatidylethanolamine), 25 mg/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 클로 프롬에 분말으로 전달 지질을 분해. 참고:-20 ° c.에 녹은 지질 저장</li>
	<li>25 mg/mL 두 지질 재고 솔루션 사용. 녹은 DC-콜레스테롤과 유리 플라스 크에 녹아 마약의 80 µ L의 믹스 40 µ L. 참고: 총 지질 금액은 3 mg 이다. 클로 프롬의 빠른 증발을 방지 하려면 pipetting 동안 얼음에 지질을 놓습니다.</li>
	<li>아르곤 가스 흐름에서 15 분에 대 한 클로 프롬을 기체 화할. 그 후, a desiccator 실리 카 젤, 내부, 오픈 유리 플라스 크를 배치를 하룻밤 진공 나머지 클로 프롬, 증발 및 지질 영화 유리 플라스 크 안에 형성 되도록 적용. 참고: 빠른 작업과 불필요 한 O2 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>Nuclease 무료 물과 소용돌이 15 분 (그림 2A)에 대 한 서 스 펜 션의 1 mL와 함께 형성된 된 지질 영화 리하이드레이션 그 후, 1 h (그림 2B)에 대 한 쥡니다 목욕으로 정지를 놓습니다. 참고: 중단 약간 흐린 것입니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 미니 압출 조립, 주사기 지질 중단와 압출 기의 양쪽에 채워진된 주사기와 빈 주사기를 놓습니다. X-서 스 펜 션 (그림 2C)을 돌출 하려면 25 x 20 다른 한 주사기에서 막 통해 지질 정지를 누릅니다. 참고:는 NLps의 크기는 사용 하는 막의 기 공 크기에 의해 결정 됩니다.</li>
	<li>추가 사용 때까지 4 ° C에서 유리 플라스 크에는 NLps를 저장 합니다. 참고: 장기간된 보관 시간 후는 NLps 두어야 한다 다시 15 분 동안 쥡니다 목욕에 35 kHz 복잡 한 형성을 우회 하 여.</li>
</ol>2. 생체 외에서 합성 mRNA의 전사
<ol><li>EGFP 인코딩 준비 mRNA는 프로토콜에 따라 출판 이전34.</li>
	<li>앞으로의 0.7 µ M와 플라스 미드에서 eGFP 시퀀스를 증폭 (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3')와 역 (5'-T120 CTT CTT 법 CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') 뇌관과는 중 합 효소는 PCR와 키트.<ol>
<li>20 µ L 중 합 효소 키트에서 5 배 혼합의 뿐만 아니라 DNA (자료 테이블)의 녹는 동작을 변경 하는 상업 버퍼 솔루션의 20 µ L를 혼합. 각 (정방향 및 역방향) 뇌관의 7 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>추가 25 중 합 효소 키트에서 혼합물을 중 합 효소의 2 µ L eGFP 플라스 미드의 ng. 참고: 솔루션에 pipetting 전에 얼음에 중 합 효소를 유지.</li>
		<li>추가 nuclease 무료 H2O 100 µ L의 볼륨까지 혼합물에.</li>
		<li>표1에서 프로토콜을 따르고 thermocycler에서 PCR 주기를 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 정화 키트 eGFP 인코딩 DNA 시퀀스를 정화.<ol>
<li>따라서, 바인딩 버퍼 키트에서 500 µ L를 PCR 솔루션을 혼합 하 고 정화 열을 채우기 위해 그것을 사용 하 여.</li>
		<li>1 분 동안 최대 속도로 열을 원심 고는 여과 액을 버리고.</li>
		<li>워시 버퍼 나 열, 최대에 다시 원심 분리기에 1 분 동안 속도 삭제는 filtrate의 750 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>원심 분리기 단계 1 x 열 필터에서 버퍼를 제거를 반복 합니다.</li>
		<li>신선한 1.5 mL 튜브에 열을 전송.</li>
		<li>20 µ L nuclease 무료 H의 추가 열에2O 1 분 및 최대 속도에서 1 분 동안 원심 분리기에 품 어. 이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>Photometer와 DNA의 농도 측정 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
		<li>젤 전기 이동 법을 사용 하 여 DNA 품질 분석을 수행 합니다. 트리 스-Borate-EDTA (TBE) 버퍼에 agarose의 0.5 g을 추가 하 고 열 고 열에 전자 레인지에는 agarose는 완전히 녹아 때까지.</li>
		<li>액체 agarose 젤 얼룩이 솔루션의 5 µ L 추가, 솔루션 젤 실로 젤 생산 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>염료와 채워 12 µ L. 최종 볼륨까지 젤 우물에 DNA 샘플으로 DNA 사다리를 플라스틱 100 V에 1 시간에 대 한 전기를 실행 로드 x 6의 2 µ L로 DNA의 믹스 200 ng</li>
		<li>젤 아래 자외선 젤 분석 역을 사용 하 여 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>녹음 방송 생체 외에서 생체 외에서 전사 키트 포함 T7 중 합 효소 DNA 순서에서 mRNA를 생성 하 실행 하 고 대체 Ψ UTP와 메 틸 CTP UTP와 CTP의 수정 된 뉴클레오티드.<ol>
<li>생체 외에서 전사에 대 한 다음 표 2재료를 섞는다. 참고: 대체 1.5 µ L 1시 10분으로 메 틸 CTP의 Cy3 CTP nuclease 무료 H에 희석 eGFP 생체 외에서 녹음 하는 동안2O mRNA는 mRNA의 Cy3 라벨을 달성 하기 위해.</li>
		<li>37 ° c.에 4 h IVT 반응 혼합을 품 어</li>
		<li>추가 1 µ L DNase의 T7 중 합 효소에서 내가 키트 및 DNA 템플렛 소화 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정화는 mRNA, RNA 청소 키트를 사용 합니다.<ol>
<li>IVT 믹스 nuclease 무료 h 100 µ L의 볼륨을 채워2o.</li>
		<li>아래로 pipetting으로 350 µ L의 세포의 용 해 버퍼와 믹스를 추가 합니다.</li>
		<li>100% 에탄올의 250 µ L을 추가 하 고 다시 혼합. 정리 열으로 혼합 플라스틱</li>
		<li>원심 분리기 15 g 및 삭제는 filtrate x 8000에서 s.</li>
		<li>열, 15에 대 한 다시 원심 분리기에 세척 버퍼의 500 µ L를 추가 8000 x g및 제거는 filtrate에 s.</li>
		<li>1 열 워시 워시 버퍼 및 8000 x g2 분에 대 한 원심 분리기의 500 µ L x.</li>
		<li>신선한 1.5 mL 반응 관에 열을 이동 합니다. 2 mRNA elute nuclease 없는 H의 20 µ L의 1 분 외피에 의해 x2O 열 막에 최대 속도에서 1 분 원심 분리 하 여 다음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dephosphorylation 키트를 사용 하 여 mRNA에서 인산 염 그룹을 제거 합니다. 4.5 µ L 10 x 인산 가수분해 효소 버퍼의와 인산 가수분해 효소의 1 µ L는 mRNA를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>정화는 mRNA 다시 다음 단계 2.5.1-2.5.7.</li>
	<li>Photometer와 mRNA concertation를 측정 합니다.</li>
	<li>젤 전기 이동 법을 사용 하 여 순도 분석 하는 mRNA의 크기. 따라서, 같이 2.3.9-2.3.10에 설명 된 대로 agarose 젤을 준비 합니다.<ol>
<li>혼합 3.3 µ L formamide, 37% 포름알데히드의 1 µ L, 남자, x 10의 1 µ L 200 염료 로드 x 6의 1.7 µ L의 mRNA의 ng nuclease 무료 H 10 µ L까지 채우는 각 샘플 및 RNA 마커2O.</li>
		<li>MRNA 변성 65 ° C에서 10 분 동안 혼합 품 어. MRNA와 RNA 마커 젤의 우물을 로드 하 고 100 V에 1 시간을 위한 젤을 실행.</li>
		<li>자외선과 젤 의사 역을 사용 하 여 젤 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 합성 mRNA의 complexation
<ol><li>얼음, 합성 mRNA를 녹여 소용돌이, 그리고 원심 분리기 튜브를 열기 직전.</li>
	<li>합성 mRNA의 믹스 10 µ L (mRNA 농도 100 ng / µ L) 1 µ L, 2.5 µ L, 5 µ L, 10 µ L, 또는 NLp 중지 20 µ L (NLp 집중력은 3 mg/mL). 짧게 원심 및 nanolipoplex 형성에 대 한 실 온 (RT)에서 20 분 동안 품 어. 참고: pipetting으로 혼합 하지 마십시오. 이 볼륨의 손실로 이어질 수 있습니다. 곧 철저 한 혼합에 대 한 소용돌이입니다.</li>
	<li>일반 셀 매체의 1 mL는 nanolipoplexes를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 그들을 혼합.</li>
</ol>4. Nanoliposomes의 캡슐화 효율의 분석
<ol><li>RNA 정량화 키트를 사용 하 여 캡슐화 실험을 수행.</li>
	<li>높은 범위에 대 한 형광 염료 1: 200와 낮은 범위 분석 결과 대 한 1:2,000를 diluting 하 여 작업 솔루션을 준비 합니다. 참고: 얼음에 형광 염료를 녹여. 사용 하기 전에 직접 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>높은 범위와 낮은 범위 표준 곡선의 eGFP 2 µ g/mL 재고 솔루션의 1 mL를 사용 하 여 준비 mRNA nuclease 무료 h에서2o. 참고: 표준 곡선에 대 한 사용 하 여 캡슐화 실험에 사용 될 mRNA.</li>
	<li>표 3 를 사용 하 여 높은 범위 표준 (20 ng/mL-1 µ g/mL)의 준비에 대 한.</li>
	<li>낮은 범위 표준 희석 2 µ g/mL eGFP mRNA 재고 솔루션 1:20 100 ng/mL의 최종 농도 달성 하기 위해. 표 4에 설명 된 대로 낮은 범위 표준 (1 ng/mL-50 ng/mL)를 준비 합니다.</li>
	<li>1 µ g의 eGFP 결합 mRNA (10 µ L) 및 NLps의 7.5 µ g (2.5 µ L) 및 실시간에 20 분 동안 품 어 참고: 계속을 저하를 피하기 위해 얼음에 mRNA.</li>
	<li>Nuclease 없는 H의 1 mL을 추가 양식 nanolipoplexes을 위아래로 pipetting으로 믹스2O.</li>
	<li>캡슐화 된 샘플을 표준 1: 200 또는 1:2,000 RNA 형광 염료 작업 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>표준 및 샘플 중복에 검은 96 잘 접시에 플라스틱 및 530에서 형광 측정 microplate 리더 (그림 3) nm.</li>
</ol>5입니다. 세포 Transfection에 대 한 준비
<ol><li>플레이트 1.5 x 105 A549 세포/12-잘 접시 transfection 이전 1 d의 잘.</li>
	<li>Transfection 전에 24 h에 대 한 일반 셀 매체 (DMEM/높은 포도 당 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS], 2 m m L-글루타민, 1% 페니실린/스와 함께)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 품 어.</li>
</ol>6입니다. 세포의 transfection
<ol><li>준비는 세척 세포를 1 mL/잘 PBS 1 x (Ca 없이2 +Mg2 +).</li>
	<li>1 µ g의 eGFP mRNA 캡슐 1 µ L, 2.5 µ L, 5 µ L, 10-µ L, 또는 20 µ L NLps A549 세포와 준비 된 접시의 한 우물을 포함 하는 준비 nanolipoplex 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>Nanolipoplex 현 탁 액 셀에 추가 하 고 일반 조건 transfection 효능을 분석 하는 24 시간 또는 24 시간 및 transfection 후 세포 생존 능력 분석을 72 h에 품 어. 참고: Transfection NLps와 중간 변화를 필요 하지 않습니다.</li>
</ol>7. 세포 Transfection 효능 Cytometry 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석
<ol><li>제거는 상쾌한 1 mL로 세포 세척/나머지 NLps 제거 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) PBS를 잘.</li>
	<li>Cytometry에 대 한 셀을 준비 합니다.<ol>
<li>Trypsinize 500 µ L/잘 트립 신/EDTA (0.05%) 3 분 중지에 대 한 37 ° C에를 가진 세포는 과정 하 고 일반 FBS 포함 된 매체의 동일한 금액 (500 µ L/잘)을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화.</li>
		<li>400 x g 에 5 분에 대 한 셀을 원심 고 셀 펠 릿을 건드리지 않고는 상쾌한을 조심 스럽게 제거.</li>
		<li>1 mL의 PBS로 세포 세척 (Ca 없이2 +Mg2 +).</li>
		<li>Resuspend 1 x 고정 솔루션의 300 µ L에서 세포 고 흐름 cytometry 튜브로 셀을 전송.</li>
		<li>488에서 세포 분석 흐름 cytometer (그림 4A)에 nm. 참고: 소용돌이 측정 하기 전에 직접 x 1 셀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 현미경 검사 법에 대 한 셀을 준비 합니다.<ol>
<li>1 mL/음 100% 메탄올,-20 ° c.에 이전에 저장 된 셀 수정</li>
		<li>추가 500 µ L/잘 300 nM DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) PBS에 녹이 고 어둠 속에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>DAPI 솔루션을 제거 하 고 다시 100% 메탄올-20 ° c.에 저장 된 셀 세척</li>
		<li>형광 현미경 (그림 4B)를 사용 하 여 셀을 분석 합니다. 참고: 사용 하 여 다음 여기/방출 파장: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461, 및 Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 세포 생존 능력 분석 실험
<ol><li>(페 놀 레드) 없이 RPMI의 1 mL에 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드)의 5 mg을 디졸브. 참고: 녹은 MTT 해야 더 희석된 1시 10분 (최종 농도: 0.5 mg/mL) 사용 하기 전에 RPMI에.</li>
	<li>씻어 transfected 세포 3 x 1 mL/잘 PBS (Ca2 +/Mg2) 없이. 참고: 일반 셀 매체의 수 완전히 제거 한다.</li>
	<li>추가 1시 10분의 500 µ L/잘 셀에 MTT 솔루션을 희석 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어</li>
	<li>부 화 후 셀에서 MTT 솔루션을 제거 하 고 추가 500 µ L/잘 DMSO (디 메 틸 sulfoxide). 37 ° c.에서 10 분 동안 다시 품 어</li>
	<li>세 쌍둥이에서 DMSO 솔루션 클리어 아래 96 잘 접시에 플라스틱 및 540에 흡착 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	<li>100% 치료 세포의 생존 능력을 설정 하 고 치료 제어 셀 (그림 5)에 비해 다른 그룹의 세포 생존 능력 계산.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

제시 프로토콜 종합적 수정된 mRNA에 대 한 높은 캡슐화 효능 NLps의 세대 뿐만 아니라 세포에 생체 외에서의 신뢰할 수 있는 transfection에 설명합니다. 또한,는 NLps 차례로 셀 내부 기능적인 단백질으로 번역은 mRNA의 출시를 보장 합니다. 또한, NLps를 사용 하 여 transfections 일반 세포 매체에서 수행할 수 있습니다, 그리고 높은 결과 viabilities 동안 transfection, 세포 transfection 후 최대 3 일.
MRNA는 치료로 사용 하려면 자동 조립 시스템의 배달에 대 한 선호 이다. 가장 일반적인 transfection 시 약 양이온 지질, 리 등이 포함 됩니다. 로 리는 긍정적으로 충전, 부정적으로 위탁 된 핵 산 수 캡슐화 될, 그들의 세포 막 극복된35수의 정전기 반발 작용을 하므로. 양이온 지질 DC-콜레스테롤은 이미 이전 연구에서 설명 안정적이 고 생...

치료 응용 프로그램에 대 한 수정 된 mRNA의 사용은 지난 몇 년 동안에에서 큰 잠재력을 보이고 있다. 심장 혈관, 염증, 그리고 monogenetic 질병에서 뿐만 아니라 백신 개발에, mRNA는 유망한 치료 에이전트1.
MRNA와 단백질 대체 요법 대상 셀2에 DNA transfection에 따라 고아 한 유전자 치료를 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. MRNA 함수는 cytosol에서 직접 시작합니다. 비록 플라스 미드 DNA (pDNA), 더블-좌초의 구조, 원형 발기인 지역과 치료 단백질3을 또한 행위 cytosol, 인코딩 유전자 시퀀스를 포함 하는 DNA 그것만 통합 될 수 있다 유사 분열을 겪고 있는 셀에 transfection의 때. 이 조직1,4transfected 세포의 수를 줄입니다. 특히, 심장 세포, 등 약한 유사 분열 활동 조직의 transfection 어려운5입니다. PDNA, 달리 transfection 그리고 mRNA의 번역 조직1,6에 mitotic 그리고 비 mitotic 세포에서 발생합니다. 변이 원 성 영향 또는 면역 반응7,8, 하지만 원하는 단백질의 de novo 종합 단백질 인코딩 mRNA와 세포의 transfection 후 호스트 게놈 DNA의 바이러스 성 통합 올 수 있습니다. 9,10자율적으로 시작합니다. 또한, 단백질 합성 게놈을 방해 하 고 변이 원 성 영향11위험 없이 개별 복용량을 통해 환자의 필요를 정확 하 게 조정할 수 있습니다. 합성으로 생성 된 mRNA의 면역 활성화 잠재력 의사 uridine 및 5'-methylcytidine uridine 및 cytidine12대신 사용 하 여 극적으로 낮아질 수 있습니다. 의사 uridine 수정된 mRNA 또한 증가 생물학적 안정성과 상당히 높은 변환 용량13을 보였다.
mRNA 기반 치료 임상 응용에 유망한 속성에서 이익을 얻을 수 있을, 하 셀으로 mRNA의 전송에 대 한 적합 한 차량을 만들 필수적 이다. 이 차량은 한다 곰 비 독성 속성에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, 보호 nuclease 저하에 대 한 mRNA 하 고 장기간된 가용성 및14mRNA 번역에 대 한 충분 한 세포질 통풍 관을 제공.
Vivo에서 약물 전달, 탄소 나노튜브, 양자 점, 등 리에 대 한 모든 가능한 캐리어 종류 중에서 후자 되었습니다 공부 가장15,16. 리는 지질 bilayer10구성 된 소포. 그들은 amphiphilic는 소수 성 및 친수성 섹션, 그리고 이러한 분자의 자기 배열을 통해 구형 더블 레이어는 형성된17. 리, 내부 치료 대리인 또는 마약 수 캡슐화 되며, 따라서, 효소 저하18에서 보호. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 염화 (DOTMA)19를 포함 하는 리 [1, 2-비스 (oleoyloxy)-3-프로 판 (trimethylammonio)] (DOTAP)20및 dioctadecylamidoglycylspermine (개)21또는 DC-콜레스테롤22, 잘 특징 및 DNA 또는 RNA 세포 transfection에 자주 사용.
양이온 리 충전 된 지질과 충전된 인지질23구성. 양이온 리 통해 transfection 셀24,25으로 핵 산의 수송을 위한 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 양이온 지질 입자 핵 산 분자26의 등뼈에 마이너스로 충전 된 인산 염 그룹으로 복합물을 형성 한다. 이러한 소위 lipoplexes 세포 막의 표면에 부착 하 고 endocytosis 또는 endocytosis 같은 메커니즘27셀을 입력 합니다.
1989 년에 말론 외. 성공적으로 양이온 지질 중재 mRNA transfection28설명. 그러나, 그룹 DOTMA 각 세포 독성 효과28성 발견 혼합물의 DOTMA 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (마약)를 사용 하 여. 또한, Zohra 외 보여주었다 DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-프로 판 염화) mRNA transfection 시 약29으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포의 효율적인 transfection에 대 한 DOTAP는 다른 시 약, fibronectin29 등 마약30와 함께에서 사용 해야 합니다. 지금까지, DOTMA 유전자 배달31사용 시장에 첫 번째 양이온 지질 이었다. 다른 지질 치료 운반대로 사용 또는 임상 시험의 다른 단계에서 테스트 되 고 있습니다 (예를 들어, EndoTAG-나 지질 운반대로 DOTAP를 포함)는 현재 단계 II 임상 시험32에서 조사 되 고.
이 작품에서는 NLps DC 콜레스테롤 및 마약의 세대에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 실행 하기 쉬운 이며 다양 한 크기의 NLps 생성 수 있습니다. 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 NLp의 일반적인 목표는 mRNA complexation, 따라서 효율적이 고 생체 세포 transfection 생체 외에서14,33를 허용에 대 한 리를 만드는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td><td>AppliChem, 다름슈타트, 독일</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&prime;,N&prime;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan 시스템</td><td>BD Biosciences, 하이델베르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxid (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)</td><td>Avanti, 앨라배마, 미국</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini extruder</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Ribo Green RNA 시약 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 다름슈타트</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (페놀 레드 제외)</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일 다름슈타트</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>실리카겔</td><td>Carl Roth, 독일 칼스루에</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td><td>Qiagen, 독일 힐덴</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td> Pseudouridine-5'-Triphosphate (&Psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3-CTP</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Germany</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 캡 구조 아날로그</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>남극 포스파타제</td><td>새 제품 England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agarose Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, USA</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD DNA ladder mix</td><td>VWR, Pennsylvania, USA</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td><td>Fisher Scientific, G&ouml; 테보그, 스웨덴</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 nanoliposomes의 세대 문자 메신저 rna

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

메신저 RNA (mRNA)의 개발-기반 치료제 다양 한 질병의 치료에 긍정적인 때문에 점점 더 중요 한 된다 생체 외에서 의 속성 (IVT) mRNA를 베 꼈 다. IVT mRNA의 도움으로, 원하는 단백질의 de novo 종합 목표 셀의 생리 적 상태를 변경 하지 않고 유도 될 수 있다. 또한, 단백질 생 합성 IVT mRNA의 일시적 효과의 한 정확 하 게 제어할 수 있습니다.
셀의 효율적인 transfection nanoliposomes (NLps) 치료 mRNA에 대 한 안전 하 고 효율적인 배달 차량을 나타낼 수 있습니다. 이 연구는 IVT mRNA에 대 한 배달 벡터로 안전 하 고 효율적인 양이온 NLps DC 콜레스테롤 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 구성 (마약)을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다. NLps를 정의 하는 데 크기, 균일 분포, 그리고 높은 complexation 용량, 그리고 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 생성 될 수 있다. 또한, 우리가 다른 테스트 시스템의 complexation 분석을 제시 하 고 합성을 사용 하 여 transfection 신진대사 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) mRNA, 뿐만 아니라 세포 생존 능력에 미치는 영향. 전반적으로, 제시 프로토콜 mRNA complexation 하 고 치료 mRNA의 관리를 향상 시킬 수 있습니다에 대 한 효과적이 고 안전한 접근을 제공 합니다.

설명 된 대로 프로토콜을 사용 하 여, DC-콜레스테롤과 마약 지질 구성 된 NLps 드라이 필름 방법 (그림 1)를 사용 하 여 준비 되었다. 준비를 하는 동안 nanoliposome 솔루션 탁 (그림 2)에서 다른 단계를 보여 줍니다.
NLps의 캡슐화 효능 다음 mRNA, 캡슐화 되지는 RNA 정량화 키트 (그림 3)를 사용 하 여 무료 금액을 분석 하 여 eGFP 인코딩 mRNA의 1 µ g의 캡슐 후 분석할 수 있습니다.
EGFP NLps, 형성된 nanolipoplexes 서로 다른 양의...

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

이 프로토콜은 치료 메신저 RNA에 대한 경피 차량으로 사용될 수있는 안전하고 효율적인 나노 리포솜의 생산을 허용합니다. 이러한 nanoliposomes 세포 생존에 영향을 주지 않고 증가 된 단백질 발현 수준을 초래 하는 세포에서 mRNA 섭취를 촉진. 이 기술의 주요 장점은 정의된 크기와 균일한 분포를 가진 안정적인 나노 리포솜의 빠르고 쉬운 생성입니다.더욱이, 그들은 분해에서 캡슐화된 mRNA를 보호하고 장기간 번역으로 이끌어 내도록 유도합니다. 절차를 시연하는 것은 해부학 링크, 우리의 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 지질, DC 콜레스테롤 및 DOPE에 대한 재고 솔루션을 클로로폼으로 용해하여 밀리리터 당 25 밀리그램의 최종 농도로 용해하십시오.용존 DC 콜레스테롤의 40 마이크로리터를 유리 플라스크에 용존 DOPE의 80 마이크로리터와 혼합합니다. 아르곤 가스 흐름하에서 15분 동안 클로로폼을 증발시다. 다음으로, 실리카 젤로 건조기충전을 채웁니다.열린 유리 플라스크를 내부에 놓고 진공을 하룻밤 동안 적용하여 남은 클로로폼이 증발되도록 합니다. 결과 지질 필름은 유리 플라스크 내부에 형성됩니다. 다음 날, 지질 필름을 수화하기 위해 뉴클레아제 프리 워터 1 밀리리터를 추가합니다.그리고 15 분 동안 서스펜션을 소용돌이. 서스펜션을 초음파 욕조에 1 시간 동안 놓습니다. 이 후 제조업체의 지침에 따라 미니 압출기를 조립합니다.액체 현탁액으로 주사기를 채우고 압출기의 한쪽을 놓습니다. 다른 쪽에 빈 주사기를 놓습니다. 한 주사기에서 다른 주사기로 멤브레인을 통해 지질 현탁액을 약 20-25회 눌러 현탁액을 제거합니다.그런 다음 나노 리포솜을 사용 준비가 될 때까지 섭씨 4도에 유리 플라스크에 보관하십시오. 첫째, 얼음에 합성 mRNA를 해동. 얼어 붙은 mRNA를 소용돌이시키고 튜브를 열기 직전에 원심분리기.그런 다음 합성 mRNA의 마이크로그램 1개를 다양한 양의 나노리포솜 현탁액과 혼합합니다. 원심분리기는 나노리포플렉스 형성을 위해 실온에서 20분 동안 잠깐 배양합니다. 그런 다음, 나노 리포플렉스에 일반 세포 매체의 밀리리터를 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.감염되기 하루 전에 세포를 준비합니다. 따라서, 플레이트 150, 000 A549 세포는 12웰 플레이트의 각 웰내로 전환되기 하루 전에. 24시간 동안 5%의 이산화탄소와 일반 세포 배지로 37도에서 세포를 배양합니다.그런 다음 다음 날, 준비된 세포의 각 우물을 PBS 의 1 밀리리터로 한 번 씻으시다. A549 세포를 함유하는 우물 중 하나에 준비된 나노리포플렉스 혼합물1밀리리터를 넣습니다. 24시간 동안 일반 조건에서 배양하여 형질 전환 효율을 분석하거나 24-72시간 동안 배양후 세포 생존가능성을 분석한다.상체를 제거하고 나머지 나노 리포솜을 제거하기 위해 PBS의 1 밀리리터로 각각 잘 씻으라. 세포측정을 위해 세포를 준비하려면 먼저 500마이크로리터의 트립신 EDTA를 각 우물에 추가하고 37도에서 세포를 트립시네이션하는 배양합니다. 다음으로, 일반 FBS 함유 매체500마이크로리터를 추가하여 공정을 중지하고 트립신을 비활성화합니다.세포를 400배 G로 5분간 원심분리합니다. 그리고 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으시다.그런 다음 세포 고정 용액의 300 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 유동 세포 측정 튜브로 옮김 튜브로 옮김합니다. 488 나노미터에서 세포를 분석하기 위해 유동 세포계를 사용합니다. 형광 현미경 검사법을 위해 세포를 준비하려면, 세포를 고치기 위하여 각 우물에 차가운 메탄올의 1 밀리리터를 추가합니다.PBS에 용해된 300나노몰러 용액의 500마이크로리터를 각각 양정에 추가합니다. 어둠 속에서 5분간 배양하세요. 그 후 DAPI 용액을 제거하고 이전에 섭씨 영하 20도에 저장되었던 100% 메탄올로 세포를 다시 세척합니다.여기에 표시된 여기를 이용한 발광 및 방출 파장을 사용하여 세포를 분석하기 위해 형광 현미경을 사용한다. 이 연구에서, 나노 리포솜은 합성 변형 된 mRNA에 대한 높은 캡슐화 효능으로 생성됩니다. RNA 정량화 키트를 사용하여, 나노리포좀의 캡슐화 효능은 캡슐화되지 않은 mRNA의 자유로운 양을 분석하여 mRNA를 인코딩하는 1마이크로그램의 캡슐화 후에 분석될 수 있다.상이한 양의 나노리포좀에서 EGFP mRNA를 캡슐화한 후, 형성된 나노리포플렉스는 체외세포와 함께 배양될 수 있으며 eGFP 발현 세포의 백분율은 24시간 유동 세포측정을 사용하여 분석될 수 있다. 여기에서 볼 수 있듯이, 나노 리포좀용의 마이크로리터 1개조차도 세포 내외의 높은 배분을 달성하기에 충분합니다. 세포가 Cy3 표지 eGFP mRNA를 포함하는 나노리포좀으로 전감염될 때, 세포질에서 eGFP mRNA의 존재뿐만 아니라 이미 생산된 eGFP 단백질이 시각화될 수 있다.nanolipoplexes를 사용하여 세포의 이식은 세포에 불리한 효력이 있을 수 있기 때문에, 세포의 생존은 24 시간 및 72 시간 후에 시험되었습니다 후에 변환 후에 시험되었습니다. 세포가 나노리포플렉스의 2.5 또는 5마이크로리터로 치료될 때 세포 생존가능성에 미치는 영향은 검출될 수 없었다. 이 절차를 시도할 때, 이 나노 liposome 안정성을 해칠 수 있기 때문에 항상 에탄올없는 환경에서 일하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.DC 콜레스테롤을 DOPE와 준비하고 혼합하는 동안, 당신은 플라스틱 파이펫 팁의 용해 성분용 지질의 오염을 방지하기 위해 유리 파이펫을 사용해야합니다. 이 프로토콜에 따라, 생성된 나노리포솜은 준비 중 또는 이후에 쉽게 조작될 수 있다. 예를 들면, PEG 분자 또는 특정 항체의 통합은 증가한 안정성으로 이끌어 내거나 활성 조직 표적을 시작할 것입니다.생성된 나노리포솜은 필요한 안전 측면을 충족시키고 표적 세포에 대한 mRNA 섭취를 용이하게 한다. 특정 치료 nRNA로 복합적인 Nanoliposomes는 예를 들어 조직 공학 또는 대체 요법 분야에서 새로운 mRNA 기반 치료법의 개발에 필수적인 기여를 할 수 있다.

generation-cationic-nanoliposomes-for-efficient-delivery-vitro

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다.  siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

미세유체계 지질나노입자(LNP) 생산 방법은 RNA 전달을 포함한 약물 전달 시스템(DDSs)에서 주목받고 있다. 이 프로토콜은 iLiNP라는 이름의 당사의 원래 미세 유체 장치를 사용하여 제조, LNP(siRNA 로드 LNP) 생산 및 LNP 평가 프로세스를 설명합니다.

미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp)는 미세유체 혼합 장치를 사용하여 개발 되어 시험관 내 전사된 메신저 RNA를 캡슐화하고 전달합니다. 기술된 mRNA/PP-sNip는 배양된 세포를 시험관내에서 효율적으로 형질감염시킬 수 있었다.

펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염

여기에서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)를 제형화하기 위한 프로토콜이 제시된다. 이 LNP는 HepG2 세포의 in vitro 및 C57BL/6 마우스의 in vivo 에서 효능을 테스트했습니다.

미세유체 혼합으로 제조된 mRNA-지질 나노입자의 In vitro 및 In vivo 효율 테스트

2제트 CIJ 및 4제트 다중 입구 와류 믹서(μMIVM)를 포함한 CIJ(Confined Impact Jet) 믹서 기술을 사용하여 지질 나노입자(LNP)를 합성하기 위한 자세한 프로토콜이 시연됩니다. CIJ 믹서는 재현 가능한 난류 마이크로 혼합 환경을 생성하여 단분산 LNP를 생산합니다.

Synthesisizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impact Jet Mixers(밀폐 충돌 제트 믹서에서 난류에 의한 지질 나노입자 합성)

배우세요 건조 필름법을 이용한 양이온성 나노리포솜 제조 방법으로 체외 전사된 mRNA를 효율적으로 세포에 전달하고 단백질 발현을 증가시키는 기술입니다.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

더 많은 동영상 탐색